Name: Induzione e convalida della senescenza cellulare in cellule umane primarie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Scopri come indurre e convalidare la senescenza cellulare in fibroblasti primari umani usando doxorubicina e marcatori specifici. Questo protocollo riproducibile facilita la ricerca sull'invecchiamento e sul cancro.

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Ringraziamo i membri del laboratorio Demaria per discussioni fruttuose e Thijmen van Vliet per la condivisione di dati e protocollo sulla senescenza indotta da UV.

<ol><li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).</li>
<li>Muñoz-Espín, D., Serrano, M. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nrm3823">Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).</li>
<li>Sharpless, N. E., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forging+a+signature+of+in+vivo+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Forging a signature of in vivo senescence.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).</li>
<li>Correia-Melo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+are+required+for+pro-ageing+features+of+the+senescent+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Mitochondria are required for pro-ageing features of the senescent phenotype.</a> The EMBO Journal. 10, e201592862(2016).</li>
<li>Loaiza, N., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+and+tumor+promotion%3A+Is+aging+the+key%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Reviews+on+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence and tumor promotion: Is aging the key?</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. , (2016).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+p16%28Ink4a%29-positive+cells+shorten+healthy+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan.</a> Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+senescent+cells+enhances+adipogenesis+and+metabolic+function+in+old+age%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age.</a> Elife. 4, e12997(2015).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+p16Ink4a-positive+senescent+cells+delays+ageing-associated+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders.</a> Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).</li>
<li>Jeon, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+clearance+of+senescent+cells+attenuates+the+development+of+post-traumatic+osteoarthritis+and+creates+a+pro-regenerative+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment.</a> Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).</li>
<li>Demaria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Senescence+Promotes+Adverse+Effects+of+Chemotherapy+and+Cancer+Relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse.</a> Cancer Discovery. 7 (2), 165-176 (2017).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+senescent+cells+by+ABT263+rejuvenates+aged+hematopoietic+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice.</a> Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).</li>
<li>Soto-Gamez, A., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+interventions+for+aging%3A+the+case+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Therapeutic interventions for aging: the case of cellular senescence.</a> Drug Discov Today. 22 (5), 786-795 (2017).</li>
<li>Childs, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+cells%3A+an+emerging+target+for+diseases+of+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 718-735 (2017).</li>
<li>Marthandan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+genes+and+pathways+in+primary+human+fibroblast+strains+undergoing+replicative+and+radiation+induced+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Research%22%5BJournal%5D)">Conserved genes and pathways in primary human fibroblast strains undergoing replicative and radiation induced senescence.</a> Biological Research. 49, 34(2016).</li>
<li>Marthandan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+Senescence+Associated+Genes+and+Pathways+in+Primary+Human+Fibroblasts+Detected+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Conserved Senescence Associated Genes and Pathways in Primary Human Fibroblasts Detected by RNA-Seq.</a> PLoS One. 11 (5), e0154531(2016).</li>
<li>Hernandez-Segura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unmasking+Transcriptional+Heterogeneity+in+Senescent+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells.</a> Current Biology. 27 (17), 2652-2660 (2017).</li>
<li>Le, O. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+radiation-induced+long-term+expression+of+senescence+markers+in+mice+is+independent+of+p53+and+immune+status%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Ionizing radiation-induced long-term expression of senescence markers in mice is independent of p53 and immune status.</a> Aging Cell. 9 (3), 398-409 (2010).</li>
<li>Hall, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C%2FEBPalpha+regulates+CRL4%28Cdt2%29-mediated+degradation+of+p21+in+response+to+UVB-induced+DNA+damage+to+control+the+G1%2FS+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">C/EBPalpha regulates CRL4(Cdt2)-mediated degradation of p21 in response to UVB-induced DNA damage to control the G1/S checkpoint.</a> Cell Cycle. 13 (22), 3602-3610 (2014).</li>
<li>Nitiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+DNA+topoisomerase+II+in+cancer+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting DNA topoisomerase II in cancer chemotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 9 (5), 338-350 (2009).</li>
