Singola molecola l'ibridazione In Situ (smFISH) analisi in crescita vegetativa lievito germogliante e meiosi

L'obiettivo generale di questa ibridazione in situ di RNA a singola molecola ottimizzata, o smFISH, è quello di rilevare e quantificare le singole molecole di RNA su base cellulare durante la crescita vegetativa e la meiosi del lievito in gemmazione. Questo metodo rivela la variabilità da cellula a cellula nell'espressione genica sulla localizzazione dell'RNA subcellulare ed è quindi una tecnica potente per studiare la regolazione genica. A parte le informazioni uniche che possono essere rivelate da smFISH, il vantaggio principale della tecnica è che, una volta ottimizzata, è robusta e altamente riproducibile.

Per la dimostrazione di questo protocollo verrà utilizzata una coltura meiotica. Per fissare la coltura in 3% di formaldeide, aggiungere 1840 microlitri di coltura a 160 microlitri di 37% di formaldeide in una provetta da microcentrifuga da due millilitri. Capovolgere circa cinque volte per mescolare.

Posizionare il tubo su un tamburo a rulli a temperatura ambiente per 20 minuti. Dopo 20 minuti, continuare a fissare a quattro gradi Celsius con rotazione durante la notte. Il giorno seguente, prepararsi per la digestione scongelando prima 200 millimolari di complessi vanadilribonucleosidici, o VRC, a 65 gradi Celsius per almeno 10 minuti.

Per preparare la miscela master per la digestione, pipettare prima 2125 microlitri di tampone B in una provetta da 15 millilitri. Quindi agitare il VRC caldo per cinque secondi per risospenderlo completamente e aggiungere 200 microlitri di VRC al tubo da 15 millilitri. La miscela dovrebbe apparire di colore verde brunastro chiaro.

Centrifugare il campione meiotico a 21.000 x g per un minuto e mezzo a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante con cura, posizionando la punta del vuoto sul lato opposto del pellet per evitare di disturbare il pellet. Risospendere le cellule in un millilitro e mezzo di tampone B freddo pipettando su e giù per mescolare.

Centrifugare a 21.000 x g per un minuto e mezzo. Rimuovere la maggior parte del liquido mediante aspirazione a vuoto, lasciando circa 100 microlitri. Risospendere le cellule in un millilitro e mezzo di tampone freddo B. Centrifugare i campioni, rimuovere il liquido e risospendere nuovamente le cellule in un millilitro e mezzo di tampone freddo B.

Centrifugare a 21.000 x g per un minuto e mezzo. Aspirare completamente il liquido mediante pipettaggio. Risospendere le cellule in 425 microlitri di master mix di digestione e agitare brevemente.

Aggiungere cinque microlitri di zimoliasi al tubo e agitare per due o tre secondi per mescolare. Posizionare il tubo su un tamburo a rulli e digerire a 30 gradi Celsius per 15-30 minuti. Dopo 15 minuti, controllare le cellule al microscopio ogni cinque minuti e interrompere la digestione quando circa l'80% delle cellule appare non trasparente e non rifrattivo.

Centrifugare la provetta a 376 x g per tre minuti. Rimuovere completamente il surnatante. Risospendere delicatamente le cellule con un millilitro di tampone B pipettando su e giù una o due volte per mescolare.

Centrifugare la provetta e rimuovere il tampone. Risospendere delicatamente le cellule in un millilitro di etanolo al 70% e incubare a temperatura ambiente per tre ore e mezza o quattro. Per iniziare la procedura di ibridazione, centrifugare la provetta di cellule a 376 x g per tre minuti.

Rimuovere 500 microlitri di etanolo al 70% dal tubo. Pipettare delicatamente su e giù per risospendere le cellule rimanenti e trasferire le cellule in una provetta a bassa aderenza. Il trasferimento del campione in una provetta a bassa aderenza è fondamentale per prevenire l'eccessiva perdita di cellule durante i successivi lavaggi con formammide.

Centrifugare la provetta a bassa aderenza e rimuovere tutto l'etanolo. Aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio al 10% di formammide alla provetta e pipettare delicatamente su e giù due o tre volte per risospendere le cellule. Lasciare riposare le cellule a temperatura ambiente per circa 20 minuti mentre si preparano le soluzioni di ibridazione, come descritto nel protocollo di testo.

