Name: Microscopia di fluorescenza di luce-foglio per lo studio del cuore murino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Impara la microscopia di fluorescenza a luce-foglio bilaterale per studiare il cuore murino con clearing ottico. Questa tecnica consente imaging rapido e osservazione dei cambiamenti strutturali post-terapia genica.

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Gli autori vorrebbero esprimere gratitudine a Thao Nguyen e Atsushi Nakano da UCLA per fornire il campione di topi all'immagine. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni NIH HL118650 (per Tzung K. Hsiai), HL083015 (per Tzung K. Hsiai), HD069305 (per N. C. Chi e Tzung K. Hsiai.), HL111437 (per Tzung K. Hsiai e N. C. Chi), HL129727 (per Tzung K. Hsiai) e University of Texas System Star finanziamenti (per match Lee).

Tutte le procedure che prevedono l'uso di animali sono state approvate da comitati di revisione istituzionale (IACUC) presso la University of California, Los Angeles, California.
1. imaging System Setup
Nota: Vedere Figura 1 e Figura 2.
<ol><li>Recuperare un laser ad onda continua (CW) con 3 lunghezze d'onda: 405 nm, 473 nm e 532 nm. Posto 2 specchi (M1 e M2) distanza di 150 mm e allinearli con i loro aerei di specchio a 45° alla trave. Nota: Questo passaggio viene eseguito per reindirizzare il laser lontano il setup di fronte-retro illuminazione. Il fascio risultante sarà nella stessa direzione del raggio iniziale.</li>
	<li>Passare il raggio attraverso un diametro di 25 mm diaframma/pinhole (PH), un filtro di densità neutra (NDF) di diametro 50 mm con una gamma di densità ottica pari a 0 - 4.0, un espansore del fascio (BE), una fessura di 30 mm (S) con la larghezza di ~ 0 - 6 mm e uno specchio (M3) , tutti posizionati 150 mm da altro. Posizionare lo specchio con il suo piano di specchiatura a 45° alla trave.</li>
	<li>Passare il raggio attraverso un divisore di fascio di 50: 50 a 150 mm dalla M3. Posizionare uno specchio (M6) 150 mm dal divisore di fascio e allinearlo in modo che il piano di specchiatura è a 45° per la trave che viene emesso in avanti. Utilizzare il fascio riflesso per formare un lato del foglio doppio-illuminazione luce.</li>
	<li>Posizionare uno specchio (M4) 150 mm dal divisore di fascio e allinearlo in modo che il piano di specchiatura è a 45° per la trave che è stata emessa ad un angolo di 90° dal divisore di fascio. Inserire un secondo specchio (M5) 150 mm dalla M4 e allinearlo affinché il piano di specchiatura è a 45° per il fascio riflettuto da M6. Utilizzare il fascio emesso dalla M5 per formare il secondo lato del foglio doppio-illuminazione luce.</li>
	<li>Impostare il sistema di illuminazione su due lati in modo simmetrico (Vedi Figura 1). Inserire una lente cilindrica (CL1) [Diametro (d) = 1; lunghezza focale (f) = 50 mm] 150 mm in linea con il fascio emesso dalla M5 su un lato e un altro identico lente cilindrica (CL2) 150 mm in linea con il fascio emesso dalla M6 sul lato opposto della setu dual-illuminazione p. Posizionare 2 specchi (M7 e M8) ogni in linea con le lenti cilindriche a distanza di 50 mm per riflettere il fascio a 90 °.</li>
	<li>Formare un doppietto acromatico da un paio di lenti. Posizionare il primo obiettivo, L1 (d = 1; f = 100 mm), 100 mm da M7 e la seconda lente, L2 (d = 1; f = 60 mm), 160 mm da L1. Ripetere che questo sul lato opposto del doppio-illuminazione con obiettivi identici (L3, L4) posizionato alla stessa distanza da M8.</li>
	<li>Posto specchi, M9 e M10, 60mm da lenti L2 e L4, rispettivamente e in linea con il fascio. Posizionare gli obiettivi di illuminazione, OL1 e OL2 (d = 2; f = 150 mm), 150 mm da M9 e M10 e in linea con il fascio. Il fascio emesso dagli obiettivi forma il foglio leggero per i campioni di imaging.</li>
	<li>Utilizzare una stampante 3D per stampare il portacampioni da acrilonitrile butadiene stirene (ABS). Incorporare un pezzo di vetro di copertura [indice di rifrazione (RI) = 1.4745] su ogni lato della camera, perpendicolare al fascio di illuminazione, per ridurre al minimo l'indice di rifrazione di disadattamento. Posizionare in modo uniforme la camera tra i raggi emessi dalle lenti dell'obiettivo.</li>
	<li>Installare un microscopio stereo con un 1 obiettivo di ingrandimento e una fotocamera di semiconduttore (sCMOS) scientifico ossido di metallo complementare perpendicolare all'illuminazione aereo (Vedi Figura 2).</li>
</ol>2. calibrazione del sistema imaging
<ol><li>Recuperare fluorescente perle di polistirolo che sono 0,53 μm di diametro.</li>
