Name: Valutazione della resistenza agli inibitori della tirosina chinasi di un interrogatorio di trasduzione del segnale da matrici di anticorpo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Scopri come valutare la resistenza agli inibitori della tirosina chinasi utilizzando matrici di anticorpo per analizzare le modifiche post-traduzionali nelle vie di segnalazione cellulari. Questo metodo fornisce informazioni rapide sulla fosforilazione.

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Siamo grati per il generoso sostegno finanziario del Lawrence J. Ellison Istituto di Transformative medicina di USC (un regalo di David Agus). Apprezziamo il sostegno dell'autunno Beemer e Lisa Flashner che portano alla generazione e pubblicazione di questo manoscritto. Ringraziamo Laura Ng per il suo sostegno amministrativo.

1. estrazione di proteine
<ol><li>Piastra 5 x 106 cellule su una piastra di coltura del tessuto di 10 mm (o beuta) in una cappa di coltura del tessuto. Contare le celle al momento della placcatura con un contatore automatico delle cellule o un emocitometro. In alternativa, stimare il numero di celle.</li>
	<li>Sciacquare le cellule coltivate sulla piastra di 10 mm (o beuta) accuratamente 3 x 10 ml di tampone fosfato salino (PBS) (pH = 7.4). Assicurarsi di rimuovere tutti i PBS prima di aggiungere il buffer di lisi. Nota: Il buffer di Lisi è di solito fornito con il kit. In caso contrario, utilizzare un tampone del saggio di radioimmunoprecipitation (RIPA) o qualsiasi altri buffer di lisi delle cellule contenenti un cocktail di inibitori di proteasi e fosfatasi.</li>
	<li>Lyse 1 x 107 cellule/mL di cellule nel buffer di lisi aggiungendo la giusta quantità di buffer per le cellule e raschiando le cellule con un raschietto di cella nel buffer di lisi. (ad es., per le cellule HeLa e MiaPaCa-2, utilizzare 600 µ l per piastra di 10 cm).</li>
	<li>Pipettare lisato su e giù (circa 10 volte) e trasferirlo in una nuova provetta da 1,5 mL.</li>
	<li>Incubare i lisati per 30 min a 4 ° C, preferibilmente in un rocker/agitatore. Premere il lisato attraverso una siringa con un ago da 27 G x 10 assicurare un'interruzione corretta della cell membrane(s). In alternativa, Sonicare lisato. Memorizzare i lisati a-20 ° C o utilizzarli immediatamente.</li>
	<li>Centrifugare il lisato a 14.000 x g a 4 ° C per 15 min e trasferire il surnatante in una provetta pulita da 1,5 mL.</li>
	<li>Quantificare la quantità di proteina totale di bicinconinico dosaggio acido (BCA)20 o un equivalente come Lowry o Bradford e continuare con almeno 50 – 400 μg. Utilizzare le proteine immediatamente o aliquota e congelare/negozio a-70 ° C (evitare più cicli di gelo-disgelo).</li>
</ol>2. umano Phosphokinase Array
<ol><li>Portare tutti i reattivi a temperatura ambiente prima di iniziare (per circa 1 h). Nota: Tutti i reagenti ed usura in plastica sono inclusi nel kit.</li>
	<li>Preparare tutto il fresco di reagenti (buffer di matrice) prima di iniziare la procedura seguendo le istruzioni del produttore (a seconda della scelta di obiettivi/matrici, le istruzioni potrebbero variare leggermente).</li>
	<li>Ricostituire i cocktail di anticorpo di rilevazione in 100 μL di acqua deionizzata o seguire le istruzioni del produttore dovrebbe si differenziano per la provetta da 1,5 mL fornita.</li>
	<li>Preparare il tampone di lavaggio 1X diluendo 40 mL di tampone di lavaggio in 960 mL di acqua deionizzata: 25x e mescolare capovolgendo. Nota: I cristalli si dissolvono a temperatura ambiente. Il buffer può ingiallire nel tempo, ma continuerà a funzionare.</li>
	<li>Pipettare 1 mL di buffer di matrice 1 in tutti i pozzetti di un multi-vassoio 8 pozzetti (o 2 mL in un multi-vassoio 4 pozzetti).</li>
	<li>Con pinzette piatto-punta, togliere le membrane di matrice tra i fogli protettivi e metterli nei pozzetti. Assicurarsi che i numeri sulla membrana siano rivolti verso l'alto. Nota: Al momento dell'immersione, il colorante sulla membrana scomparirà.</li>
	<li>Coprire la piastra con un coperchio e incubare su un dondolo shaker a piattaforma per 60 min a temperatura ambiente. Nota: Questo è il passo di blocco di membrana.</li>
	<li>Durante il periodo di incubazione, è necessario preparare i campioni della proteina. Aggiungere 50 – 100 μg di proteine totali. Diluire il lisato, avendo un volume massimo di 334 μL, con buffer di Lisi ad un volume finale di 1 mL. Nota: 50 – 100 μg di proteina totale è sufficiente di solito.</li>
	<li>Aspirare con cura il buffer di matrice 1 e incubare le membrane con 1 mL dei campioni durante la notte a 2 – 8 ° C in un agitatore di piattaforma a dondolo. Nota: Non toccare/zero le membrane.</li>