<li>Pazolli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+remodeling+underlies+the+senescence-+associated+secretory+phenotype+of+tumor+stromal+fibroblasts+that+supports+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chromatin remodeling underlies the senescence- associated secretory phenotype of tumor stromal fibroblasts that supports cancer progression.</a> Cancer Research. 72, 2251-2261 (2012).</li>
<li>Venturelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+induction+of+apoptosis+and+senescence+by+the+DNA+methyltransferase+inhibitors+5-azacytidine+and+5-aza-2%27-deoxycytidine+in+solid+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Differential induction of apoptosis and senescence by the DNA methyltransferase inhibitors 5-azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine in solid tumor cells.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 12, 2226-2236 (2013).</li>
<li>Tennant, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Trypan+Blue+Technique+for+Determination+of+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability.</a> Transplantation. 2, 685-694 (1964).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Lee, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+%CE%B2-galactosidase+is+lysosomal+%CE%B2-galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated β-galactosidase is lysosomal β-galactosidase.</a> Aging Cell. 5, 187-195 (2006).</li>
<li>Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-galactosidase+staining+on+bone+marrow.+The+osteoclast+pitfall%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall.</a> Histology and Histopathology. 22 (9), 971-976 (2007).</li>
<li>Dimri, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-9367 (1995).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li>
<li>Sherr, C. J., McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RB+and+p53+pathways+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The RB and p53 pathways in cancer.</a> Cancer Cell. 2 (2), 103-112 (2002).</li>
<li>Bunz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+p53+and+p21+to+sustain+G2+arrest+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage.</a> Science. 282 (5393), 1497-1501 (1998).</li>
<li>Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+beta-galactosidase+staining+a+marker+of+senescence+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Is beta-galactosidase staining a marker of senescence in vitro and in vivo.</a> Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).</li>
<li>Stolzing, A., Coleman, N., Scutt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-induced+replicative+senescence+in+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Rejuvenation+Research%22%5BJournal%5D)">Glucose-induced replicative senescence in mesenchymal stem cells.</a> Rejuvenation Research. 9 (1), 31-35 (2006).</li>
<li>Blazer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+glucose-induced+replicative+senescence%3A+point+of+no+return+and+effect+of+telomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">High glucose-induced replicative senescence: point of no return and effect of telomerase.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 296 (1), 93-101 (2002).</li>
<li>Wiley, C. D., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Ancient+Pathways+to+Aging+Cells-Connecting+Metabolism+and+Cellular+Senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">From Ancient Pathways to Aging Cells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence.</a> Cell Metabolism. 23 (6), 1013-1021 (2016).</li>
<li>Kumar, R., Gont, A., Perkins, T. J., Hanson, J. E. L., Lorimer, I. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+senescence+in+primary+glioblastoma+cells+by+serum+and+TGFbeta%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Induction of senescence in primary glioblastoma cells by serum and TGFbeta.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2156(2017).</li>
<li>Hypoxia Blagosklonny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MTOR+and+autophagy%3A+converging+on+senescence+or+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">MTOR and autophagy: converging on senescence or quiescence.</a> Autophagy. 9 (2), 260-262 (2013).</li>
<li>Meuter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+cellular+senescence+are+elevated+in+murine+blastocysts+cultured+in+vitro%3A+molecular+consequences+of+culture+in+atmospheric+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (10), 1259-1267 (2014).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human-like+senescence-associated+secretory+phenotype+is+conserved+in+mouse+cells+dependent+on+physiological+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A human-like senescence-associated secretory phenotype is conserved in mouse cells dependent on physiological oxygen.</a> PLoS One. 5 (2), e9188(2010).</li>
<li>van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+senescent+cells+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of senescent cells in ageing.</a> Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).</li>
<li>Kim, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+time-series+gene+expression+profiles+of+replicative+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Implications of time-series gene expression profiles of replicative senescence.</a> Aging Cell. 12, 622-634 (2013).</li>
</ol>

I protocolli spiegati qui sono stati ottimizzati per i fibroblasti primari umani, specialmente cellule BJ e WI-38. I protocolli per la senescenza replicativa, radiazioni ionizzanti e doxorubicina, sono stati applicati con successo ad altri tipi di fibroblasti (HCA2 e IMR90) e in altri tipi cellulari (vale a dire neonatali melanociti e cheratinociti o cardiomiociti derivati iPSC) nel nostro laboratorio. Tuttavia, gli adattamenti per i tipi di cellule supplementari possono essere ottimizzati regolando alcuni dettagli come ...

