Metodologia per la rilevazione accurata di metilazione del DNA mitocondriale

L'obiettivo generale di questo protocollo di sequenziamento del bisolfito e della pipeline bioinformatica è quello di ottenere una quantificazione accurata della metilazione del DNA mitocondriale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo mitoepigenetico, come ad esempio la metilazione del DNA mitocondriale sta cambiando la malattia umana? Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente una quantificazione accurata della metilazione del DNA mitocondriale.

Il passo cruciale quando si studia la metilazione del DNA mitocondriale è quello di linearizzare il DNA mitocondriale mediante digestione di BamH1 prima del trattamento con bisolfito di sodio. Il sito dell'enzima di restrizione BamH1 è visualizzato in questa mappa del genoma mitocondriale umano. Sono mostrate anche le cinque regioni del genoma mitocondriale che saranno studiate mediante sequenziamento del bisolfito.

Ansa di spostamento, tRNA fenilalanina e ribosoma 12S, ribosoma 16S, NADH deidrogenasi 5, gene codificante l'mRNA del citocromo B. Dopo aver progettato i primer per il sequenziamento del bisolfito, utilizzando gli strumenti online come descritto nel protocollo di testo, la specificità del primer verso il genoma mitocondriale viene verificata utilizzando BiSearch. Le sequenze di primer vengono aggiunte alla funzione di ricerca dei primer di BiSearch.

La casella del bisolfito viene selezionata e viene selezionato un genoma di riferimento. I risultati della ricerca mostreranno potenziali prodotti PCR generati su catene senso e antisenso. Per amplificare le regioni di interesse dal genoma mitocondriale convertito con bisolfito, eseguire la PCR utilizzando una polimerasi Taq Hot-start.

Se si utilizzano i primer separatamente, mescolare 100 nanogrammi di DNA convertito, 500 micromolari di primer senso e antisenso, una miscela di dNTP da un microlitro e polimerasi a 7,5 unità per reazione in un volume totale di 50 microlitri. Eseguire la PCR con le seguenti condizioni: cinque minuti a 95 gradi Celsius, un minuto a 94 gradi Celsius, un minuto a 55 gradi Celsius, un minuto a 72 gradi Celsius per 35 cicli, seguiti da 10 minuti a 72 gradi Celsius. Per il multiplexing dei primer, utilizzare 200 nanogrammi di DNA convertito nelle seguenti condizioni di ciclo: cinque minuti a 95 gradi Celsius, un minuto a 94 gradi Celsius, 1,5 minuti a 55 gradi Celsius e 1,5 minuti a 72 gradi Celsius per 35 cicli, seguiti da 10 minuti a 72 gradi Celsius.

Al termine della PCR, eseguire l'elettroforesi su gel sui prodotti PCR, utilizzando un agarosio al 2% a 100 volt. L'estrazione dei prodotti della PCR dal gel di agarosio deve essere effettuata in modo da ridurre al minimo l'esposizione ai raggi UV e il rischio di danni al DNA. Scatta una foto del gel sotto la luce UV.

Quindi, molto rapidamente, segnare intorno al prodotto PCR con un bisturi e spegnere la luce UV. Quindi, tagliare lentamente il prodotto PCR senza esposizione ai raggi UV. Posizionare le fette di gel in provette da microcentrifuga e purificare i prodotti PCR utilizzando la purificazione del gel come descritto nel protocollo di testo.

Quantificare il DNA purificato utilizzando la fluorimetria. Conservare i campioni a 20 gradi Celsius, se non si procede immediatamente alla preparazione della libreria di sequenziamento del bisolfito. Inizia la preparazione della libreria di prodotti PCR convertiti con bisolfito eseguendo la riparazione finale utilizzando fino a 100 nanogrammi di prodotto PCR.

A ciascuna provetta da 0,2 millilitri, aggiungere 55,5 microlitri di prodotto PCR, tre microlitri di enzima di preparazione finale e 6,5 microlitri di tampone di reazione di riparazione finale 10X. Incubare le provette in un termociclatore a 20 gradi Celsius per 30 minuti, quindi a 65 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, legare gli adattatori di sequenziamento mescolando il DNA riparato con 15 microlitri di miscela di ligasi Blunt/TA, 2,5 microlitri di adattatore e un microlitro di potenziatore di legatura.

Mettere la miscela in un termociclatore e incubare a 20 gradi Celsius per 15 minuti. Mettere in pausa il termociclatore e aggiungere 3 microlitri di enzima USER a ciascuna provetta. Mescolare e riposizionare le provette nel termociclatore e incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti.

Dimensione: selezionare il DNA legato all'adattatore utilizzando l'immobilizzazione reversibile in fase solida o SPRI. Aggiungere al DNA legato con l'adattatore 13,5 microlitri di acqua e 55 microlitri di perle SPRI risospese. Incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.

