Quantificare la colonizzazione di Vibrio cholerae e diarrea nel modello Zebrafish adulto

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del vibrio cholerae, come ad esempio come il vibrio cholerae colonizza la Quiet Coast e compete con il microbiota intestinale per stabilire una nicchia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i pesci sono un ospite naturale del vibrio cholerae, quindi possiamo studiare l'intero ciclo di vita del vibrio cholerae. A dimostrare la procedura saranno Dhrubajyoti Nag, un postdoc del mio laboratorio e Paul Breen, un dottorando del mio laboratorio.

Dopo aver preparato le colture di V.cholerae, inoculare il pesce zebra per immersione. Per prima cosa, metti quattro o cinque pesci zebra in un becher da 400 millilitri contenente 200 millilitri di acqua sterile per le infezioni. Quindi aggiungere un millilitro di coltura di V.cholerae per la concentrazione di infezione desiderata.

Quindi, coprire il bicchiere con un coperchio forato. Dopo aver preparato tutti i becher, trasferirli in un'incubatrice frontale in vetro impostata a 28 gradi Celsius Per un'esposizione transitoria, dopo circa sei ore, versare l'acqua del becher attraverso una rete da pesca per raccogliere il pesce. L'acqua infetta deve essere smaltita in candeggina per uccidere i batteri.

Quindi, metti il pesce in 200 millilitri di acqua sterile per l'infezione per cinque minuti. Dopo cinque minuti, fai scorrere quest'acqua attraverso una rete da pesca, gettando l'acqua nella candeggina. Ora, i pesci possono entrare in un nuovo becher pulito con 200 millilitri di acqua sterile per le infezioni.

Quando l'esperimento ha raggiunto l'endpoint desiderato, prelevare un campione di 15 millilitri dell'acqua di infezione a scopo diagnostico. Quindi raccogli i pesci e smaltisci l'acqua infetta in modo appropriato. Orientare il lato ventrale verso l'alto e fissare il corpo con uno spillo attraverso la mascella inferiore e un altro perno appena dietro l'ano.

Inclinare entrambi i perni lontano dal corpo. Quindi, pulire la superficie ventrale del pesce con etanolo al 70%. Quindi, sterilizza un bisturi e le forbici Vannas usando etanolo al 70% e una fiamma.

Ora, usando il bisturi, fai una piccola incisione longitudinale nella pancia che penetra nelle squame, ma taglia solo in profondità quanto la pelle. Quindi, con le forbici, estendere con cura l'incisione lungo la lunghezza del corpo, tagliando non più in profondità del livello della pelle. Evita di tagliare l'ano.

Quindi eseguire due tagli laterali verso la testa per espandere l'apertura. Quindi, appuntare la pelle su ciascun lato delle incisioni laterali sulla superficie di dissezione, inclinando i perni verso l'esterno, lontano dal corpo. Il tratto intestinale dovrebbe ora essere visibile come un tubo molto sottile e pallido.

Ora, usa due paia di pinze sterilizzate a fiamma per rimuovere con cura l'intero tratto intestinale che può essere piuttosto fragile. Trasferire il tessuto in una provetta di ominizzazione contenente perle di vetro e un millilitro di tampone freddo. Successivamente, omogeneizzare i tessuti come descritto nel protocollo di testo e quantificare i livelli di colonizzazione intestinale.

Successivamente, effettuare diluizioni seriali dell'omogeneizzato intestinale e del tampone. Per ogni pesce, preparare cinque o sei diluizioni dieci volte in volumi di un millilitro. Agitare i tubi per la miscelazione.

Quindi, piastra da 100 a 200 microlitri di ciascuna diluizione su piastre di agar LB contenenti streptomicina e X-gal. Incubare le piastre a 30 gradi Celsius per 16-18 ore. Dopo l'incubazione notturna, contare le colonie di V. cholerae sulle piastre.

Questi batteri producono tipicamente colonie blu pallido su terreno LB con X-gal. Se si osservano diverse morfologie di colonie, applicare alcune colonie di ciascuna morfologia diversa su una diversa piastra TCBS. Su TCBS, V. cholerae produce grandi colonie gialle leggermente appiattite con centri opachi e periferie traslucide.

Per determinare i livelli di mucina nella diarrea dei pesci, eseguire un test su una piastra a 96 pozzetti. In triplice copia, caricare 100 microlitri di acqua di infezione per ogni condizione di test, incluso un bianco, nei pozzetti. Quindi, mescolare 50 microlitri di soluzione acida fresca periodica allo 0,1% in ogni pozzetto del test.

Utilizzare il pipettaggio per miscelare. Quindi, avvolgere strettamente la piastra nella plastica e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora o un'ora e mezza. Dopo l'incubazione, raffreddare la piastra a temperatura ambiente.

In ogni pozzetto, aggiungere 100 microlitri di soluzione di Fuchsin e mescolare con il pipettaggio. Ora, riavvolgi il piatto e mettilo su un bilanciere a temperatura ambiente. In circa 20 minuti, leggere la lastra a 560 nanometri utilizzando un lettore di piastre.

Quantificare la reazione causata dalla mucina in soluzione. Per misurare i livelli di proteine nella diarrea dei pesci, utilizzare il test Bradford. Mescolare 66 microlitri di uno degli standard BSA o 66 microlitri di acqua di infezione con 1.000 microlitri di reagente per il test Bradford in una cuvetta monouso.

Ora, incubare i campioni a temperatura ambiente per due minuti. E poi leggere l'assorbanza a 660 nanometri su uno spettrofotometro. Una semplice metrica per la quantità di diarrea è la torbidità nell'acqua misurata a 600 nanometri.

Mescolare bene l'acqua, aggiungere un millilitro a una cuvetta usa e getta e prendere una misurazione. Per una misurazione di base, in bianco, utilizzare un'acqua di infezione pulita. Possono essere misurati anche i batteri V.cholerae escreti.

Questo può essere fatto con pesci che sono stati spostati in acqua pulita dopo essere stati inoculati. Effettuare diluizioni seriali di un aliquat di acqua del serbatoio come descritto in precedenza. Quindi impiattare le diluizioni su terreni selettivi e incubare le piastre a 30 gradi Celsius per 24 ore.

Successivamente, contare le colonie come descritto in precedenza e quindi determinare il CFU. Gruppi di pesci zebra alloggiati in 200 millilitri d'acqua sono stati inoculati con cinque milioni di CFU di un colera pandemico. Dopo sei ore nell'acqua infestata dai batteri, i pesci si spostano in acqua pulita per 18 ore.

Gli intestini d'aria venivano poi raccolti. Ogni pesce ospitava circa 100.000-1.000.000 di cellule di V.cholerae. L'acqua di infezione è stata utilizzata per altri test.

I livelli di mucina erano più alti quando le dosi infettive erano più alte. L'OD600 dell'acqua era significativamente più alto quando i pesci erano infettati da V. cholerae. Infine, il livello totale di proteine nell'acqua dei pesci infetti era quasi il doppio di quello osservato nell'acqua dei pesci non infetti.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come infettare il pesce zebra adulto con il vibrio cholerae e quantificare la diarrea indotta dall'infezione. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come i test di trasmissione, per valutare l'infezione di pesci naïve da parte di pesci precedentemente infetti.