Name: Singola molecola libridazione In Situ (smFISH) analisi in crescita vegetativa lievito germogliante e meiosi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Scopri la tecnica smFISH per quantificare molecole di RNA nel lievito durante la crescita vegetativa e la meiosi. Questo metodo rivela la variabilità dell'espressione genica e la localizzazione subcellulare degli RNA.

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Ringraziamo Anne Dodson e Stephanie Heinrich per consigli su come ottimizzare il protocollo smFISH, Xavier Darzacq per aiutare con la piattaforma di analisi, Haiyan Huang per suggerimenti sull'analisi statistica. Questo lavoro è stato sostenuto dal March of Dimes (5-FY15-99), Pew Charitable Trusts (00027344), Damon Runyon Cancer Research Foundation (35-15) e Glenn Foundation a EÜ e un NSF Graduate Research Fellowship Grant No. DGE-1106400 JC.

Nota: Tutti i buffer e i media utilizzati in questo protocollo sono elencati nella tabella 1. Le informazioni sul fornitore per i reagenti è elencati nella Tabella materiali.
1 giorno/1 e 2 giorno:
Nota: Per cultura vegetativo, far crescere cellule a un OD600 di 0,4 e 0,6 in un mezzo comodo. Per cultura meiotica, indurre le cellule per subire la meiosi utilizzando un metodo preferito (in genere la coltura in un OD600 di 1.85).
1. la fissazione e la digestione del campione
<ol><li>Difficoltà un totale di ~3.5 OD600 delle cellule in 3% di formaldeide.<ol>
<li>Per cultura vegetativo, aggiungere mL 5,52 della cultura a 480 µ l di formaldeide al 37% in provette coniche da 15 mL.</li>
		<li>Per cultura meiotica, µ l 1840 di cultura a 160 µ l di formaldeide al 37% in 2 mL microcentrifuga. Capovolgere ~ 5 volte per mescolare. Attenzione: La formaldeide è tossica. Gestire e smaltire secondo le normative istituzionali.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inserire le provette su un rullo di tamburo a temperatura ambiente per 20 min. Per campioni meiotici, dopo aver sistemato a temperatura ambiente per 20 min, continuano a fissaggio durante la notte a 4 ˚ c, rotazione. Nota: La fissazione durante la notte aumenta la riproducibilità e la qualità dei dati smFISH ottenuti per i campioni meiotici. Tempo di fissaggio deve essere ottimizzato.</li>
	<li>Mentre i campioni sono di fissaggio, scongelare 200 mM Vanadyl Ribonucleoside complessi (VRC) a 65 ˚ c per almeno 10 min.</li>
	<li>Preparare il mix master digestione in una provetta da 15 mL: per 1 campione, mescolare 425 µ l di tampone B con 40 µ l di 200mm VRC (riscaldato a 65 ˚ c); per 5 campioni, mescolare 2125 µ l di tampone B con 200 µ l di 200mm VRC (riscaldato a 65 ˚ c). Vortice ~ 5 s per risospendere completamente il VRC prima di aggiungere il mix master, che apparirà verde brunastro chiaro dopo aggiunta di VRC. Nota: Aggiunta di VRC durante la digestione migliora l'uniformità dei risultati smFISH, potenzialmente inibendo il contaminante di nucleasi introdotto dalla miscela di zymolyase, che è purificata dal greggio estratto. La quantità di VRC necessaria a questo punto dovrebbe essere ottimizzata.</li>
	<li>Per i campioni vegetativi, centrifugare le provette a ~ 1057 x g per 3 min. Per campioni meiotici (dopo la fissazione durante la notte), centrifugare a 21.000 x g per un minimo di 1,5 decantare o aspirare il supernatante a rifiuti di formaldeide. Nota: Tutte le fasi di centrifugazione vengono eseguite a temperatura ambiente.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 1,5 mL di tampone freddo B pipettando su e giù o invertendo i tubi e sfogliando per mescolare. Trasferire campioni vegetativi 2 mL provette dopo la risospensione.</li>
	<li>Centrifuga a 21.000 x g per un minimo di 1,5 rimuovere la maggior parte del liquido tramite aspirazione a vuoto o di pipettaggio, lasciando dietro di sé ~ 100 µ l.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 1,5 mL di tampone freddo B.</li>
	<li>Centrifuga a 21.000 x g per un minimo di 1,5 rimuovere la maggior parte del liquido tramite aspirazione a vuoto o di pipettaggio, lasciando dietro di sé ~ 100 µ l.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 1,5 mL di freddo Buffer B. Centrifugare a 21.000 x g per un minimo di 1,5 aspirato il liquido completamente dal vuoto o di pipettaggio.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 425 µ l di mix master di digestione e brevemente vortice per risospendere. Aggiungere 5 µ l di 100T 10mg/mL zymolyase ad ogni provetta. Nota: Vortex zymolyase ogni volta prima aggiunta ai tubi. Zymolyase aggiungere ad ogni provetta individualmente, invece di aggiungere al mix master. Entrambi i passaggi aiutano a mantenere la coerenza di digestione tra tubi perché zymolyase precipita rapidamente.</li>
	<li>Vortice 2-3 s per mescolare. Posizionare i tubi su un tamburo rullo e digerire a 30 ˚ c per 15-30 min. Per cellule vegetative e prime fasi meiotic, prende solitamente ~ 15 min e per Profase Meiotica e divisioni meiotiche, prende solitamente ~ 30 min. Nota: Verificare sul microscopio ogni 5 min dopo 15 min ed interrompere la digestione quando ~ 80% delle cellule appaiono non trasparente e rifrangente. Da questo punto in poi, le cellule sono molto fragili. Gestire le celle delicatamente ed evitare tramite aspirazione a vuoto o tramite vortex.
</li>
	<li>Centrifugare le provette a ~ 376 x g per 3 minuti rimuovere il liquido completamente pipettando.</li>
	<li>Risospendere delicatamente le cellule con 1 mL di tampone B pipettando su e giù 1 - 2 volte per mescolare.</li>
	<li>Centrifugare le provette a ~ 376 x g per 3 min liquido rimuovere Buffer B pipettando. Risospendere delicatamente le cellule in 1 mL di etanolo al 70% (diluito con acqua priva di RNasi).</li>
	<li>Incubare a temperatura ambiente per 3,5-4 ore.</li>
</ol>2. ibridazione
<ol><li>Portare la formammide a temperatura ambiente (per aliquota di 50 mL, ci vogliono ~ 30 min in bagno d'acqua). Nota: Non aprire la bottiglia di formammide fino a quando la bottiglia raggiunge la temperatura ambiente per evitare l'ossidazione della formammide. Attenzione: Formammide è tossica. Gestire e smaltire secondo le normative istituzionali.</li>
	<li>Preparare il tampone di lavaggio di formammide 10% in una provetta conica da 15 mL.</li>
	<li>Centrifugare le provette a ~ 376 x g per 3 minuti rimuovere 500 µ l di etanolo al 70% di pipettaggio. Pipetta da delicatamente su e giù per risospendere le cellule rimanenti e quindi trasferire le cellule ai tubi a bassa aderenza. Nota: Utilizzando i tubi a bassa aderenza notevolmente riduce la perdita di cellule durante i lavaggi successivi.</li>
