Differenziazione, manutenzione e l'analisi delle cellule dell'epitelio del pigmento retinico umano: un modello di malattia-in-un-piatto per le mutazioni BEST1

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle malattie retiniche correlate ai canali ionici sui meccanismi molecolari delle mutazioni BEST1 e sulla patologia delle bestrofilinopatie. Il vantaggio principale di questa tecnica è che elude la difficoltà di ottenere direttamente le cellule RPE dall'uomo. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle bestrofilinopatie, inclusa la malattia di Best, poiché le cellule RPE possono essere utilizzate sia per scopi di ricerca che per terapie di sostituzione cellulare.

Quando la coltura di hPSC raggiunge la confluenza, sostituire il terreno di coltura con quattro millilitri di terreno di differenziazione per pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Dopo due settimane di coltura, integrare il terreno di differenziazione con 100 nanogrammi per millilitro di activina-A umana, cambiando il terreno integrato tre volte alla settimana per altri 14 giorni. Il giorno 29, passare a un terreno di differenziazione non integrato per altre 8-10 settimane fino alla comparsa di cluster di cellule RPE pigmentate.

Per isolare le cellule RPE pigmentate, tenere prima le singole pipette di vetro Pasteur da nove pollici orizzontalmente sopra la fiamma di un bruciatore Bunsen, a circa due terzi della lunghezza della parte sottile della pipetta. Quando il vetro riscaldato diventa morbido, separare rapidamente le due estremità per formare una punta simile a un microraschietto alla nuova estremità della pipetta. Spruzzare le pipette estratte con etanolo al 70% e lasciarle asciugare all'aria in una cappa per colture cellulari.

Quando le pipette sono pronte, lavare ogni pozzetto della coltura di differenziazione con PBS e aggiungere un millilitro di tripsina allo 0,05% integrato con un'unità per microlitro di collagenasi a ciascun pozzetto. Dopo 20-30 minuti a 37 gradi Celsius, interrompere la digestione con due millilitri di terreno RPE a 37 gradi Celsius per pozzetto di una piastra a sei pozzetti e posizionare la piastra su un tavolino da microscopio. Utilizzando una pipetta estratta, picchiettare delicatamente i grappoli di RPE pigmentati.

Non appena le cellule si staccano dal fondo del pozzetto, utilizzare una micropipetta da 20 microlitri per trasferire le cellule dissociate nei singoli pozzetti di una nuova piastra di coltura cellulare contenente terreno RPE. Quando circa 5.000 cellule RPE sono state aggiunte a ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti, portare il volume finale fino a due millilitri con terreno RPE fresco e coltivare le cellule hPSC-RPE isolate per altre sei-otto settimane fino a quando non si osserva un monostrato di cellule RPE mature pigmentate e a forma di ciottolo. Da 24 a 72 ore prima del patch clamp, lavare le cellule monostrato pigmentate con due millilitri di PBS, quindi, dopo aver rimosso il PBS, aggiungere un millilitro di tripsina allo 0,05% più un'unità per microlitro di collagenasi alle cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti per un periodo di incubazione di otto minuti a 37 gradi Celsius.

Quando le cellule iniziano a staccarsi, utilizzare una micropipetta da un millilitro per lavare delicatamente le cellule dal fondo del pozzetto e raccogliere la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 millilitri. Aggiungere un millilitro di soluzione di tripsina-collagenasi a 37 gradi Celsius nel pozzetto. Incubare per altri otto minuti a 37 gradi Celsius, quindi lavare le cellule rimanenti dal fondo del pozzetto e combinare la sospensione cellulare nella stessa provetta conica da 15 millilitri.

Incubare le cellule in un bagno asciutto a 37 gradi Celsius per otto minuti, quindi utilizzare una micropipetta da un millilitro per triturare delicatamente le cellule da 10 a 15 volte. Dopo aver incubato e triturato le cellule altre due volte, aggiungere cinque millilitri di terreno RPE a 37 gradi Celsius alla sospensione a singola cellula e pellettare le cellule mediante centrifugazione. Risospendere il pellet nel volume appropriato per la semina su piastre pre-rivestite con vetrini di copertura al 10-20% di confluenza ed eseguire il patch clamp a cella intera secondo i protocolli standard.

Dopo il successo dell'isolamento, più del 90% delle cellule nella popolazione del passaggio zero dovrebbe maturare per mostrare la morfologia cellulare RPE. Con l'approccio basato su hPSC-RPE-disease-in-a-dish, ogni mutazione BEST1 specifica per il paziente può essere caratterizzata in modo completo per la sua espressione proteica, il traffico di membrana e la funzione dei canali ionici per ottenere informazioni critiche per chiarire i meccanismi patologici dell'RPE. Va notato che alcune mutazioni di BEST1 potrebbero influenzare la sua espressione proteica, quindi dovrebbero essere controllati anche altri marcatori RPE ben consolidati.

La differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane RPE richiede da tre a sei mesi, a seconda della linea di cellule staminali pluripotenti umane e del tipo di mutazione, e l'isolamento delle cellule pluripotenti umane differenziate può essere completato in due ore se eseguito correttamente. Durante il tentativo di dividere le celle per il patch clamp, è importante ricordare di triturare le cellule molto delicatamente per evitare un'eccessiva morte cellulare. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la coltura cellulare 3D di RPE, per rispondere a ulteriori domande su come il trasporto di ioni sulle membrane apicali e basali delle cellule RPE sia influenzato dalle mutazioni di BEST1.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle malattie degenerative della retina per esplorare i fenotipi fisiologici e i meccanismi patologici delle cellule RPE derivate da pazienti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come differenziare le cellule staminali pluripotenti in cellule dell'epitelio pigmentato retinico e preparare le cellule RPE per il patch clamp a cellula intera.