Nel 1961, Hayflick e Moorhead segnalato che fibroblasti primari nella cultura perdono il loro potenziale proliferativo dopo successivi passaggi1. Questo processo è causato dalla riduzione sequenza dei telomeri dopo ogni divisione cellulare. Quando i telomeri raggiungono una lunghezza criticamente corta, sono riconosciuti dalla risposta di danno del DNA (DDR) che attiva un arresto irreversibile della proliferazione — anche definito come senescenza replicativa. Senescenza replicativa è attualmente uno dei molti stimoli che sono noti per indurre uno stato di arresto permanente del ciclo cellulare che esegue il rendering di cellule insensibili ai mitogeni sia a segnali apoptotici2,3. Il programma di senescenza è normalmente caratterizzato da funzionalità aggiuntive tra cui alta attività lisosomiale, la disfunzione mitocondriale, cambiamenti nucleari, le riorganizzazioni della cromatina, stress del reticolo endoplasmico, danno del DNA e una senescenza-collegata fenotipo secretivo (SASP)3,4. Le cellule senescenti hanno molteplici funzioni nel corpo: sviluppo, ferita di soppressione del tumore e guarigione2. Allo stesso modo, essi sono noti per svolgere un ruolo importante nell'invecchiamento e, paradossalmente, in progressione di tumore5. Gli effetti negativi e parzialmente contraddittori, di senescenza sono spesso attribuiti alla SASP6.
Recentemente, è stato indicato che l'eliminazione delle cellule senescenti dai topi conduce alla estensione della durata della vita e alla eliminazione di molti l'invecchiamento caratteristiche7,8,9,10,11, 12. allo stesso modo, le droghe multiple sono state sviluppate per eliminare sia le cellule senescenti (senolytics) o per mirare le SASP13,14. Il potenziale terapeutico di anti-invecchiamento ha recentemente attirato più attenzione al campo.
Lo studio dei meccanismi associati a senescenza cellulare e le proiezioni per gli interventi farmacologici si basano pesantemente su modelli ex vivo , particolarmente sui fibroblasti primari umani. Mentre ci sono alcune caratteristiche comuni attivati da induttori di senescenza diversificata, una grande variabilità nel fenotipo di senescenza è osservata e dipende da vari fattori tra cui cella tipo, stimolo e tempo punto3,15, 16,17. È assolutamente necessario prendere in considerazione l'eterogeneità per studiare e targeting cellule senescenti. Di conseguenza, questo protocollo mira a fornire una serie di metodi utilizzati per indurre senescenza in fibroblasti primari utilizzando diversi trattamenti. Come verrà spiegato, i metodi possono essere facilmente adattati ad altri tipi di cella.
Oltre a senescenza replicativa, descriviamo cinque altri trattamenti che induce senescenza: ionizzante radiazione, radiazione ultravioletta (UV), doxorubicina, stress ossidativo ed i cambiamenti epigenetici (vale a dire la promozione di acetilazione dell'istone o demetilazione del DNA) . Entrambi, radiazioni ionizzanti e UV-radiazione causano danni diretti del DNA e, presso la dose appropriata, trigger senescenza18,19. Doxorubicina causa anche senescenza principalmente attraverso il danno del DNA da intercalanti nel DNA e interrompere la funzione di topoisomerasi II e fermando così il DNA riparazione meccanismi20. L'espressione di geni essenziali per la senescenza è normalmente controllato da acetilazione dell'istone e metilazione del DNA. Di conseguenza, gli inibitori dell'istone deacetilasi (ad es., sodio butirrato e SAHA) e DNA demetilanti (ad es., 5-aza) agenti innescano senescenza in cellule altrimenti normali21,22.
Infine, quattro degli indicatori più comuni associati a cellule senescenti sarà spiegato: attività della senescenza associati-β-galattosidasi (SA-β-gallone), tasso di sintesi del DNA dall'analisi di incorporazione di EdU, sovraespressione di regolatori del ciclo cellulare e p16 inibitori di chinasi ciclina-dipendente e p21 e sovraespressione e secrezione dei membri della SASP.