	<li>Il giorno successivo, lavare la matrice accuratamente rimuovendo ogni matrice e posizionarla in singoli contenitori di plastica (circa 8 x 11 cm2) con 20 mL di tampone di lavaggio 1x 1. Lavare le membrane 3 x 10 min su una piattaforma a dondolo in 1x tampone di lavaggio a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere 20 μL dell'anticorpo ricostituito cocktail dal passaggio 2.3 a 1 mL di tampone di matrice 2 1x. Aggiungere 1 mL di questa soluzione ad ogni 8-pozzetto per essere utilizzato.</li>
	<li>Rimuovere con cautela le membrane dai vassoi di lavaggio. Asciugare il bordo inferiore su carta assorbente per rimuovere qualsiasi tampone di lavaggio in eccesso e trasferirli nuovamente dentro il cassetto contenente i cocktail di anticorpi. Coprire la piastra con il coperchio e incubare per 2 ore a temperatura ambiente su una piattaforma a dondolo. Sciacquate i vassoi usati con dH2O bene e asciugarli per un successivo utilizzo.</li>
	<li>Ogni matrice di rimuovere delicatamente e inserire nuovamente i contenitori di plastica pulito individuali (circa 8 x 11 cm2) con 20 mL di tampone di lavaggio 1X. Lavare 3 x 10 min con il tampone di lavaggio su una piattaforma a dondolo a temperatura ambiente.</li>
	<li>Diluire la streptavidina-HRP (fornito con il kit) o tintura di streptavidina-fluorescente (per una rilevazione più quantitativa) 1:1,000 in 1x tampone di matrice 2 in una provetta da 15 mL.</li>
	<li>Restituire le membrane nei piatti 8 pozzetti contenenti la soluzione HP e li Incubare 30 min a temperatura ambiente su una piattaforma a dondolo (se usando la fluorescenza, avvolgere il vassoio nella carta stagnola per evitare qualsiasi esposizione alla luce).</li>
	<li>Rimuovere il tampone in eccesso ponendo la membrana tra 2 pezzi di 5 mm di carta 3M. Per l'imaging con un imager chemiluminescente/pellicola di raggi x, incubare le membrane secche con una soluzione di rilevamento di HRP (mescolare le due soluzioni chemiluminescente 1:1) per 3 min e posizionare la membrana in un foglio di plastica trasparente di protezione. Nota: Membrane(s) secchi può essere anche inserito in un imager fluorescente per rilevare il segnale fluorescente; ridurre al minimo l'esposizione alla luce per la membrana prima di formazione immagine. Per una quantificazione dei file x-ray film o imager, evitare la sovraesposizione. La maggior parte a chemiluminescenza/fluorescente Imager hanno una funzione per evitare una saturazione del segnale.</li>
</ol>3. analisi dei dati
<ol><li>ImageJ, un'immagine elaborazione programma21, di scaricare e installare il software.</li>
	<li>Aprire ImageJ facendo doppio clic sul 'Icona ImageJ'. Selezionare l'immagine per essere analizzati facendo clic su 'File' nella barra dei menu, quindi selezionare 'Apri' dal menu a discesa e Sfoglia i file del computer per l'immagine di interesse. Fare clic sul file per aprirlo.</li>
	<li>Invertire l'immagine per l'analisi (macchie nere su fondo bianco a macchie bianche su sfondo nero) facendo clic su 'Modifica' nella barra dei menu e selezionando 'Invert' dal menu a discesa.</li>
	<li>Selezionare l'icona' ovale' dalla barra degli strumenti (la seconda opzione nella barra degli strumenti di ImageJ). Cliccando sulla foto (traversa nera) e muovendo il mouse per disegnare un cerchio o ovale. Regolare la dimensione/forma di cerchio o ovale per circondare i puntini sulla macchia del puntino.</li>
	<li>Fare clic su 'Analizzare' nella barra dei menu e quindi selezionare 'Misura' dal menu a discesa per aprire automaticamente una nuova finestra con i valori dell'area selezionata (zona, media, minimo e massimo).</li>
	<li>Spostare l'area circolare trascinando il cerchio dal centro (mettere il punto di destra freccia nel mezzo) e posizionarlo intorno alla zona di misurazione (dot) successiva. Misurare tutti i punti di interesse, il controllo positivo, controllo negativo e lo sfondo per l'analisi. Nota: Il controllo negativo è il PBS, lo sfondo è una parte della membrana senza alcuna macchia (qualsiasi parte farà) e il controllo positivo è un controllo fornito dal produttore.</li>
	<li>Selezionare i punti di controllo negativo di PBS e sottrarre il valore da ogni posto. Media intensità per ogni coppia di punti duplicati che rappresentano ogni recettore tirosina chinasi (RTK). Ogni intensità media può essere correlato al controllo per calcolare la variazione di piega.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Approcci che combinano molte letture biologiche sono intrinsecamente più accurate rappresentazioni del macchinario cellulare in un esperimento effettuato. L'avvento di matrici di fosfo-anticorpo consente una rapida caratterizzazione del modello di modifiche che possono essere più informativo dello stato di aggiornamento di ogni singola proteina. Il flusso di lavoro generale per l'applicazione di matrici di fosfo-anticorpo si basa su una modifica in serina, treonina o tirosina. In questo esempio viene focalizzata su che c...