	<li>Preparare il campione di perlina fluorescente diluendo la soluzione di perlina in una soluzione corrispondente indice di rifrazione (cerchi) con puntamento agarosio all'1% basso-fusione di 1: 150, 000. Tagliare un pezzo di tubo di vetro borosilicato con un diametro interno di 12 mm e un diametro esterno di 18 mm per una lunghezza di 30 mm. Nota: Il tubo di vetro borosilicato viene utilizzato per abbinare l'indice di rifrazione (1,47).</li>
	<li>Mescolare il campione diluito perlina con 1% di agarosio e dispensare la soluzione di agarosio/tallone nel tubo borosilicato. Consentire l'agarosio a solidificare a temperatura ambiente (23 ° C).</li>
	<li>Riempire la camera ABS (dal punto 1.7) con una soluzione di glicerolo al 99,5%. Posizionare il tubo di vetro borosilicato contenente le microsfere all'interno della camera. Posizionare la camera di ABS in sistema di imaging in modo che è al centro del fascio gaussiano creato dal sistema di doppia illuminazione.</li>
	<li>Allegare una fase traslazionale motorizzata 3-d per il tubo di vetro borosilicato per controllare il movimento e l'orientamento del campione all'interno della camera ABS (Vedi Supplemental figura 1).</li>
	<li>Acquisire immagini tramite la fotocamera di sCMOS a una velocità di 30 fotogrammi al secondo (fps). Utilizzando il controller del motore, spostare il campione 1 mm in direzione laterale e acquisire immagini a ogni incremento di 1 mm utilizzando la fotocamera sCMOS. Continuare fino a quando l'intero campione è stato ripreso.</li>
	<li>Impilare le immagini acquisite utilizzando un software di visualizzazione (Vedi Tabella materiali). Misurare la funzione di diffusione del punto (PSF) del sistema utilizzando queste immagini della perla. Utilizzare questo PSF per deconvoluzione durante l'elaborazione nei passaggi successivi di immagini.</li>
</ol>3. preparazione del campione
<ol><li>Sezionare i cuori da un mouse di tipo selvaggio P1 e da un doppio eterozigote sarcolipin-Cre knockin mouse con il gene Rosa26-YFP (SlnCre / +; R26reporter YFP / +) a P7. Nota: L'eutanasia è stata effettuata usando pentobarbital e la tecnica descritta da Robbins et al. 10. la dissezione è stata realizzata secondo la tecnica descritta dal National Heart, Lung e Blood Institute (NHLBI)10,11.</li>
	<li>Eseguire un prodotto chimico di compensazione dei cuori murini come descritto da Kevin Sung et al. 12. Nota: La seguente procedura dovrebbe essere eseguita in una cappa poiché i prodotti chimici utilizzati sono tossici.<ol>
<li>Sciacquare i cuori in 1x tampone fosfato salino (PBS) 3 x per 10 min. Dopo il risciacquo, mettere i cuori in una soluzione di paraformaldeide 4% e incubare questi campioni a 4 ° C durante la notte.</li>
		<li>Posizionare i campioni in una soluzione di 4% di acrilammide contenente 0.5% p/v di 2, 2'-Azobis dicloridrato. Consentire ai campioni di incubare a 4 ° C durante la notte. Dopo l'incubazione overnight, rimuovere i campioni e li Incubare a 37 ° C per 2-3 ore.</li>
		<li>Sciacquare i campioni con PBS e poi metterli in una soluzione di solfato dodecilico di sodio di 8% w/v e 1,25% w/v acido borico. Incubare i campioni a 37 ° C fino a quando non sono chiare. Questo può richiedere diverse ore a seconda dello spessore del campione. Dopo aver eliminato, rimuovere i campioni e metterli in 1x tampone fosfato salino per 1 giorni.</li>
		<li>Preparare un indice di rifrazione corrispondente soluzione con 40 g di medio gradiente di densità non ionico (Vedi Tabella materiali) in 30 mL di tampone fosfato 0,02 M (PB), 0.1% Tween-20 e 0,01% di sodio azide. Portare la soluzione a un pH di 7,5 con idrossido di sodio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posizionare il campione deselezionato in cerchi con un indice di rifrazione di 1,46-1,48 e 1% di agarosio. Inserire il campione nel tubo di vetro borosilicato e consentire l'agarosio a solidificare a temperatura ambiente (23 ° C).</li>
	<li>Allegare una fase traslazionale motorizzata 3-d per il tubo di vetro borosilicato per controllare il movimento e orientamento del campione entro il 3-d stampato alloggiamento ABS (Vedi Supplemental figura 1).</li>
</ol>4. Imaging del cuore adulto
<ol><li>Iniettare 8,7 x 1012 virus di tipo vettoriale virus adeno-associato 9 (AAV9) che contiene un promotore specifico troponina T (cTnT) e la proteina fluorescente verde (GFP) in un volume di 100 μL in vena caudale di un mouse di tipo selvaggio 2-mese (C57BL/6). Nota: Il AAV9 è stato sviluppato secondo la tecnica descritta da Yuan et al. 13. in questo modo GFP da associare al canale midollare esterna renale del potassio (ROMK) producendo AAV9-cTnT-ROMK-GFP (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Sezionare i cuori di topo adulto a 7,5 mesi dell'età secondo la tecnica descritta da NHLBI11. Preparare i campioni utilizzando passaggi 3.1-3.3.</li>