<table><tbody><tr><td>DMEM Media - GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Hyclone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (P/S; 10.000 U/ml)</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SC-202581</td><td></td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi (non trattata con DEPC)</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Pallone T75</td><td>Sarstedt</td><td>833911002</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione Tripsina/EDTA</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>PBS compresse</td><td>Gibco</td><td>18912-014</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml provette per microcentrifuga</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Provette da centrifuga da 15 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 6 pozzetti</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 24 pozzetti</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>vetrini coprioggetti rotondi da 13 mm</td><td>Sarstedt</td><td>83.1840.002</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip</td><td>Merck Chemicals</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Cesio137-fonte</td><td></td><td></td><td>IBL 637 Cesio-137&gamma;-camera</td></tr> di <tr><td>radiazione UV per</td><td></td><td></td> macchina a raggi gamma <td>Opsytec, Dr. G&ouml; bel BS-02</td></tr><tr><td>Doxorubicina dicloridrato&nbsp;</td><td>BioAustralis Fine Chemicals</td><td>BIA-D1202-1</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di perossido di idrogeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>5-aza-2'-deossicitidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3656</td><td></td></tr><tr><td>SAHA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0061</td><td></td></tr><tr><td>butirrato di sodio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>X-gal (5-Bromo-4-cloro-3-indolil-&beta;-D-galattopiranoside)</td><td>Fisher Scientific</td><td>7240-90-6</td><td></td></tr><tr><td>Acido citrico monoidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5949-29-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato bibasico di sodio</td><td>Acros organics</td><td>7782-85-6</td><td></td></tr><tr><td>Ferrocianuro di potassio&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>14459-95-1</td><td></td></tr><tr><td>Ferricianuro di potassio</td><td>Fisher Scientific</td><td>13746-66-2</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Merck Millipore</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Fisher Chemicals</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>25% glutaraldeide</td><td>Fisher Scientific</td><td>111-30-8,7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>16% formaldeide (p/v)</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>EdU (5-etinil-2'-deossiuridina)</td><td>Lumiprobe</td><td>10540</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-cianine3 azide (Sulfo-Cy3-azide)</td><td>Lumiprobe</td><td>D1330</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di rame(II) pentaidrato (Cu(II)SO4.5H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros organics</td><td>215682500</td><td></td></tr><tr><td>base TRIS</td><td>Roche</td><td>11814273001</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Piastra multipozzetto 384, bianco&nbsp;</td><td>Roche</td><td>4729749001</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480 foglio sigillante&nbsp;</td><td>Kit Roche</td><td>4729757001</td><td></td></tr><tr><td>Sensifast Probe Lo-ROX&nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-84020</td><td></td></tr><tr><td>Libreria di sonde UPL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Varie</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 umane DuoSet ELISA</td><td>R& D</td><td>D6050</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad TC20</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrini di conteggio</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0017</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore a secco</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>Heratherm</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylformamide</td><td>Merck Millipore</td><td>1.10983</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 'M' film da laboratorio</td><td>Bemis&nbsp;</td><td></td><td></td>#PM992</tr><tr><td>Pinzette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aghi</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

induzione e convalida della senescenza cellulare in cellule umane primarie

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

La senescenza cellulare è uno stato di arresto del ciclo cellulare permanente attivato in risposta a diversi stimoli dannosi. Attivazione della senescenza cellulare è un marchio di garanzia di varie condizioni fisiopatologiche, tra cui la soppressione del tumore, tessuto che ritocca e invecchiamento. Gli induttori di senescenza cellulare in vivo sono ancora poco caratterizzati. Tuttavia, un numero di stimoli utilizzabile per promuovere la senescenza cellulare ex vivo. Fra loro, senescenza-induttori più comuni sono esaurimento replicativa, radiazioni ionizzanti e radiazioni non ionizzanti, farmaci genotossici, stress ossidativo e di demethylating e acetilante agenti. Qui, vi forniremo istruzioni dettagliate su come utilizzare questi stimoli per indurre i fibroblasti nella senescenza. Questo protocollo può essere facilmente adattato per diversi tipi di cellule primarie e linee cellulari, comprese le cellule tumorali. Descriviamo anche diversi metodi per la convalida di induzione di senescenza. In particolare, ci concentriamo sulla misurazione dell'attività dell'enzima lisosomiale β-galattosidasi senescenza-collegata (SA-β-gallone), il tasso di sintesi di DNA mediante analisi di incorporazione di 5-Etinil-2'-deoxyuridine (EdU), i livelli di espressione del ciclo cellulare inibitori p16 e p21 e l'espressione e la secrezione dei membri del fenotipo secretivo Senescence (SASP). Infine, forniamo risultati di esempio e discutere ulteriori applicazioni di questi protocolli.