L'implementazione clinica degli inibitori mirati tirosina chinasi (TKI) ha trasformato il trattamento del cancro, fornendo i medici con strumenti efficaci per indirizzare le proteine specifiche che promuovere la trasformazione neoplastica. Questi composti inibiscono o bloccano la fosforilazione delle proteine bersaglio di tirosina chinasi1,2. TKI sono state sviluppate in parte perché le alterazioni genetiche in chiave di vari geni di segnalazione sono sufficienti per l'inizio del cancro di unità e progressione [ad es., recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR), tirosina-chinasi di proto-oncogene Src (SRC), BCR-ABL e il recettore del fattore di crescita epidermico umano 2 (HER2)]3,4. L'impatto di TKI il ciclo cellulare5 e la segnalazione molecolare vie6 rappresenta una trasformazione dal non mirati per il trattamento del cancro molecolarmente guidate. Il vantaggio chiave di TKI versus chemioterapia è i tassi di risposta aumentata e il minor rischio di tossicità per le cellule sane7. Di conseguenza, sta aumentando l'attenzione sulla ricerca e lo sviluppo del romanzo TKI.
Accesso ai risultati di sequenziamento genomico iniziato con il progetto genoma umano8,9,10 e continua ancora oggi con vari generazione (NextGen) cancro sequenziamento sforzi [ad es., The Cancer Genome Atlas (TCGA)11,12]. Questo ha ispirato molte metodologie sperimentali che forniscono informazioni simultanee su migliaia di geni e/o forniscono imparziale istantanee di geni o proteine modulate da perturbazioni biologiche13. Poiché il regolamento della funzione cellulare avviene a più livelli, dalla trascrizione di geni per la modificazione post-traduzionale delle proteine e la loro attività, una completa comprensione degli eventi controllando la funzione cellulare sarà in definitiva richiede un'integrazione di dati da varie letture biologiche. La possibilità di monitorare i livelli di RNA messaggero (mRNA) di migliaia di geni con una risoluzione di singole cellule gene ha aumentato la capacità di fare inferenze circa la funzione del gene e le interazioni a livello di intero genoma. Tuttavia, l'interpretazione di matrici di espressione genica sarà sempre intrinsecamente incompleta senza l'integrazione di altri livelli del regolamento: vale a dire, i livelli di espressione della proteina, gli Stati di modificazione della proteina e la post-traduzionale della proteina modifiche (fosforilazione, ubiquitylation, metilazione, ecc.). Qui, descriviamo l'utilità delle matrici di anticorpo come mezzo per interrogare le modificazioni post-traduzionali delle componenti importanti di segnalazione in funzione delle diverse condizioni in un singolo esperimento14,15, 16.
Matrici di fosfo-anticorpo possono essere impiegate per distinguere e analizzare i cambiamenti nelle vie di trasduzione segnale16. Questi possono derivare da una modificazione genetica o trattamenti di linee cellulari con gli inibitori della chinasi, chemioterapici, stress causato da inedia di privazione, ipossia o nel siero di glucosio. Di nota, di resistenza ai farmaci o di un gene specifico - up o downregulation può anche causare cambiamenti nelle vie di trasduzione segnale17.
Resistenza ai farmaci, ad esempio, possa derivare da mutazioni dell'obiettivo della droga per evitare la sensibilità. Nel cancro del polmone, noto le mutazioni di EGFR rendono il cancro insensibile a certe TKI, ma più suscettibili di altri. Vie di segnalazione alternativa può essere attivato su mutazione17. Come applicazione più ampia per l'identificazione delle vie di trasduzione del segnale coinvolte nella resistenza e ipossia, ecc., matrici di fosfo-anticorpo forniscono ulteriori approfondimenti, e di conseguenza capire, i meccanismi coinvolti.
Tecnologie che permettono una valutazione delle modifiche della proteina rappresentano una componente importante della biologia dei sistemi, perché spesso servono una funzione regolatrice, ad esempio modulando l'attività di un enzima o le interazioni fisiche tra proteine. L'importanza delle modificazioni post-traduzionali è illustrata dal ruolo di fosforilazione della proteina in quasi tutti i segnale extracellulare indotta trasduzione vie18. Tradizionalmente, l'identificazione delle chinasi o lo stato di fosforilazione di proteine anche potrebbe essere determinato da analisi Western blot, soprattutto se il ricercatore è interessato a soltanto 1 – 5 destinazioni. Tuttavia, Western blot sono molto selettivi e può essere orientato alla conoscenza preventiva e potrebbe perdere importanti obiettivi di conseguenza. Anticorpo Array forniscono una lettura di medio-velocità effettiva di bersagli multipli incorporando vari anticorpi di cattura [tortiera specifica fosforilato tyrosine(s), anti-ubiquitina, ecc.], su una matrice solida (ad es., vetro o nitrocellulosa). Anticorpi secondari forniscono informazioni su proteine specifiche in un formato di base di sandwich ELISA (Figura 1). Questo test diventa più potente e pertinenti come più bersagli sono di interesse o la conoscenza è limitata15. Il phospho-matrici sono più largamente impiegabili come possono confrontare fosforilazione come pure la quantità generale di proteine di una più ampia varietà di obiettivi in un esperimento e fornire una quantificazione significativamente migliorata tramite spettrometria di massa. Questa tecnica non è applicabile per l'identificazione dei siti di fosforilazione di nuove o sconosciute.
Su larga scala basati sulla spettrometria di massa proteomica potrebbe essere impiegato per identificare i siti di fosforilazione specifico di proteine19. Sebbene questa tecnica può enumerare migliaia di eventi post-traduzionali, richiede strumentazione costosa, pipeline sperimentale dedicati e un know-how computazionale che sono oltre la portata della maggior parte dei ricercatori.
Le matrici anticorpo forniscono una lettura simultanea su varie proteine letture16. Questi possono essere cambiamenti nella proteina ubiquitylation (ubiquitina matrice) o fosforilazione. Il vantaggio principale di questa tecnologia di matrice è che esso fornisce importanti feedback sullo stato biologico dei vari percorsi biologici associati ai parametri di cellula importante (proteina di kDa 53, p53, recettori tirosino-chinasi e vie intracellulari) contemporaneamente. Inoltre, è possibile combinare diversi tipi di matrici per aumentare la penetrazione di un test (ad es., apoptosi e ubiquitina e la fosforilazione). Questa capacità di combinare più matrici per valutare varie alterazioni post-traduzionali in diversi campioni contemporaneamente in un modo di tempo e costi efficaci che non necessita di strumentazione specifica o esperienza è un significativo vantaggio nel caso di matrici di anticorpo.