	<li>Collegare il controller del motore per l'attuatore motore. Collegare l'attuatore al tubo di vetro borosilicato per controllare il movimento e orientamento del campione entro il 3-d stampato camera di ABS.</li>
	<li>Posizionare il campione in modo che è al centro del fascio gaussiano creato dal sistema di doppia illuminazione. Acquisire immagini tramite la fotocamera di sCMOS ad un tasso di 100 fps.</li>
	<li>Utilizzando il controller del motore, spostare il campione 1 mm in direzione assiale e acquisire immagini a ogni incremento di 1 mm con la fotocamera di sCMOS. Continuare fino a quando l'intero campione è stato ripreso. Nota: Il sistema è controllato da un software di controllo di strumenti personalizzati.</li>
	<li>Impilare le immagini acquisite utilizzando un software di visualizzazione (Vedi Tabella materiali). Sviluppare le immagini 3D utilizzando queste serie di immagini e il software di visualizzazione14. Deconvoluzione il PSF da passo 2.6 con lo stack di immagine acquisita. Impostare un valore di intensità di soglia pixel per osservare i contorni del cuore e aggiungere pseudo-colore alle immagini basate su questa intensità di scala di grigi.</li>
</ol>

<ol><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4537058/">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Dimensional+light-sheet+microscopy+to+elucidate+shear+stress+modulation+of+cardiac+trabeculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li>
<li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).</li>
<li>High, F. A., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+role+of+Notch+in+cardiac+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).</li>
<li>Sachinidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+specific+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+imaging+to+localize+cardiac+lineage+and+protein+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution.</a> Scientific Reports. 7, 42209(2017).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+excision+of+murine+aorta%3B+a+versatile+technique+in+the+study+of+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52172(2014).</li>
<li>National Heart, L., Blood Institute, <a target="_blank" href="http://community.parentprojectmd.org/profiles/blogs/standard-operating-procedures-for-duchenne-animal-models">Standard Operating Procedures (SOP's) for Duchenne Animal Models</a>. , (2015).</li>
<li>Sung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+three-dimensional+tissue+clearing+and+incorporation+of+colorimetric+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping.</a> Scientific Reports. 6, 30736(2016).</li>
<li>Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+adeno-associated+virus+vector+producer+cell+line+method+for+scalable+vector+production+of+different+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes.</a> Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).</li>
<li>FEI, <a target="_blank" href="https://www.fei.com/software/amira-user-guide/">Amira User's Guide</a>. , Konrad-Zuse-Zentrum fur Informationstechnik. Berlin. 59-138 (2017).</li>
<li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+3D+dynamics+in+thickly+fluorescent+specimens+beyond+the+diffraction+limit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit.</a> Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).</li>
<li>Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+and+fast+live+imaging+with+two-photon+scanned+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy.</a> Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+light-sheet+imaging+with+virtual+reality+to+recapitulate+developmental+cardiac+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics.</a> JCI Insight. 2 (22), (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il sistema LSFM e la tecnica qui descritta utilizza un fascio di fronte-retro illuminazione combinato con una compensazione ottica a immagine del cuore del topo nelle fasi post-natali e adulti del suo sviluppo. Un fascio di illuminazione singola tradizionale soffre di photon scattering e assorbimento attraverso tessuti più spessi e più grandi campioni1,3. Le travi-retro forniscono un'illuminazione più uniforme del campione, riducendo al minimo l'effetto di stripi...