Arricchimento di SA-β-gallone macchiatura in fibroblasti senescenti
Β-galattosidasi (β-gallone) è un enzima lisosomiale che si esprime in tutte le cellule e che ha un pH ottimale di 4,025,26. Tuttavia, durante la senescenza, lysosomes aumentano di dimensioni e, di conseguenza, le cellule senescenti si accumulano β-gallone. La maggiore quantità di questo enzima rendono possi...

Andremo a discutere una serie di protocolli per l'induzione e la convalida della senescenza cellulare in cellule coltivate. Ci concentriamo sui diversi stimoli che inducono la senescenza e descrivere la quantificazione degli indicatori comuni di senescenza-collegata. Forniamo dettagli tecnici usando i fibroblasti come un modello, ma i protocolli possono essere adattati a vari modelli di cellulari.

Induzione e convalida della senescenza cellulare in cellule umane primarie

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'invecchiamento e del cancro, come ad esempio come eseguire tecniche comuni per indurre la senescenza cellulare e come valutare il fenotipo della senescenza. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è facile da seguire, altamente riproducibile, non richiede attrezzature speciali o costose e provoca l'induzione della senescenza in almeno il 50% della popolazione cellulare. A dimostrare questa procedura sarà Alejandra Hernandez-Segura, una studentessa laureata del nostro laboratorio.Per iniziare, seminare da sette volte 10 al quinto fibroblasti primari vitali con un basso raddoppio della popolazione o PD in un pallone T75 contenente 10 millilitri di D10. Incubare le cellule in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e il 5% di ossigeno per una notte. Diluire 11 microlitri della soluzione madre di doxorubicina 1.000X in 11 millilitri di D10 a una concentrazione finale di 250 nanomolari.Quindi aspirare il terreno dalle cellule e sostituirlo con 10 millilitri di D10 più doxorubicina. Incubare le cellule in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e il 5% di ossigeno per esattamente 24 ore. Quindi aspirare il terreno e utilizzare 10 millilitri di D10 per lavare accuratamente le cellule una volta.Incubare le cellule in 10 millilitri di D10 per altri sei giorni, sostituendo il terreno regolarmente ogni tre giorni circa. Per effettuare la colorazione con beta-galattosidasi, per ogni campione si semina una volta per 10 fino alla quarta cellula in almeno un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti contenente 500 microlitri di D10 in modo che le cellule siano sparse. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e il 5% di ossigeno durante la notte.Il giorno seguente, utilizzare 500 microlitri di PBS per lavare le cellule due volte. Quindi aggiungere 500 microlitri per pozzetto di 2% di formaldeide più lo 0,2% di glutaraldeide in PBS e incubare le cellule a temperatura ambiente per tre-cinque minuti per fissarle. Quindi utilizzare 500 microlitri di PBS per lavare le cellule due volte.Successivamente, dopo aver preparato la soluzione colorante fresca, aggiungere 500 microlitri per pozzetto e utilizzare il parafilm per sigillare la piastra per evitare l'evaporazione che può causare la formazione di cristalli. Incubare le cellule al buio a 37 gradi Celsius in un'incubatrice asciutta senza anidride carbonica per 12-16 ore. Quindi utilizzare 500 microlitri di PBS per lavare le cellule due volte.Controllare le cellule con un normale microscopio ottico per valutare i risultati in cui appariranno cellule positive con colorazione paranucleare blu. Per facilitare la visualizzazione e la quantificazione delle singole cellule, utilizzare DAPI come controcolorante. Quindi, utilizzando un microscopio a fluorescenza, determinare la percentuale di cellule positive rispetto al numero totale di cellule che scattano più foto dello stesso campione per valutare almeno 100 singole cellule.Per ogni campione o condizione, posizionare un vetrino coprioggetti per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti. Seminare una volta 10 alla quarta cellula con 500 microlitri di D10 per pozzetto in modo che le cellule siano sparse. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e il 5% di ossigeno durante la notte.Preparare una quantità sufficiente di una soluzione di EdU 20 micromolari e D10 in modo che ogni campione riceva 250 microlitri. Rimuovere metà del terreno da ciascun pozzetto da trattare e sostituirlo con la soluzione EdU D10. La concentrazione finale di EdU è di 10 micromolari.Incubare i campioni a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e il 5% di ossigeno per 18-24 ore. Utilizzare lo stesso tempo di incubazione per le cellule di controllo e senescenti. Dopo l'incubazione, utilizzare 500 microlitri di PBS per lavare le cellule due volte.Quindi aggiungere 500 microlitri di formaldeide al 4% in PBS e incubare le cellule per 10 minuti per fissarle. Dopo la fissazione, aggiungere 500 microlitri di Tris pH 7.6 da 100 millimolari ai campioni e incubarli per cinque minuti. Successivamente, aggiungere 500 microlitri di Triton X-100 allo 0,1% in PBS alle cellule e permeabilizzarle per 10 minuti.Quindi utilizzare PBS per lavare i campioni tre volte. Preparare 50 microlitri di miscela per etichette per ogni vetrino coprioggetti, aggiungendo i componenti nell'ordine seguente, 44,45 microlitri di PBS, 0,5 microlitri di solfato di rame(II), 0,05 microlitri di solfo-ci3-azide e cinque microlitri di ascorbato di sodio. Pipettare 50 microlitri di miscela per etichette su un pezzo di parafilm.Quindi, usando una pinzetta e un ago, solleva il vetrino coprioggetti e appoggialo con la cellula rivolta verso il basso sopra il composto di etichette. Assicurarsi che non vi siano bolle e che l'intera superficie del vetrino coprioggetti tocchi la miscela di etichette. Incubare il campione al buio per 30 minuti.Rimettere le cellule nei pozzetti della piastra a 24 pozzetti e utilizzare PBS per lavarle tre volte. Quindi utilizzare un mezzo di montaggio con DAPI per montare i campioni e lasciarli asciugare durante la notte. Per iniziare, seminare sette volte 10 al quinto fibroblasti primari vitali con un basso raddoppio della popolazione o.Visualizzare almeno 100 celle per condizione. Infine, quantifica la percentuale di cellule che hanno incorporato EdU utilizzando la seguente formula. Effettuare studi di espressione genica e proteica secondo il protocollo di testo.Qui sono mostrate immagini rappresentative della colorazione SA-beta-gal nei fibroblasti primari proliferanti rispetto a quelli senescenti. Le cellule senescenti sembrano ingrandite all'interno di un corpo cellulare regolare. Come accennato, può essere difficile distinguere le singole cellule.Pertanto, la co-colorazione con DAPI facilita la visualizzazione e il conteggio delle cellule. In questo esperimento, la suflo-cy3-azide è stata utilizzata per eseguire la cicloaddizione azide-alchino catalizzata dal rame alla popolazione. Se l'accoppiamento dell'azide all'alchino ha avuto luogo, le cellule mostreranno fluorescenza sotto un filtro cy3 distinguendo le cellule proliferanti da quelle non proliferanti.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 36 ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di essere il più rapidi possibile quando si maneggiano le cellule all'esterno dell'incubatore, poiché le oscillazioni della concentrazione di ossigeno potrebbero influire sui risultati. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'array di citochine o il Western blot per rispondere a ulteriori domande come i livelli di proteine secrete o la comprensione di specifiche vie di segnalazione.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'invecchiamento e del cancro per esplorare come le cellule senescenti siano coinvolte nelle condizioni fisiologiche e patologiche nei mammiferi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indurre in modo riproducibile la senescenza nelle cellule primarie e come valutare il loro stato di senescenza.