<table><tbody><tr><td>Imager Odysee SA</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>Imager fluorescente</td><td></td></tr> in <tr><td>provetta da 1,5 mL</td><td></td><td>Raschietto cellulare Eppendorf</td> 22363212 <td></td></tr><tr><td></td><td>Falkon (Corning)</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbeco (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>tampone di lavaggio per l'estrazione di proteine</td></tr><tr><td>Piatto per coltura tissutale 100 mm</td><td>TRP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>ICC Siringa da insulina U100</td><td>Becton Dickinson</td><td>329412</td><td>27 G5/8,&nbsp; 1 mL per il trattamento con ago di campioni proteici</td></tr><tr><td>Protein Profiler ARRAY&nbsp;</td><td>R& D</td><td>ARY003B</td> Profilo proteico <td>umano fosfo MAPK array</td></tr><tr><td>ARRAY&nbsp;</td><td>R& D</td><td>ARY002B</td> Centrifuga <td>umana per array di fosfochinasi</td></tr><tr><td>Eppendorf 5430R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Centrifuga da tavolo</td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine BCA</td><td>Pierce Thermo Fisher</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMAX M2</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Lettore di assorbanza per la quantificazione delle proteine</td></tr><tr><td>IRDye 800CW Streptavidina</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>925-32230</td><td>Coniugato di streptavidina per la rivelazione fluorescente</td></tr><tr><td>LabGard ES Classe II, cabina di biosicurezza di tipo A2</td><td>NuAire</td><td>NU-425-400</td><td>Cappa per coltura tissutale</td></tr><tr><td>TC20 contatore cellulare automatizzato</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td>Contatore cellulare</td></tr><tr><td>Halt Protease & Cocktail di inibitori della fosfatasi (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>78446</td><td></td></tr><tr><td>tampone RIPA</td><td>Sigma</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>F60</td><td>sonicator</td></tr><tr><td>Agitatore a piattaforma oscillante</td><td>VWR</td><td>10860-780</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH open source</td><td></td><td>https://imagej.net/Welcome</td></tr><tr><td>SAS Institutie JMP&reg; 12.1.0 (64 bit)</td><td>Valentina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione della resistenza agli inibitori della tirosina chinasi di un interrogatorio di trasduzione del segnale da matrici di anticorpo