Microscopia di fluorescenza di luce-foglio era una tecnica sviluppata nel 1903 ed è usata oggi come un metodo per studiare l'espressione genica ed anche a produrre modelli 3D o 4D di tessuto campioni1,2,3. Questo metodo di imaging utilizza un sottile foglio di luce per illuminare un unico piano di un campione in modo che solo quell'aereo è catturato dal rivelatore. Il campione può quindi essere spostato in direzione assiale per catturare ogni strato, una sezione alla volta e il rendering di un modello 3D dopo il post-processing delle immagini acquisite4. Tuttavia, dovuto l'assorbimento e la dispersione dei fotoni, LSFM è stato limitato ai campioni che sono entrambi a pochi micron di spessore o sono otticamente trasparente1.
Le limitazioni di LSFM hanno portato a studi approfonditi di organismi che hanno i tessuti che sono otticamente trasparenti, come il pesce zebra. Studi condotti su differenziazione e sviluppo cardiaco sono spesso condotte su zebrafish poiché ci sono geni conservati tra esseri umani e zebrafish5,6. Anche se questi studi hanno portato a progressi nella ricerca cardiaca legate a cardiomiopatie6,7, c'è ancora la necessità di condurre una simile ricerca sugli organismi di livello superiore come i mammiferi.
Mammiferi del tessuto cardiaco presenta una sfida a causa dello spessore e l'opacità del tessuto, l'assorbimento a causa dell'emoglobina nei globuli rossi e lo striping che si verifica a causa di illuminazione unilaterale del campione sotto tradizionale LSFM metodi1 , 8. per compensare queste limitazioni, abbiamo proposto di utilizzare-retro illuminazione e una versione semplificata della chiarezza tecnica9 combinati con un indice di rifrazione corrispondente soluzione (cerchi). Di conseguenza, questo sistema permette l'imaging di un campione che è maggiore di 10 x 10 x 10 mm3 mentre mantenendo una buona qualità risoluzione assiale e laterale piani8.
Questo sistema è stato calibrato prima utilizzando perline fluorescenti disposti in diverse configurazioni all'interno della tubazione di vetro. Quindi, il sistema è stato usato all'immagine cuori murini postnatali e adulti. In primo luogo, il cuore del topo postnatale era imaged in 7 giorni (P7) per rivelare la cavità ventricolare, lo spessore della parete ventricolare, le strutture di valvola e la presenza di trabeculation. In secondo luogo, è stato condotto uno studio per identificare le celle che vuoi differenziare in cardiomiociti utilizzando un cuore del topo postnatale al giorno 1 (P1) con Cre-labeled cardiomiociti e la proteina fluorescente gialla (YFP). Infine, topi adulti a 7,5 mesi erano imaged per osservare la presenza di potassio midollare esterna renale canali (ROMK) dopo la terapia di gene8.