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Biologia dello sviluppo

Sia senescenza impedisce o promuove la tumorigenesi rimane controverso. Poiché i farmaci chemioterapici possono indurre le cellule tumorali a senesce, studiando la senescenza è essenziale per proporre nuove terapie. Tuttavia, il dosaggio standard di β-galattosidasi e ampiamente utilizzato presenta gravi inconvenienti. Proponiamo qui un saggio di citometria di flusso basato rapido e sensibile per quantificare senescenza.

Un metodo sensibile per quantificare le cellule tumorali senescenti

senescenza cellulare, lo stato irreversibile di arresto del ciclo cellulare, può essere indotta da vari stress cellulari. Qui, descriviamo i protocolli per indurre la senescenza e metodi per valutare cellulare marcatori di senescenza.

Le tecniche per indurre e Quantificare cellulare senescenza

Qui presentiamo un protocollo dettagliato per rilevare entrambi senescenti e cellule staminali pluripotenti in muscolo scheletrico dopo un danno mentre induce in vivo riprogrammazione. Questo metodo è adatto per valutare il ruolo della senescenza cellulare durante rigenerazione tissutale e riprogrammazione in vivo.

Valutazione delle lesioni-indotta senescenza e In Vivo riprogrammazione nel muscolo scheletrico

ROS intracellulari è stato indicato per svolgere un ruolo importante nell'induzione della senescenza cellulare. Qui, descriviamo un test sensibile per quantificare i livelli di ROS durante la senescenza cellulare. Forniamo anche i protocolli per la valutazione del fenotipo secretivo senescenza-collegata, che secondo come riferito contribuisce a varie disfunzioni relative all'età.

Una misura quantitativa di specie reattive dell'ossigeno e senescenza-collegata di fenotipo secretivo in fibroblasti umani normali durante la senescenza indotta da Oncogene

La senescenza cellulare è il fattore chiave nello sviluppo di patologie croniche legate all'età. L'identificazione delle terapie che colpisce le cellule senescenti è promettente per estendere l'invecchiamento sano. Qui, presentiamo un nuovo saggio da vagliare per l'identificazione delle senoterapie sulla base della misurazione dell'attività di senescenza associata a z-Galactosidase in singole cellule.

Saggio di screening basato su SA-Galactosidase per l'identificazione dei farmaci senoterapici

L'immunofluorescenza multiplexata consente l'etichettatura sequenziale di più marcatori anticorpali all'interno di una singola sezione tissutale per supportare l'analisi spaziale dell'architettura tissutale e delle popolazioni cellulari. Qui viene presentato un flusso di lavoro per la rilevazione multiplex di marcatori strutturali, associati alla senescenza e immunologici, inclusa la preparazione manuale e automatizzata delle vetrine, l'imaging iterativo e l'analisi di singole cellule...

Saggio multiplexato di immunofluorescenza per la valutazione spaziale dei marcatori di senescenza in vivo

Questo protocollo presenta una microscopia confocale a luce riflessa per la rilevazione oggettiva e monocellulare dell'attività beta-galactosidasi associata alla senescenza (SA-β-gal) nella frazione stromale vascolare isolata dal tessuto adiposo umano. Il metodo è compatibile con l'immunocitochimica, incorpora controlli del pH per la valutazione quantitativa e offre inoltre un'alternativa più sensibile e meno soggettiva rispetto alla colorazione convenzionale SA-β-gal.

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Un protocollo standardizzato per l'indotta della senescenza prematura indotta dallo stress nei melanociti umani primari utilizzando idroperossido di tert-butil

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Profilazione lisosomica con LysoTracker per la valutazione quantitativa della senescenza cellulare nei fibroblasti umani

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Nuova combinazione di antiossidanti per ripristinare una comunicazione intercellulare sana in un modello in vitro utilizzando un mezzo condizionato da cellule senescenti

Scopri come indurre e convalidare la senescenza cellulare in fibroblasti primari umani usando doxorubicina e marcatori specifici. Questo protocollo riproducibile facilita la ricerca sull'invecchiamento e sul cancro.

Induzione e convalida della senescenza cellulare in cellule umane primarie

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