	<li>Centrifugare le provette nuovamente a ~ 376 x g per 3 min. Rimuovi tutte l'etanolo di pipettaggio.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio di 10% formammide e delicatamente dispensare su e giù 2 - 3 volte per risospendere le cellule.</li>
	<li>Permettono alle cellule di riposare a temperatura ambiente per ~ 20 min durante la preparazione della soluzione di ibridazione. Per 1 campione, mescolare 50 µ l di tampone di ibridazione (camera Temp.), 5 µ l di 200mm VRC (riscaldato a 65 ˚ c) e 1 µ l di ciascuna sonda (200 nM finale). Per 5 campioni, mescolare 250 µ l di tampone di ibridazione (camera Temp.), 25 µ l di 200mm VRC (riscaldato a 65 ˚ c) e 5 µ l di ciascuna sonda (200 nM finale).<ol>
<li>Scongelare il tampone di ibridazione (congelato a-20 ° c) a temperatura ambiente prima dell'apertura del tubo per impedire l'ossidazione di formammide.</li>
		<li>Dopo aver aggiunto il 200mm VRC, vortexare per 5-10 s prima di aggiungere le sonde, che sono progettati e acquistati commercialmente e ricostituiti secondo le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Se due sonde sono co-incubate, aggiungere 1 µ l del 01:10 diluizione di stock sonda #1, come pure 1 µ l del 01:10 diluizione dello stock sonda #2, per fare una diluizione finale di ~ 1: 500 per ogni sonda. La concentrazione necessaria per il migliore rapporto di segnale-rumore deve essere ottimizzato (vedi discussione per dettagli).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugare i campioni a ~ 376 x g per 3 minuti rimuovere il surnatante in rifiuti pericolosi pipettando.</li>
	<li>Aggiungere almeno 50 µ l di soluzione di ibridazione ad ogni provetta. Scorri i tubi per mescolare.</li>
	<li>Incubare a 30 ˚ c su un tamburo rullo per almeno 16 ore al buio.</li>
</ol>Giorno 2/3 giorno
3. lavaggio e imaging
<ol><li>Portare formammide a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare il tampone di lavaggio di 10% formammide (FWB) in una provetta conica da 15 mL.</li>
	<li>Togliere le provette dal tamburo rullo e metterli in una scatola rivestita di lamina al riparo dalla luce.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a ~ 376 x g per 3 minuti rimuovere il surnatante in rifiuti pericolosi pipettando.</li>
	<li>Risospendere in 1 mL di 10% FWB pipettando delicatamente su e giù 2 - 3 volte.</li>
	<li>Incubare a 30 ˚ c per 30 min (non rotante) nella casella coperto di stagnola.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a ~ 376 x g per 3 minuti rimuovere il surnatante per rifiuti pericolosi pipettando e lasciare ~ 50 µ l.</li>
	<li>Nel frattempo, preparare DAPI/FWB in una provetta conica da 15 mL: per 1 esempio, mescolare 1000 µ l di tampone di lavaggio di 10% formammide con 1 µ l di 5 mg/mL DAPI. Per 10 campioni, mescolare 10 mL di tampone di lavaggio 10% formammide con 10 µ l di 5 mg/mL DAPI. Risospendere in 1 mL di DAPI/FWB pipettando delicatamente su e giù 2 - 3 volte.</li>
	<li>Incubare a 30 ˚ c per 30 min (non rotante) nella casella coperto di stagnola.</li>
	<li>Scongelare i reagenti anti-candeggina sul ghiaccio.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a ~ 376 x g per 3 minuti rimuovere il surnatante completamente pipettando. Se necessario, centrifugare nuovamente per rimuovere tutti del surnatante.</li>
	<li>Per i campioni che non sono imaged immediatamente, risospendere il pellet in 50 µ l di tampone di GLOX senza enzimi. Dispensare su e giù 3 - 4 volte per mescolare.<ol>
<li>Mantenere tutti i campioni unimaged nella finestra coperto di stagnola a 4 ˚ c fino al momento dell'immagine. Quando si è pronti all'immagine, centrifugare i campioni a ~ 376 x g per 2 minuti e rimuovere il surnatante completamente pipettando. Risospendere in GLOX con enzimi come di seguito.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per i campioni essere imaged immediatamente, aggiungere 15-20 µ l di tampone GLOX con enzimi. Pipetta da delicatamente su e giù per mescolare. Nota: Il volume aggiunto può variare a seconda della dimensione del pellet cellulare. Si consiglia di risospendere il pellet in 15 µ l di tampone GLOX con enzimi e controlla la densità delle cellule al microscopio. Se le cellule sono troppo dense (cellule che ragruppa una sopra l'altra), aggiunta tampone GLOX extra con enzimi. Se le celle sono troppo radi, centrifugare il campione e rimuovere ~ 5 µ l di tampone.</li>
	<li>Pipettare 5 µ l su un vetrino coprioggetti (18 mm x 18 mm, n ° 1) e mettere il vetrino coprioggetto in una diapositiva.</li>
	<li>Mettere un panno di laboratorio sopra la diapositiva dove sono collocato il vetrino coprioggetti. Premere delicatamente il panno di laboratorio per impostare diapositiva (dovrebbe vedere liquido venuta fuori da tutti e quattro i bordi del coprivetrino).</li>
	<li>Trasferire la diapositiva alla Camera microscopio in una scatola rivestita con foglio di alluminio.</li>
	<li>Immagine utilizzando un microscopio a fluorescenza grandangolari con alto ingrandimento (60-100x) e apertura numerica elevata. Nota: Per raccogliere il massimo numero di fotoni emessi dalle sonde smFISH, microscopi confocali non sono consigliate, come limitare significativamente la quantità di luce per essere raccolti. Qui, i dati sono stati raccolti su un microscopio equipaggiato con un 100 X, 1,4 obiettivo NA, usando filtri CY5 (EX632/22, EM679/34) ripreso a 1.3 s, 100% T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, 100% T; e DAPI (EX390/18, EM435/48), 0.05-0.1 s, T. 32% - 50% Dovrebbe essere acquisita anche un'immagine di riferimento di campo chiaro. Acquisire fette di 15-25 con una dimensione di passaggio di 0.1-0.2 µm, da interamente sotto il fuoco del campo di vista interamente sopra, al fine di garantire che tutti i punti di RNA sono contabilizzati.</li>
</ol>4. image Analysis
<ol><li>Analizzare i dati di smFISH con smFISH pubblicati tra gli strumenti di analisi come pesce-quant17 e StarSearch2, o con programmi personalizzati, a seconda dei requisiti esatti dell'esperimento. Nota: Una pipeline di buona analisi dovrebbe consentire agli utenti di determinare una soglia per separare il vero spot di RNA dallo sfondo e statistiche quali le coordinate X, Y e Z (facoltative) e l'intensità di ogni spot, il numero di punti in ogni cella di output e possibilmente raccordo parametri come un modo per filtrare i falsi rilevamenti.</li>
</ol>