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Malati di cancro con un regolamento aberrante delle reti di fosforilazione della proteina sono spesso trattati con gli inibitori della chinasi della tirosina. Si avvicina l'85% i tassi di risposta sono comuni. Purtroppo, i pazienti diventano spesso refrattari al trattamento, modificando la loro vie di trasduzione del segnale. Un'implementazione di delineamento di espressione con microarrays può identificare le modifiche nel complesso a livello di mRNA e proteomica può identificare le modifiche globali nei livelli della proteina o in grado di identificare le proteine coinvolte, ma l'attività della trasduzione del segnale le vie possono essere stabilite solo interrogando modificazioni post-traduzionali delle proteine. Di conseguenza, la capacità di identificare se un trattamento farmacologico è successo o se la resistenza è sorto, o la possibilità di caratterizzare eventuali alterazioni nelle vie di segnalazione, è una sfida clinica importante. Qui, forniamo una spiegazione dettagliata di matrici di anticorpo come uno strumento che può identificare le alterazioni a livello di sistema in varie modificazioni post-traduzionali (ad es., fosforilazione). Uno dei vantaggi dell'utilizzo di matrici di anticorpo include la loro velocità e accessibilità (matrice non richiede sia un esperto di proteomica o costose apparecchiature). La disponibilità di una combinazione di modificazioni post-traduzionali di targeting di matrici è il limite principale. Inoltre, approcci imparziali (fosfoproteomica) possono essere più adatti per la scoperta di romanzo, considerando che le matrici dell'anticorpo sono ideali per le destinazioni più ampiamente caratterizzate.