<table><tbody><tr><td>CW Laser</td><td>Laserglow Technologies</td><td>LMM-GBV1-PF3-00300-05</td><td>Eccitazione dei fluorofori</td></tr><tr><td>Filtro a densità neutra</td><td>Thorlabs</td><td>NDC-50C-4M</td><td>Controlla la quantità di luce che entra nel sistema Espansore</td></tr> del <tr><td>fascio acromatico</td><td>Thorlabs</td><td>GBE05-A</td><td>Espande il fascio di luce</td></tr><tr><td>Fessura meccanica</td><td>Thorlabs</td><td>VA100C</td><td>Controlla la larghezza del fascio</td></tr><tr><td>Divisore di fascio</td><td>Thorlabs</td><td>BS013</td><td>Forma un fascio di illuminazione</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio con obiettivo 1X</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td>Utilizzato per l'osservazione del campione</td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-42U</td><td>Utilizzato per acquisire immagini</td></tr><tr><td>Acrilonitrile butadiene stirene (ABS)</td><td>Stratasys</td><td>uPrint</td><td>Materiale utilizzato per stampare in 3D un portacampioni</td></tr><tr><td>Perle di polistirene fluorescente</td><td>Spherotech Inc</td><td>PP-05-10</td><td>Utilizzato per la calibrazione del sistema di imaging</td></tr><tr><td>Tubo in vetro borosilicato</td><td>Corning</td><td>Pyrex 7740</td><td>Tubo per l'inclusione del campione</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td>Riempimento per camera del campione</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP39920</td><td>Soluzione di risciacquo per cuori di topo</td></tr><tr><td>Scienze della microscopia elettronica</td> della <td>paraformaldeide</td><td>RT-15700</td><td>Prima soluzione di incubazione</td></tr><tr><td>Acrilammide</td><td>Wako Chemicals</td><td>AAL-107</td><td>Miscelato con 2,2'-Azobis dicloridrato per la seconda soluzione di incubazione per cuori di topo</td></tr><tr><td>2,2'-Azobis dicloridrato</td><td>Wako Chemicals</td><td>VA-044</td><td>Miscelato con acrilammide per la seconda soluzione di incubazione per cuori</td></tr> <tr><td>di topoSodio dodecil solfato&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71725</td><td>Miscelato con acido borico per la terza soluzione di incubazione per cuori di topo</td></tr><tr><td>Acido borico</td><td>Fischer Scientific</td><td>A74-1</td><td>Miscelato con sodio dodecil solfato per la terza soluzione di incubazione per cuori di topo</td></tr><tr><td>Sigma D2158</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2158</td><td>Miscelato con PB, Tween-20 e sodio azide come soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11332465001</td><td>Miscelato con Sigma D2158, PB e sodio azide come soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione</td></tr><tr><td>Sodio azide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td>Miscelato con Sigma D2158, PB e Tween-20 come soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione</td></tr><tr><td>Vettore virale adeno-associato 9 con un promotore di troponina T specifico per il cuore etichettato con GFP</td><td>Vector Biolabs</td><td>VB2045</td><td>Esprime GFP quando legato all'attuatore del</td></tr><tr><td>servomotore CC</td> ROMK <td>Thorlabs</td><td>Z825B</td><td>Utilizzato per il movimento del campione in direzione assiale all'interno del foglio leggero</td></tr><tr><td>K-Cube Servomotore CC spazzolato Controller</td><td>Thorlabs</td><td>KDC101</td><td>Si collega all'attuatore del motore e controlla il movimento dell'attuatore</td></tr><tr><td>Software Amira</td><td>FEI</td><td>N/A</td><td>Software di visualizzazione per la produzione di immagini 2D e 3D</td></tr></tbody></table>

microscopia di fluorescenza di luce-foglio per lo studio del cuore murino

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Microscopia di fluorescenza di luce-foglio è stato ampiamente utilizzata per l'acquisizione rapida immagine con un'alta risoluzione assiale da micrometro scala del millimetro. Tecniche tradizionali di luce-foglio implicano l'uso di un fascio di illuminazione singola direzionato ortogonalmente al tessuto dell'esempio. Immagini di grandi campioni che sono prodotte utilizzando un fascio di illuminazione singola contengono strisce o artefatti e soffrono di una risoluzione ridotta dovuto la dispersione e l'assorbimento della luce da parte del tessuto. Questo studio utilizza un fascio di fronte-retro illuminazione e una semplificata chiarezza ottica, tecniche di taglio per il cuore murino. Queste tecniche permettono di imaging più profondo rimuovendo i lipidi dal cuore e producono un grande campo di formazione immagine, maggiore di 10 x 10 x 10 mm3. Di conseguenza, questa strategia permette di quantificare le dimensioni ventricolari, traccia la linea cardiaca e localizzare la distribuzione spaziale delle proteine cardiache specifiche e canali ionici da post-natali ai cuori di topo adulto con sufficiente contrasto e ad alta risoluzione.