<ol><li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li>
<li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li>
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<li>Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-RNA+counting+reveals+alternative+modes+of+gene+expression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (12), 1263-1271 (2008).</li>
<li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309(2006).</li>
<li>Senecal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+modulate+c-Fos+transcriptional+bursts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcription factors modulate c-Fos transcriptional bursts.</a> Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).</li>
<li>Levesque, M. J., Ginart, P., Wei, Y., Raj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+SNVs+to+quantify+allele-specific+expression+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing SNVs to quantify allele-specific expression in single cells.</a> Nat Methods. 10 (9), 865-867 (2013).</li>
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<li>Ginart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+allele-specific+expression+in+single+cells+reveals+epigenetic+mosaicism+in+an+H19+loss-of-imprinting+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Visualizing allele-specific expression in single cells reveals epigenetic mosaicism in an H19 loss-of-imprinting mutant.</a> Genes Dev. 30 (5), 567-578 (2016).</li>
<li>Long, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mating+type+switching+in+yeast+controlled+by+asymmetric+localization+of+ASH1+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mating type switching in yeast controlled by asymmetric localization of ASH1 mRNA.</a> Science. 277 (5324), 383-387 (1997).</li>
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<li>Jourdren, L., Delaveau, T., Marquenet, E., Jacq, C., Garcia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CORSEN%2C+a+new+software+dedicated+to+microscope-based+3D+distance+measurements%3A+mRNA-mitochondria+distance%2C+from+single-cell+to+population+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">CORSEN, a new software dedicated to microscope-based 3D distance measurements: mRNA-mitochondria distance, from single-cell to population analyses.</a> RNA. 16 (7), 1301-1307 (2010).</li>
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<li>Carlile, T. M., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis+I+is+established+through+division-specific+translational+control+of+a+cyclin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin.</a> Cell. 133 (2), 280-291 (2008).</li>
<li>Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+landmark+events+in+meiosis+by+the+CDK+Cdc28+and+the+meiosis-specific+kinase+Ime2%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2.</a> Genes Dev. 17 (12), 1524-1539 (2003).</li>
<li>Dodson, A. E., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+capture+of+heterochromatin+dynamics+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Heritable capture of heterochromatin dynamics in Saccharomyces cerevisiae.</a> eLife. 4, e05007(2015).</li>
<li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nat Protoc. 7 (2), 408-419 (2012).</li>
<li>Youk, H., Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+single+mRNA+molecules+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Imaging single mRNA molecules in yeast.</a> Methods Enzymol. 470, 429-446 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi di divulgare.