Posizionare i tubi su un supporto magnetico. Quando la soluzione è limpida, trasferire il surnatante, contenente il DNA legato all'adattatore, in una nuova provetta e gettare la provetta contenente le perle. Aggiungere 25 microlitri di perle SPRI risospese al surnatante; Mescolare e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.

Posizionare le provette sul supporto magnetico e, quando la soluzione è limpida, scartare il surnatante. Il DNA legato all'adattatore è ora legato alle perline. Mentre le provette sono sul supporto magnetico, aggiungere 200 microlitri di etanolo all'80% appena preparato a ciascuna provetta e incubare per 30 secondi per lavare le perle.

Rimuovere ed eliminare il surnatante. Ripetere questa fase di lavaggio con etanolo per un totale di due lavaggi. Rimuovere l'etanolo dal secondo lavaggio e asciugare le perle all'aria lasciando i tubi sul supporto magnetico, con il coperchio aperto, per cinque minuti.

Dopo cinque minuti, rimuovere le provette dal supporto magnetico, aggiungere 23 microlitri di tampone di eluizione del DNA alle perle e mescolare. Incubare a temperatura ambiente per due minuti. Posizionare i tubi sul supporto magnetico fino a quando la soluzione non è limpida.

Quindi, trasferire due microlitri della soluzione in una piastra PCR a 96 pozzetti per l'amplificazione pre-PCR. Evitando accuratamente le perle, trasferire il resto della soluzione in una nuova provetta da 0,2 millilitri per l'amplificazione PCR. Eseguire l'amplificazione pre-PCR mediante RT-qPCR per stimare il numero di cicli necessari per amplificare il DNA legato all'adattatore.

Preparare una miscela master di quanto segue per reazione utilizzata. 0,4 microlitri di primer indice, 0,4 microlitri di primer PCR universale, 7,2 microlitri di acqua e 10 microlitri di master mix RT-qPCR. Quindi, miscelare la miscela master e aggiungere 18 microlitri di miscela master ai due microlitri di DNA nella piastra PCR a 96 pozzetti.

Posizionare la piastra in una macchina per PCR in tempo reale ed eseguire l'amplificazione nelle seguenti condizioni: 30 secondi a 98 gradi Celsius, 10 secondi a 98 gradi Celsius e 75 secondi a 65 gradi Celsius per 20 cicli, seguiti da cinque minuti a 65 gradi Celsius. Dopo aver stimato il numero di cicli di amplificazione necessari per ciascun campione, come descritto nel protocollo di testo, amplificare il DNA legato con l'adattatore. Per ogni campione, miscelare 21 microlitri di DNA, 25 microlitri di master mix PCR, un microlitro di primer indice, un microlitro di primer PCR universale e due microlitri di acqua.

Nel termociclatore, sottoporre ogni campione alle seguenti condizioni: 30 secondi a 98 gradi Celsius, 10 secondi a 98 gradi Celsius e 75 secondi a 65 gradi Celsius per il numero calcolato di cicli, seguiti da cinque minuti a 65 gradi Celsius. Purificare il DNA amplificato utilizzando perle SPRI, come dimostrato in precedenza, ed eluire in 22 microlitri di tampone di eluizione. Controlla la qualità della libreria utilizzando un bioanalizzatore.

Cerca le dimensioni corrette dei picchi della libreria. Stimare la dimensione media delle coppie di basi dei prodotti della libreria mediante l'analisi dello striscio. In Impostazioni globali avanzate, in Analisi sbavatura, fare doppio clic su Tabella.

Trova la regione da 100 a 1000 coppia di basi e fai clic su OK. In Tabella regioni, apparirà la regione definita e verrà calcolata la dimensione media della libreria. Quantificare la libreria mediante fluorimetria. Conserva la libreria a 20 gradi Celsius fino al momento del sequenziamento di nuova generazione e delle analisi computazionali.

Mediante sequenziamento del bisolfito, la metilazione del DNA mitocondriale è stata studiata nel DNA totale non digerito e digerito da cellule muscolari scheletriche umane in cinque diverse regioni del genoma mitocondriale. Un quadrato pieno rappresenta i siti dinucleotidici della citosina guanina. Il quadrato aperto rappresenta i siti dinucleotidici di guanina non citosina.

Per il DNA mitocondriale non digerito, i livelli di metilazione variavano dallo 0 al 15,1% in tutte le regioni studiate. Tuttavia, quando il DNA è stato digerito prima della conversione del bisolfito, il tasso di uncoversion è sceso a un massimo dell'1% in tutte le regioni. Ciò illustra l'importanza della digestione di BamH1 prima della conversione del bisolfito per evitare la sovrastima dei livelli di metilazione del DNA mitocondriale.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come eseguire il sequenziamento del bisolfito mitocondriale e, seguendo la nostra pipeline bioinformatica, puoi ottenere una quantificazione accurata della metilazione del DNA mitocondriale.