La tecnica descritta qui usato un fascio di fronte-retro illuminazione combinato con una compensazione ottica dei campioni di tessuto del cuore del mouse per ottenere una maggiore profondità di imaging e un più grande volume di imaging con sufficiente formazione immagine ad alta risoluzione (Figura 1). Per calibrare il sistema, perline fluorescenti sono stati collocati all'interno dei tubi di vetro e all'interno del sistema di imaging. Le perle sono stati poi...

Questo studio utilizza una tecnica di microscopia (LSFM) foglio di luce di fluorescenza-retro illuminazione combinata con compensazione ottica per studiare il cuore murino.

Microscopia di fluorescenza di luce-foglio per lo studio del cuore murino

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Il vantaggio principale di questa tecnologia è che consente una rapida imaging del cuore del mouse. E può essere usato per osservare la presenza di canali d'aria dopo la terapia genica. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla cardiologia dello sviluppo, può anche essere applicato ad altri sistemi, come la neurologia e la pneumologia.Generalmente, gli individui avranno difficoltà con questa tecnica perché montare un'immagine del cuore del topo adulto può essere difficile, ed è diverso da altre tecniche tradizionali, come la microscopia confocale e invertita. Posizionare un laser ad onda continua con tre lunghezze d'onda di 405 nanometri, 473 nanometri e 532 nanometri. Quindi, apporre uno specchio e allinearlo con il piano dello specchio a 45 gradi al fascio.Questo dirigerà il laser verso lo splitter del fascio, che forma la configurazione dell'illuminazione a due lati. Quindi, passare il fascio attraverso un filtro di densità neutra di 50 millimetri di diametro, un espansore di travi e un foro perno di 25 millimetri di diametro, tutti posizionati a 150 millimetri l'uno dall'altro. Passare la trave attraverso uno splitter a fascio 50-50, posizionato a 150 millimetri dal foro stenopeico.Quindi, posizionare lo specchio a due 150 millimetri dallo splitter del fascio, a 90 gradi al fascio in avanti, e allinearlo in modo che il suo piano specchio sia ad un angolo di 45 gradi rispetto al fascio. Quindi, posizionare lo specchio a tre 100 millimetri dallo specchio due, e allinearlo in modo che il suo piano speculare sia ad un angolo di 45 gradi rispetto al fascio riflesso dallo specchio due. Utilizzare questo fascio riflesso per formare un lato della scheda luminosa a doppia illuminazione.Sul lato opposto dello splitter del fascio, posizionare lo specchio cinque in modo che il suo piano speculare sia a 45 gradi dal fascio emesso in avanti. Utilizzare il fascio emesso dallo specchio cinque per formare il secondo lato della doppia scheda luminosa di illuminazione. Successivamente, impostare il sistema di illuminazione a doppia aspetto in modo sistemico.Posizionare l'obiettivo cilindrico a due 150 millimetri di distanza dallo specchio tre e un'altra lente cilindrica identica a 150 millimetri di distanza dallo specchio cinque, dall'altra parte della configurazione a doppia illuminazione. Quindi, posizionare due specchi, ciascuno in linea con le lenti cilindriche, a distanze di 50 millimetri per riflettere il fascio a 90 gradi. Su entrambi i lati del foglio luminoso, formare un farsettino acromatico da un paio di lenti, con la prima lente posizionata a 100 millimetri dallo specchio precedente e con un diametro di un pollice e una lunghezza focale di 100 millimetri.La seconda lente deve essere posizionata a 160 millimetri dall'obiettivo uno, con un diametro di un pollice e una lunghezza focale di 60 millimetri. Quindi, posizionare gli obiettivi di illuminazione uno e due 150 millimetri dai precedenti doppietti acromatici, in modo che siano in linea con il fascio. Il fascio emesso dagli obiettivi forma la scheda luminosa per l'imaging dei campioni.In primo luogo, preparare il campione di perline fluorescenti diluendo una soluzione di perline da 0,53 micrometri, da uno a 150.000, in una soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione pre-riscaldata, con un'agarose di puntamento a bassa fusione dell'uno per cento. Successivamente, utilizzare un pezzo di tubi di vetro borosilicato con un diametro interno di 12 millimetri e un diametro esterno