Il protocollo presentato qui è derivato da altri protocolli pubblicati smFISH2,3,21,22,23ed è specificamente ottimizzato per lo sfondo del ceppo di lievito SK1. I parametri ottimizzati incluso il numero di cellulare, durata di fissazione, velocità di centrifugazione e durata, durata di digestione, buffer di digestione, sonda concentrazione e tampone di ibridazione. Altri parametri come la temperatura di ibridazione e durata non sono state ottimizzate. In questa sezione, condividiamo alcune note che aiuterebbero a adattare il presente protocollo a qualsiasi sfondo del ceppo di lievito e le condizioni di crescita di interesse.
La parete cellulare del lievito è una grande sfida contro ottenere immagini di alta qualità smFISH in lievito perché la parete cellulare impedisce la penetrazione della sonda. La digestione incompleta della parete delle cellule di zymolyase conduce alla inefficiente ibridazione del probe e alta variabilità della cellula--cellula nel segnale. Tuttavia, digestione eccessiva può rendere le cellule troppo fragile, portando a significativi cella perdita durante le fasi di lavaggio e delle cellule di scoppio durante la preparazione del vetrino per l'imaging. Così, ottimizzando la durata della digestione è cruciale. Si consiglia di condurre un esperimento pilota smFISH digerendo lo stesso campione per diverse quantità di tempo. Nel nostro caso, abbiamo ottenuto i migliori dati di smFISH se ci siamo fermati la digestione quando ~ 80% delle cellule è diventato non-rifrangente. In genere, per la stessa condizione di crescita, diversi ceppi mutanti genetici possono essere digeriti con tempi simili. Tuttavia, la durata della digestione differisce rispetto tra le diverse condizioni di crescita e le diverse fasi della meiosi nel lievito gemmante. Una volta determinata la tempistica, la qualità del smFISH è riproducibile. Nota che ceppi mutanti con la sintesi della parete cellulare difettoso e/o composizione, digestione potrebbe essere completata in meno di 15 minuti di uso di diversi lotti di zymolyase cambiano anche leggermente i tempi di digestione.
Concentrazione ottimale sonda è necessario per raggiungere un elevato rapporto segnale-rumore. Abbiamo progettato e acquistato le nostre sonde smFISH commercialmente. Buone sonde (spesso 20-mers) dovrebbero avere una percentuale di GC che vanno dal 35% al 45%, una distanza minima di 2 paia di basi tra sonde e bassa reattività crociata. Abbiamo usato una finestra di progettazione web-based sonda dal produttore per generare un elenco di sonde, e se c'erano abbastanza sonde da scegliere, useremmo l'algoritmo BLAST nel Database del genoma di Saccharomyces per eliminare le sonde con più di 17 coppie di basi sovrapposte con altre regioni genomiche. Abbiamo scelto il più fotostabile colorante fluorescente (CAL Fluor 590) per il set di sonda che accoppia alla regione unica di NDC80luti (CF 590) perché in questo set, il numero di sonde che ha soddisfatto tutti i criteri di cui sopra (20 Sonde) era inferiore al numero minimo consigliato dal produttore (~ 25 sonde). Dopo ricostituzione la soluzione della sonda seguendo le istruzioni del produttore, abbiamo fatto un 01:10 diluizione della soluzione di riserva e memorizzato la soluzione diluita in aliquote di 5-µ l a-20 ˚ c. Ogni aliquota è stata usata solo una volta. Per l'ottimizzazione, uno dovrebbe fare seriale diluizioni dal 01:10 diluito soluzione e prova che la concentrazione produce il miglior rapporto segnale-rumore. Si consiglia di effettuare una serie di diluizione di 1: 250, 1: 500, 1: 1000 e 1: 2000 dallo stock originale. Nel nostro caso, un fattore di diluizione di 1: 500 ha provocato il miglior rapporto segnale-rumore, per il CF 590 e la Q 670 set sonda.
Tempo di fissaggio ottimale è anche critico per il successo smFISH in lievito. Abbiamo trovato quella fissazione durante la notte a 4 ˚ c, anziché fissaggio a temperatura ambiente per 20 min, ha migliorato significativamente la coerenza e la qualità dei risultati smFISH per campioni meiotici. Anche se non è stato testato come una notte fissazione potrebbe avere un impatto campioni vegetativi, fissazione a temperatura ambiente ha funzionato bene per questa condizione di crescita. Così, per ottimizzare il protocollo smFISH per nuovi ceppi o condizioni di crescita, si consiglia a partire con il tempo breve fissazione a temperatura ambiente e aumentando il tempo di fissazione se alta variabilità del segnale viene rilevato.
Rispetto ad altri protocolli pubblicati3,22,23, il nostro protocollo utilizza l'inibitore di RNAsi VRC durante digestione e una maggiore concentrazione di VRC durante l'ibridazione. Aggiunta di VRC in questi due passaggi migliorato la consistenza dei risultati smFISH, possibilmente con una migliore conservazione molecole di RNA contro attività di nucleasi, che possono essere introdotti mediante il mix di zymolyase (l'enzima è purificata da estratti grezzi e può contenere RNasi contaminanti). Pertanto, si consiglia di utilizzare la quantità di VRC come elencati nel nostro protocollo o persino più alte concentrazioni di VRC per l'ottimizzazione.
Una parte significativa delle cellule può essere persa durante le fasi di lavaggio in tampone B e il tampone di lavaggio di formammide. Per ridurre la perdita di cellule, uno potrebbe aumentare la velocità di centrifugazione. Nel nostro caso, usando un'ad alta velocità (21.000 x g) per appallottolare i nostri campioni durante il tampone B lava perdita delle cellule significativamente ridotta. Tuttavia, le cellule diventano molto fragili dopo zymolyase digestione, quindi non è consigliabile modificare la velocità di centrifugazione. Al contrario, si consiglia di utilizzare i tubi di bassa aderenza da scientifica USA, che molto utile per agglomerare le cellule durante i lavaggi in tampone di lavaggio di formammide. Nel complesso, il nostro protocollo è in grado di generare costantemente un monostrato di cellule abbastanza dense per l'imaging efficiente. In genere, 7 campi di vista dovrebbe produrre > 130 celle adatte per la quantificazione.
Infine, è importante determinare i parametri ottimali per e le uscite necessarie da analisi dell'immagine. Per rilevare punti di smFISH, programmi di analisi pubblicata filtrare le immagini raw con kernel gaussiano per rimuovere il segnale di fondo e chiedono agli utenti di determinare il rapporto segnale-rumore da utilizzare per ogni set di immagini2,17. Purtroppo, non c'è attualmente un unico standard con cui vengono determinati i parametri appropriati, e così alcune prove empiriche di queste diverse impostazioni è necessaria. Per impostare i parametri necessari per ognuno di questi passaggi, è necessario in modo iterativo diversi set di parametri di input e controllare quanto bene i risultati ottenuti da ogni insieme che corrisponde dal conteggio manuale in alcune cellule rappresentante. Una volta che viene trovato un set di parametri, può essere utilizzato per la maggior parte delle immagini ottenute nonostante le diverse condizioni di crescita e di ambiti di provenienza genetici.
Inoltre, uno può testare se-intensità massima di proiezione delle immagini smFISH può essere eseguita prima di quantificazione22. Questo passaggio semplifica l'algoritmo di rilevamento spot e riduce notevolmente i tempi di formazione immagini, anche se a costo di alcune informazioni potenzialmente utili su singoli punti, ad esempio la loro localizzazione subcellulare. Nel nostro caso, il numero di molecole di mRNA prodotta dal gene NDC80 era abbastanza basso che le macchie erano ben separate dopo questa elaborazione (non è rara per le trascrizioni in erba lievito3,7). In casi dove la colocalizzazione analisi è critico, la pipeline di analisi ha bisogno determinare la posizione di ogni spot di smFISH in ogni canale per valutare colocalizzazione. In base alle specifiche domande viene chiesto, altre informazioni come l'intensità di ogni spot possono anche bisogno di essere estratto dalla pipeline per ulteriori analisi. Ottimizzando la chiave interviene il protocollo e la pipeline di analisi di immagine è fondamentale per ottenere alta qualità di smFISH dati per studiare la questione di interesse.

