Optogenetica identificazione di un tipo di un neurone con un Optrode di vetro in topi svegli

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come le funzioni di diversi tipi di neuroni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di identificare in modo affidabile i diversi tipi di neuroni in vivo con materiali economici e accessibili. Dimostrerò la procedura insieme a Shinji Muramoto, il nostro tecnico, e Lanlan Ma, il nostro assistente professore del nostro laboratorio.

Per iniziare questa procedura, estrarre delicatamente il tubo d'acciaio per il controllo della pressione dalla canna del supporto. Allargare il foro del lato della sede del perno nella canna del supporto forando. Quindi, posizionare un tubo di acciaio inossidabile nel foro.

Quindi, inserire nel foro un manicotto di accoppiamento diviso in ceramica per ghiera di 2,5 millimetri di diametro. Fai un buco in un coniglio a forma di L e attacca il fusto del portaelettrodo al coniglio con adesivo epossidico. Successivamente, fissarlo a un manipolatore con viti.

Preparare un palo di testa su misura trasformando il distanziatore del circuito stampato colonnare in una forma cuboidale con una fresa e tagliarlo in due pali di testa con una sega. Quindi, appiattire la parte inferiore del palo della testa con una fresa. Prima dell'intervento, sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e un palo di testa con un'autoclave.

Pulire il telaio stereotassico e il termoforo con alcol al 70%. Quindi, anestetizzare il mouse e posizionarlo nel telaio stereotassico su un termoforo. In questo esperimento, viene utilizzato un topo transgenico in cui vengono utilizzati i neuroni inibitori che esprimono la canalrodopsina-II.

Posizionare i denti nel foro della barra del morso e serrare leggermente il morsetto per il naso. Successivamente, fissare entrambi i lati della testa utilizzando le barre auricolari. Quando la testa è fissata correttamente dalle barre auricolari, stringere il morsetto per il naso.

Applicare un unguento oftalmico sugli occhi. Taglia i capelli sopra la testa con piccole forbici e pulisci il cuoio capelluto con un batuffolo di cotone di clorexidina gluconato. Quindi, taglia il cuoio capelluto lungo la linea mediana e spingilo da parte.

Rimuovi il periostio con un batuffolo di cotone imbevuto di alcol al 70% e lascia asciugare il cranio. Quindi, fissare il palo della testa al manipolatore. Posiziona il palo della testa piatto sul cranio attorno al bregma usando il manipolatore.

Mescola quattro gocce di monomero, una goccia di catalizzatore e un cucchiaino di polimero su un piattino che viene raffreddato in frigorifero. Applicare il cemento dentale sull'osso frontale e parietale e fissare il palo della testa al cranio. Dopo che il cemento dentale si è indurito, rimuovere il mouse dal telaio stereotassico.

Applicare un unguento antibiotico sulla pelle esposta e iniettare un cocktail di antagonista della medetomidina e antibiotico. Quindi, posiziona il mouse sul termoforo in una gabbia fino a quando non si sveglia e rimettilo in una gabbia di alloggiamento con arricchimenti. Per eseguire la craniotomia sulla regione del cervello bersaglio per la registrazione, pulire il cranio con un batuffolo di cotone imbevuto di clorexidina gluconato e alcol al 70%.

Raschiare con cura il cranio sul sito di registrazione con un trapano dentale. Quando l'osso è abbastanza sottile, tagliatelo con la punta del bisturi e rimuovetelo. Quindi applicare il cemento dentale intorno alla regione esposta per rafforzare il cranio.

Coprire l'area cerebrale esposta con adesivo siliconico dopo che il cemento dentale si è indurito. Quindi, posiziona l'animale sul termoforo in una gabbia fino a quando non si sveglia e rimettilo in una gabbia di alloggiamento. Lasciare che l'animale si riprenda per almeno un giorno dopo la craniotomia, prima di eseguire la registrazione elettrofisiologica.

Prima di eseguire la registrazione elettrofisiologica, realizzare delle pipette di vetro da capillari di vetro borosilicato utilizzando un estrattore di elettrodi. Riempire le pipette con PBS da 10 millimolari. In alcune registrazioni, il due percento di neurobiotina viene aggiunto al PBS da 10 millimolari.

Quindi, posiziona l'animale nella camera di registrazione. Fissare una pipetta di vetro piena al supporto optrode su misura. Inserire un filo rivestito di cloruro d'argento nella pipetta di vetro.

Successivamente, collegare il pin allo stadio principale dell'amplificatore di registrazione. Successivamente, collegare il cavo patch in fibra ottica con una ghiera in zirconia al manicotto di accoppiamento diviso sul supporto optrode. Spingere il cavo del cerotto nella guaina finché la punta della ghiera non tocca il retro della pipetta di vetro.

Il cavo patch eroga la luce dal LED, che è controllato da un driver LED a canale singolo. Successivamente, rimuovere l'adesivo siliconico sopra la craniotomia. Applicare periodicamente soluzione salina calda sulla superficie del cervello per evitare che la superficie cerebrale si secchi durante la sessione di registrazione.

Se necessario, rimuovere la dura madre con una pinzetta affilata. Qui, le risposte spike sono state registrate nel collicolo inferiore dei topi svegli VGAT channelrhodopsin-II. Nel collicolo inferiore dei topi vgat-rodopsina-II, i neuroni GABAergici esprimono specificamente la canalrodopsina-II.

Nei topi svegli, sia i neuroni GABAergici che quelli glutammatergici erano eccitati o soppressi rispettivamente quando ricevevano stimoli leggeri. Quando lo stimolo luminoso viene erogato attraverso l'elettrodo di vetro, evoca risposte di picco in alcuni neuroni. Al contrario, in altri neuroni, gli stimoli luminosi sopprimevano le risposte spike evocate dagli stimoli sonori.

Questi risultati mostrano che un optrode di vetro può registrare l'attività di una singola unità ben isolata e stimolare in modo affidabile i neuroni registrati con la luce. Dopo lo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare come diversi tipi di neuroni lavorano nell'orbita neurale di varie regioni del cervello.