di 18 millimetri, per una lunghezza di 30 millimetri. Pipettare la soluzione di agarosio di perline nei tubi borosilicati e lasciare che l'agarosio si solidifichi a temperatura ambiente.Ora, riempire una camera abs stampata in 3D con una soluzione di gylcerolo al 99,5%. Posizionare i tubi di vetro borosilicate, contenenti le perline, all'interno della camera. Attaccare uno stadio traslazionale motorizzato 3D ai tubi di vetro borosilicato per controllare il movimento e l'orientamento del campione all'interno della camera ABS.Quindi, utilizza un software progettato su misura per acquisire immagini utilizzando la fotocamera sCMOS, a una velocità di 30 fotogrammi al secondo. Utilizzando il controller del motore, spostare il campione di un millimetro nella direzione laterale e acquisire immagini con ogni incremento di un millimetro, fino a quando l'intero campione non è stato immaginato. Impilare le immagini acquisite utilizzando un software di visualizzazione e misurare la funzione di diffusione del punto del sistema utilizzando queste immagini di perline.Utilizzare una soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione, con un pH di 7,5, e sciogliere l'uno per cento di agarosio nella soluzione corrispondente. Posizionare un campione di cuore di topo adulto cancellato nella soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione, con l'uno per cento di agarosio sciolto. Quindi, inserire il campione in tubi di vetro borosilicato e lasciare che l'agarosio si solidifichi a temperatura ambiente.Attaccare uno stadio traslazionale motorizzato 3D al tubo di vetro borosilicato per controllare il movimento e l'orientamento del campione all'interno di una camera ABS stampata in 3D. Posizionare il campione in modo che si trova al centro del fascio gaussiano, creato dal sistema di doppia illuminazione. Quindi, impostare la velocità di acquisizione della fotocamera sCMOS su 30 fotogrammi al secondo.Ora, usando il controller del motore, spostare il campione di un millimetro nella direzione assiale e acquisire immagini ad ogni incremento di un millimetro. Continuare fino a quando l'intero campione non è stato immaginato. Impilare le immagini acquisite utilizzando un software di visualizzazione.Sviluppa le immagini 3D usando questi stack di immagini. A tale scopo, deconvolgere la funzione di diffusione del punto determinata in precedenza e utilizzarla per gli stack di immagini acquisiti. Infine, impostate un valore di intensità della soglia di pixel per osservare i contorni del cuore e aggiungete pseudocolore alle immagini, in base a questa intensità in scala di grigi.Al primo giorno post-natale, si possono visualizzare le valvole, l'atrio, il ventricolo, il muscolo pectinato e la trabeculazione, tra le altre caratteristiche. Al settimo giorno post-natale, le caratteristiche sono ancora più definite. L'atrio, il ventricolo, le dimensioni della cavità ventricolare e lo spessore della parete ventricolare sono tutti evidenti.Per studiare la differenziazione dei cardiomiociti all'interno del cuore, i topi knock-in eterozigoti sono stati etichettati per mostrare cardiomiociti. Le celle etichettate sono mostrate qui, in ogni direzione del piano. I tre piani furono uniti, per creare un rendering 3D del cuore.La regione cerchiata rossa all'interno dell'inserto mostra due cuori di topo traslucidi dopo aver subito la tecnica della chiarezza e essere stati inseriti nei tubi di vetro borosilicati. Oltre a studiare i topi post-natali, il sistema di imaging può anche essere utilizzato per studiare il cuore adulto del topo. Qui, i canali ROMK taggati GFP sono mostrati a 7,5 mesi.Questi sono stati trovati principalmente nella parete ventricolare. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in uno o due minuti. Quando si tenta questa procedura, è importante rimuovere tutte le bolle intorno al campione nel tubo.Altri metodi, come l'auto-segmentazione degli stack di immagini, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive relative alle lesioni cardiovascolari e alla rigenerazione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica è stata utilizzata dai ricercatori per studiare l'architettura cardiaca nelle fasi di sviluppo post-natale e adulto nei topi.

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