Regolazione dinamica dell'espressione genica guida lo sviluppo di un organismo, come pure la sua risposta a stress ambientali, infezione ed i cambiamenti nel metabolismo. Gli studi che si concentrano sulla regolazione trascrizionale si basano su tecnologie che misurano abbondanza di RNA. Un tale metodo, definito ibridazione di singola molecola fluorescenza in situ (smFISH), è utilizzato per il rilevamento delle singole molecole di RNA in cellule singole1,2. Questo metodo consente la misurazione della cellula--cellula variabilità nell'espressione genica e la determinazione della localizzazione intracellulare di RNA.
La tecnica più comunemente utilizzati smFISH, rilevazione di una singola molecola di RNA richiede sonde di DNA breve multiple (spesso ~ 48 20-mer sonde) che sono complementari a RNA dell'obiettivo e sono coniugati alla stessa tintura fluorescente. Associazione di una singola sonda fluorescente si traduce in segnale debole, ma il segnale dall'insieme di tutte le sonde è robusto. Questa caratteristica migliora notevolmente il rapporto segnale-rumore, perché anche se una singola sonda può esibire fuori bersaglio associazione, tale segnale dovrebbe essere molto debole rispetto a quella del bersaglio RNA molecola3. All'interno di errore di rilevazione, il numero di molecole di RNA può essere contato e confrontato tra diverse condizioni di crescita e tra diversi mutanti.
Dal suo primo sviluppo, smFISH è stato adattato per studiare vari aspetti dell' espressione genica4, come trascrizione allungamento1,2,5,6, trascrizionale scoppio7 di splicing , 8 , 9, espressione allelica intracellulare10,11,12e RNA localizzazione13,14,15. Recentemente, abbiamo usato questo metodo per studiare l'espressione delle due isoforme di trascrizione del gene stesso, in cui l'isoforma breve trascrizione (NDC80ORF) ha la sua intera sequenza ha condiviso con l'isoforma lunga (NDC80luti )16. Per identificare in modo univoco le due isoforme di mRNA, abbiamo usato due sonda set: un set è specifico per la sequenza univoca di NDC80luti, e l'altro insieme, coniugato a un altro colorante fluorescente, si lega alla regione comune delle due isoforme. NDC80luti RNA viene identificato come un posto colocalized con entrambi i segnali fluorescenti, considerando che la NDC80ORF RNA è quella che contiene solo il segnale dal set sonda comune. Poiché il numero della NDC80ORF trascrizioni è calcolato con un metodo di "sottrazione", ad alta efficienza dell'ibridazione della sonda e un alto rapporto segnale-rumore sono necessari con fiducia smFISH macchie di identificare e ridurre l'errore propagazione.
Questo articolo descrive un protocollo ottimizzato per l'esecuzione di smFISH nel lievito Saccharomyces cerevisiae. In questo protocollo, il numero di cellulare, tempo di fissazione, tempo di digestione, digestione buffer, sonda concentrazione e ibridazione buffer utilizzato per gli esperimenti di smFISH sono state ottimizzate per lo sfondo di SK1 ceppo di Saccharomyces cerevisiae in fase vegetativo crescita o meiosi. Tuttavia, notiamo anche in questo manoscritto: (1) il metodo per controllare la qualità dei dati di smFISH dopo l'acquisizione dell'immagine e (2) i passaggi nel protocollo che potrebbero richiedere ulteriore ottimizzazione per gli sfondi di ceppo diverso e le condizioni di crescita.