Centrifugare il campione e rimuovere il surnatante nei rifiuti pericolosi. Aggiungere almeno 50 microlitri di ciascuna soluzione di ibridazione al tubo e agitare il tubo per mescolare. Incubare a 30 gradi Celsius su un tamburo a rulli per almeno 16 ore al buio.

Quando l'ibridazione è completa, posizionare il tubo di cellule in una scatola ricoperta di alluminio per proteggerlo dalla luce. Centrifugare il campione a 376 x g per tre minuti. Rimuovere il surnatante nei rifiuti pericolosi mediante pipettaggio.

Risospendere il campione in un millilitro di tampone di lavaggio al 10% di formammide pipettando delicatamente su e giù due o tre volte. Rimetti il tubo di cellule in una scatola ricoperta di alluminio per proteggerlo dalla luce e incuba a 30 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo 30 minuti, centrifugare il campione.

Rimuovere il surnatante dai rifiuti pericolosi mediante pipettaggio, lasciando circa 50 microlitri. Risospendere il campione in un millilitro di soluzione DAPI pipettando delicatamente su e giù due o tre volte. Ancora una volta, posizionare il tubo di cellule nella scatola ricoperta di alluminio e incubare a 30 gradi Celsius per 30 minuti.

Centrifugare il campione e rimuovere completamente il surnatante mediante pipettaggio. Per i campioni che non verranno sottoposti a imaging immediato, risospendere il pellet in 50 microlitri di tampone GLOX senza enzimi. Pipettare su e giù tre o quattro volte per mescolare.

Conservare nella scatola coperta di alluminio a quattro gradi Celsius fino al momento dell'immagine. Per ottenere immediatamente l'imaging dei campioni, aggiungere da 15 a 20 microlitri di tampone GLOX con enzimi. Pipettare cinque microlitri su un vetrino coprioggetti e mettere il vetrino su un vetrino.

Posizionare una salvietta da laboratorio sopra il vetrino dove è posizionato il vetrino coprioggetti. Premere delicatamente sulla salvietta per impostare il vetrino. Posizionare il vetrino in una scatola coperta da un foglio di alluminio per il trasferimento nella sala del microscopio.

Questo protocollo è stato utilizzato per esaminare l'espressione del gene NDC80, che esprime due isoforme di mRNA. L'isoforma del trascritto lungo non decodificato ha un'estensione di 400 coppie di basi e cinque primi rispetto all'isoforma corta. Sono state progettate due serie di sonde.

L'insieme CF 590 si lega all'unica regione dei cinque primi dell'isoforma lunga, mentre l'insieme Q 670 si lega alla regione comune di entrambe le isoforme. In condizioni ottimizzate, sono stati chiaramente identificati punti smFISH distinti per entrambi i set di sonde. I due set di sonde sono stati utilizzati per studiare l'espressione di NDC80 durante la crescita vegetativa e la meiosi.

Nelle celle vegetative, è stato rilevato un segnale robusto dal set di sonde Q 670, ma non dal set di sonde CF 590. Al contrario, un segnale robusto da entrambi i set di sonde è stato rilevato nella profase meiotica e la maggior parte degli spot aveva un segnale co-localizzato. L'analisi del Northern blot ha confermato che l'isoforma lunga era espressa specificamente nella meiosi.

È stato riscontrato che le cellule vegetative hanno una mediana di cinque brevi trascritti di isoforma per cellula, mentre nelle cellule di profase meiotica, la mediana è scesa significativamente a quattro trascritti per cellula. Nella profase meiotica, il numero mediano di trascritti di isoforme lunghe per cellula era 21 e il 100% delle cellule esprimeva il trascritto. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 72 ore se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante innanzitutto ottimizzare la durata della digestione e la concentrazione di sonde smFISH necessarie per ottenere il rapporto segnale/rumore ottimale. Inoltre, ricordarsi di aggiungere VRC durante la digestione e l'ibridazione notturna per prevenire l'attività della nucleasi. Con questo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per esplorare la regolazione genica dinamica e la localizzazione dell'RNA subcellulare.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire il FISH a RNA molecolare singolo nella meiosi del lievito in gemmazione.