Per studiare l'effetto di resistenza TKI su vie di trasduzione del segnale nelle linee cellulari, quattro campioni sono stati analizzati. Esempio di un controllo (H3255r1) e 3 linee di cellulari TKI-resistente (H3255r2-4) (Figura 2) sono stati collegati al modello spot anticorpo (Figura 3). Tutti e 4 i campioni sono stati preparati usando questo protocollo. Sei fosfoproteine con attività differenziale sono stati scelti per la dim...

Qui, presentiamo un protocollo per le matrici di anticorpo di identificare le alterazioni in vie di segnalazione in vari modelli di cellulari. Questi cambiamenti, causati da farmaci/ipossia/ultra-ultravioletti luce/radiazione, o da sovraespressione/downregulation/Ko, sono importanti per vari modelli di malattia e possono indicare se una terapia sarà efficace oppure può identificare meccanismi di farmaci resistenza.

Valutazione della resistenza agli inibitori della tirosina chinasi di un interrogatorio di trasduzione del segnale da matrici di anticorpo

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulle perturbazioni nelle reti di segnalazione che possono causare la crescita del cancro o lo sviluppo di resistenza a terapie specifiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può fornire un feedback rapido e affidabile sullo stato di fosforilazione di più reti che sono spesso deregolamentate nel cancro. L'implicazione di questa tecnica si estende verso la terapia dei tumori resistenti ai farmaci perché l'identificazione di alterazioni e modifiche post-tras tras trasmissizionali può chiarire i cambiamenti nell'attività della via di trasduzione del segnale.Mentre questa tecnica è usata sulla fosforilazione, può anche essere usata per esaminare altre modifiche post-traslazionali come la glicosilazione e l'ubiquità. Iniziare risciacquando accuratamente le cellule coltivate durante la notte tre volte con 10 millilitri di PBS, facendo attenzione a rimuovere tutto il PBS dopo l'ultimo lavaggio. Quindi, aggiungere il volume appropriato di tampone di lisi dal kit di dosaggio proteico e utilizzare un raschietto cellulare per staccare le cellule.Triturare la soluzione cellulare risultante circa 10 volte prima di trasferire a

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RPPA consente l'espressione della proteina di centinaia di campioni, stampati su vetrini nitrocellulosa da interrogare simultaneamente, utilizzando fluorescente anticorpi. Questa tecnica è stata applicata per studiare l'effetto di eterogeneità farmaco nel trattamento carcinoma a cellule renali chiare.

L&#39;uso di matrici inverse proteina di fase (RPPA) per esplorare Espressione Variazione proteine ​​all&#39;interno dei singoli tumori a cellule renali

Chinasi recettore tirosina sono ectopica espresso in molti tumori e sono stati identificati come bersagli terapeutici nella leucemia acuta. Questo manoscritto descrive una strategia efficace per la valutazione pre-clinica degli inibitori della tirosin-chinasi per il trattamento della leucemia acuta.

Valutazione pre-clinica della tirosina chinasi inibitori per il trattamento di leucemia acuta

Emersione di resistenza genetica contro terapia con inibitori della chinasi pone sfida importante per la terapia del cancro efficace. Identificazione e caratterizzazione di mutazioni resistenti contro un farmaco di nuova concezione contribuisce a una migliore gestione clinica e di progettazione di farmaci di nuova generazione. Qui, descriviamo il nostro protocollo per lo screening e la validazione di mutazioni resistenti in vitro.