<table><tbody><tr><td>BSA, senza RNasi (50 mg/mL)</td><td>Ambion</td><td>AM2616</td><td>Conservare a -20 °C.</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C3515</td><td>Negozio a 4 ° deg C per breve termine. Vortice prima dell'uso.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9564</td><td>Negozio a -20 C dopo ricostituzione in acqua. Proteggere dalla luce.</td></tr><tr><td>50% destrano solfato</td><td>Milli Pore</td><td>S4030</td><td>Conservare a temperatura ambiente. Liquido molto viscoso. Maneggiare con pazienza.</td></tr><tr><td>E. coli tRNA</td><td>Sigma</td><td>R4251</td><td>Conservare a -20 C in aliquote dopo ricostituzione in acqua.</td></tr><tr><td>Etanolo (100%, 200 proof)</td> <td>vari</td><td></td><td>infiammabili.</td></tr><tr><td>37% Formaldeide</td><td>Fisher</td><td>F79-500</td><td>Conservare a temperatura ambiente. Tossico. Utilizzare e smaltire con cautela.</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Ambion</td><td>AM9342</td><td>Conservare a 4 °C. Aprire dopo che la temperatura si è stabilizzata a temperatura ambiente per prevenire l'ossidazione. Tossico. Utilizzare e smaltire con cautela.</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>vari</td><td></td><td>Conservare a 4 &deg; C dopo la dissoluzione in acqua priva di nucleasi.</td></tr><tr><td>Glucosio ossidasi</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>Conservare a -20 &deg; C in aliquote dopo ricostituzione in 50 mM di NaOAc, pH 5.</td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td>Conservare a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio (monobasico e bibasico)</td><td>vari</td><td></td><td>Conservare a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Libreria di sonde, diluita in TE, pH 8,0&nbsp;</td><td>Negozio di tecnologie</td><td></td> Biosearch <td>a -20 C in aliquote (5 &micro; L) dopo la ricostituzione in TE pH 8.0, seguendo le istruzioni del produttore. Proteggi dalla luce.</td></tr><tr><td>Sorbitolo</td><td>vari</td><td></td><td>Conservare a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>Ambion</td><td>AM9763</td><td>Conservare a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>TE, pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9849</td><td>Conservare a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>1 M Tris, pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9856</td><td>Conservare a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma</td><td>238813</td><td>Store a -20 C in aliquote.</td></tr><tr><td>200 mM Complesso vanadilribonucleosidico (VRC)</td><td>NEB</td><td>S1402S</td><td>Conservare a -20 &deg; C in aliquote dopo la ricostituzione, seguendo le istruzioni del produttore.</td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>MP Biomedicals</td><td>08320932</td><td>negozio a -20 gradi C in aliquote dopo ricostituzione in acqua.</td></tr><tr><td>Provette a bassa aderenza</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2600</td><td>Conservare a temperatura ambiente.</td></tr></tbody></table>

singola molecola l'ibridazione in situ (smfish) analisi in crescita vegetativa lievito germogliante e meiosi

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Ibridazione di singola molecola fluorescenza in situ (smFISH) è una tecnica potente per studiare l'espressione genica in cellule singole grazie alla sua capacità di rilevare e contare le singole molecole di RNA. Complementari ai metodi basati su sequenziamento profondi, smFISH fornisce informazioni circa la variazione della cellula--cellula in abbondanza di trascrizione e la localizzazione subcellulare di un determinato RNA. Recentemente, abbiamo usato smFISH per studiare l'espressione del gene NDC80 durante la meiosi nel lievito gemmante, in cui trascrizione due isoforme esiste e l'isoforma breve trascrizione ha sua intera sequenza ha condiviso con l'isoforma lunga. Per identificare con sicurezza ogni isoforma di trascrizione, abbiamo ottimizzato smFISH noti protocolli ed abbiamo ottenuto alta consistenza e qualità dei dati di smFISH per i campioni acquisiti durante in erba lievito meiosi. Qui, Descriviamo questo protocollo ottimizzato, i criteri che utilizziamo per determinare se si ottiene alta qualità di dati di smFISH e alcuni suggerimenti per l'implementazione di questo protocollo in altri ceppi di lievito e le condizioni di crescita.

Questa singola molecola fluorescenza in situ di ibridazione protocollo è ottimizzato per quantificare il numero di molecole di RNA in lievito durante la meiosi e crescita vegetativa.

Singola molecola l'ibridazione In Situ (smFISH) analisi in crescita vegetativa lievito germogliante e meiosi

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

L'obiettivo generale di questa ibridazione in situ di RNA a singola molecola ottimizzata, o smFISH, è quello di rilevare e quantificare le singole molecole di RNA su base cellulare durante la crescita vegetativa e la meiosi del lievito in gemmazione. Questo metodo rivela la variabilità da cellula a cellula nell'espressione genica sulla localizzazione dell'RNA subcellulare ed è quindi una tecnica potente per studiare la regolazione genica. A parte le informazioni uniche che possono essere rivelate da smFISH, il vantaggio principale della tecnica è che, una volta ottimizzata, è robusta e altamente riproducibile.Per la dimostrazione di questo protocollo verrà utilizzata una coltura meiotica. Per fissare la coltura in 3% di formaldeide, aggiungere 1840 microlitri di coltura a 160 microlitri di 37% di formaldeide in una provetta da microcentrifuga da due millilitri. Capovolgere circa cinque volte per mescolare.Posizionare il tubo su un tamburo a rulli a temperatura ambiente per 20 minuti. Dopo 20 minuti, continuare a fissare a quattro gradi Celsius con rotazione durante la notte. Il giorno seguente, prepararsi per la digestione scongelando prima 200 millimolari di complessi vanadilribonucleosidici, o VRC, a 65 gradi Celsius per almeno 10 minuti.Per preparare la miscela master per la digestione, pipettare prima 2125 microlitri di tampone B in una provetta da 15 millilitri. Quindi agitare il VRC caldo per cinque secondi per risospenderlo completamente e aggiungere 200 microlitri di VRC al tubo da 15 millilitri. La miscela dovrebbe apparire di colore verde brunastro chiaro.Centrifugare il campione meiotico a 21.000 x g per un minuto e mezzo a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante con cura, posizionando la punta del vuoto sul lato opposto del pellet per evitare di disturbare il pellet. Risospendere le cellule in un millilitro e mezzo di tampone B freddo pipettando su e giù per mescolare.Centrifugare a 21.000 x g per un minuto e mezzo. Rimuovere la maggior parte del liquido mediante aspirazione a vuoto, lasciando circa 100 microlitri. Risospendere le cellule in un millilitro e mezzo di tampone freddo B. Centrifugare i campioni, rimuovere il liquido e risospendere nuovamente le cellule in un millilitro e mezzo di tampone freddo B.Centrifugare a 21.000 x g per un minuto e mezzo. Aspirare completamente il liquido mediante pipettaggio. Risospendere le cellule in 425 microlitri di master mix di digestione e agitare brevemente.Aggiungere cinque microlitri di zimoliasi al tubo e agitare per due o tre secondi per mescolare. Posizionare il tubo su un tamburo a rulli e digerire a 30 gradi Celsius per 15-30 minuti. Dopo 15 minuti, controllare le cellule al microscopio ogni cinque minuti e interrompere la digestione quando circa l'80% delle cellule appare non trasparente e non rifrattivo.Centrifugare la provetta a 376 x g per tre minuti. Rimuovere completamente il surnatante. Risospendere delicatamente le cellule con un millilitro di tampone B pipettando su e giù una o due volte per mescolare.Centrifugare la provetta e rimuovere il tampone. Risospendere delicatamente le cellule in un millilitro di etanolo al 70% e incubare a temperatura ambiente per tre ore e mezza o quattro. Per iniziare la procedura di ibridazione, centrifugare la provetta di cellule a 376 x g per tre minuti.Rimuovere 500 microlitri di etanolo al 70% dal tubo. Pipettare delicatamente su e giù per risospendere le cellule rimanenti e trasferire le cellule in una provetta a bassa aderenza. Il trasferimento del campione in una provetta a bassa aderenza è fondamentale per prevenire l'eccessiva perdita di cellule durante i successivi lavaggi con formammide.Centrifugare la provetta a bassa aderenza e rimuovere tutto l'etanolo. Aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio al 10% di formammide alla provetta e pipettare delicatamente su e giù due o tre volte per risospendere le cellule. Lasciare riposare le cellule a temperatura ambiente per circa 20 minuti mentre si preparano le soluzioni di ibridazione, come descritto nel protocollo di testo.Centrifugare il campione e rimuovere il surnatante nei rifiuti pericolosi. Aggiungere almeno 50 microlitri di ciascuna soluzione di ibridazione al tubo e agitare il tubo per mescolare. Incubare a 30 gradi Celsius su un tamburo a rulli per almeno 16 ore al buio.Quando l'ibridazione è completa, posizionare il tubo di cellule in una scatola ricoperta di alluminio per proteggerlo dalla luce. Centrifugare il campione a 376 x g per tre minuti. Rimuovere il surnatante nei rifiuti pericolosi mediante pipettaggio.Risospendere il campione in un millilitro di tampone di lavaggio al 10% di formammide pipettando delicatamente su e giù due o tre volte. Rimetti il tubo di cellule in una scatola ricoperta di alluminio per proteggerlo dalla luce e incuba a 30 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo 30 minuti, centrifugare il campione.Rimuovere il surnatante dai rifiuti pericolosi mediante pipettaggio, lasciando circa 50 microlitri. Risospendere il campione in un millilitro di soluzione DAPI pipettando delicatamente su e giù due o tre volte. Ancora una volta, posizionare il tubo di cellule nella scatola ricoperta di alluminio e incubare a 30 gradi Celsius per 30 minuti.Centrifugare il campione e rimuovere completamente il surnatante mediante pipettaggio. Per i campioni che non verranno sottoposti a imaging immediato, risospendere il pellet in 50 microlitri di tampone GLOX senza enzimi. Pipettare su e giù tre o quattro volte per mescolare.Conservare nella scatola coperta di alluminio a quattro gradi Celsius fino al momento dell'immagine. Per ottenere immediatamente l'imaging dei campioni, aggiungere da 15 a 20 microlitri di tampone GLOX con enzimi. Pipettare cinque microlitri su un vetrino coprioggetti e mettere il vetrino su un vetrino.Posizionare una salvietta da laboratorio sopra il vetrino dove è posizionato il vetrino coprioggetti. Premere delicatamente sulla salvietta per impostare il vetrino. Posizionare il vetrino in una scatola coperta da un foglio di alluminio per il trasferimento nella sala del microscopio.Questo protocollo è stato utilizzato per esaminare l'espressione del gene NDC80, che esprime due isoforme di mRNA. L'isoforma del trascritto lungo non decodificato ha un'estensione di 400 coppie di basi e cinque primi rispetto all'isoforma corta. Sono state progettate due serie di sonde.L'insieme CF 590 si lega all'unica regione dei cinque primi dell'isoforma lunga, mentre l'insieme Q 670 si lega alla regione comune di entrambe le isoforme. In condizioni ottimizzate, sono stati chiaramente identificati punti smFISH distinti per entrambi i set di sonde. I due set di sonde sono stati utilizzati per studiare l'espressione di NDC80 durante la crescita vegetativa e la meiosi.Nelle celle vegetative, è stato rilevato un segnale robusto dal set di sonde Q 670, ma non dal set di sonde CF 590. Al contrario, un segnale robusto da entrambi i set di sonde è stato rilevato nella profase meiotica e la maggior parte degli spot aveva un segnale co-localizzato. L'analisi del Northern blot ha confermato che l'isoforma lunga era espressa specificamente nella meiosi.È stato riscontrato che le cellule vegetative hanno una mediana di cinque brevi trascritti di isoforma per cellula, mentre nelle cellule di profase meiotica, la mediana è scesa significativamente a quattro trascritti per cellula. Nella profase meiotica, il numero mediano di trascritti di isoforme lunghe per cellula era 21 e il 100% delle cellule esprimeva il trascritto. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 72 ore se eseguita correttamente.Durante il tentativo di questa procedura, è importante innanzitutto ottimizzare la durata della digestione e la concentrazione di sonde smFISH necessarie per ottenere il rapporto segnale/rumore ottimale. Inoltre, ricordarsi di aggiungere VRC durante la digestione e l'ibridazione notturna per prevenire l'attività della nucleasi. Con questo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per esplorare la regolazione genica dinamica e la localizzazione dell'RNA subcellulare.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire il FISH a RNA molecolare singolo nella meiosi del lievito in gemmazione.