Un metodo per lo screening e validazione di mutazioni resistenti contro Kinase Inhibitors

Lo screening dell'array di peptidi è un test ad alto rendimento per identificare i siti di interazione proteina-proteina. Ciò consente di mappare più interazioni di una proteina bersaglio e può servire come metodo per identificare i siti per gli inibitori che prendono di mira una proteina. Qui descriviamo un protocollo per lo screening e l'analisi degli array di peptidi.

Identificare proteina-proteina siti di interazione Uso Peptide Array

La resistenza ai farmaci per terapie mirate è molto diffusa e la necessità di individuare meccanismi di resistenza - prima o dopo l'insorgenza clinica - è fondamentale per guidare le strategie alternative di gestione clinica. Qui, presentiamo un protocollo per accoppiare derivazione di linee farmaco-resistenti in vitro con sequenziamento per accelerare scoperta di questi meccanismi.

Implementazione di<em&gt; In Vitro</em&gt; Drug Resistance saggi: massimizzare il potenziale per scoprire clinicamente rilevanti Resistenza Meccanismi

Si tratta di un protocollo di tempo e costi efficaci in vitro indagare i meccanismi della resistenza acquisita agli agenti terapeutici mirati, che è un bisogno medico altamente insoddisfatto in gestione del cancro.

Alla ricerca di Driver delle vie di acquisito resistenza alla terapia mirata: generazione farmacoresistenti Subclone e sensibilità ripristino di Gene Knock-down

Qui, descriviamo i protocolli per la validazione genetica e chimica di c-Fos e Dusp1 come un obiettivo della droga nella leucemia utilizzando modelli in vitro e in vivo genetica e umanizzato del topo. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi destinazione per validazione genetica e sviluppo terapeutico.

Metodi per valutare il ruolo di c-Fos e Dusp1 nella dipendenza dell'Oncogene

Questo documento utilizza un flusso cytometry-test per librerie di schermo di inibitori chimici per l'identificazione di inibitori e ai loro obiettivi che influenzano la segnalazione del ricevitore della T-cellula. I metodi descritti qui possono essere espanso per high throughput screening.

Identificazione dei mediatori del T-cell Receptor segnalazione tramite lo Screening di librerie chimiche inibitore

Viene presentato un protocollo dettagliato per la generazione di microarray proteici umani auto-assemblati per lo screening degli inibitori della chinasi.

Screening dell'inibitore della kinasi in microarray proteici umane auto-assemblati

Qui presentiamo un protocollo per testare l'efficacia delle terapie mirate selezionate in base alla trucco genomico di un tumore. Il protocollo descrive l'identificazione e la convalida dei riarrangiamenti strutturali del DNA, l'innesto dei tumori dei pazienti nei topi e il test delle risposte ai farmaci corrispondenti.

Test delle terapie mirate nel cancro utilizzando l'analisi dell'alterazione strutturale del DNA e gli Xenogrini derivati dal paziente

I protocolli di analisi basati su cellule di trasferimento di energia di risonanza di Förster risolti nel tempo sono descritti per la quantificazione semplice, specifica, sensibile e robusta del trasduttore di segnale fosforilato endogeno e dell'attivatore della trascrizione (STAT) 1/3/4/5/6 proteine in lisati cellulari in un formato a 384 pozzetti.

Saggi di trasferimento di energia di Förster Resonance risolti nel tempo per la misurazione di proteine STAT fosforilate endogene in cellule umane

Scopri come valutare la resistenza agli inibitori della tirosina chinasi utilizzando matrici di anticorpo per analizzare le modifiche post-traduzionali nelle vie di segnalazione cellulari. Questo metodo fornisce informazioni rapide sulla fosforilazione.

Valutazione della resistenza agli inibitori della tirosina chinasi di un interrogatorio di trasduzione del segnale da matrici di anticorpo (Video) | JoVE Journal

Valutazione della resistenza agli inibitori della tirosina chinasi di un interrogatorio di trasduzione del segnale da matrici di anticorpo

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