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Forniamo un metodo di base riproducibile per la microscopia a lungo termine del ciclo di vita sessuale del lievito di fissione. Con i piccoli aggiustamenti descritti, il protocollo presentato consente di concentrare la ricerca su diverse fasi del processo riproduttivo.

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Questo manoscritto descrive un metodo per l'etichettatura individuale RNA messaggero (mRNA) trascrizioni con sonde di DNA fluorescente etichettati, per l'uso in singola molecola fluorescenza in situ (smFISH) gli esperimenti di ibridazione in Escherichia coli. smFISH è un metodo di visualizzazione che permette la rilevazione simultanea, la localizzazione e quantificazione delle singole molecole di mRNA in singole celle fisse.

Metodo per l'etichettatura di trascrizioni in cellule individuali Escherichia coli per singola molecola di fluorescenza In Situ gli esperimenti di ibridazione

Questo manoscritto presenta un metodo dettagliato per la generazione di X-cromosoma braccio sonde e performanti in situ ibridazione di fluorescenza (pesce) per esaminare lo stato della sorella coesione cromatidio in prometafase e metafase sono arrestato  Drosofila ovociti. Questo protocollo è adatto a determinare se la coesione meiotica braccio è intatto o perturbato in differenti genotipi.

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Qui, presentiamo l'imaging a cellule vive che è un metodo di microscopia non tossico che consente ai ricercatori di studiare il comportamento delle proteine e la dinamica nucleare nelle cellule di lievito di fissione viventi durante la mitosi e la meiosi.

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Questo protocollo descrive un'applicazione di fluorescenza a singola molecola in ibridazione situ (smFISH) per misurare la cinetica in vivo della sintesi e della degradazione dell'mRNA.

Sondare la cinetica dell'mRNA nello spazio e nel tempo in Escherichia coli utilizzando la fluorescenza a singola molecola a due colori in ibridazione situ

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La microscopia time-lapse è uno strumento prezioso per studiare la meiosi nel lievito in erba. Questo protocollo descrive un metodo che combina la sincronizzazione del ciclo cellulare, la microscopia time-lapse e l'esaurimento condizionale di una proteina bersaglio per dimostrare come studiare la funzione di una proteina specifica durante la segregazione cromosomica meiotica.

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