Montaggio veloce e scalabile e caricamento di proteine bioattive e immunostimolanti in nanovettori diversi sintetici tramite Flash nanoprecipitazione

Riteniamo che l'uso della nanoprecipitazione flash per assemblare nanostrutture complesse consentirà ai ricercatori che non hanno una vasta esperienza in chimica, ingegneria o scienza dei nanomateriali di fabbricare sistemi avanzati di somministrazione di farmaci in modo indipendente per le proprie applicazioni ed esigenze specifiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è la generazione di grandi volumi di diverse nanostrutture ad alta concentrazione, bassa polidispersità e caricate con molecole bioattive, inclusi farmaci a piccole molecole e proteine, tutte formate in condizioni sterili. In generale, gli individui che non conoscono la sintesi dei polimeri possono avere difficoltà perché il componente del solfuro di polipropilene è altamente sensibile all'ossidazione dovuta all'esposizione all'aria.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi multiple dell'impingement sono difficili da apprendere perché devono essere eseguite molto rapidamente in successione. Per sterilizzare i getti a impatto confinato, o miscelatore CIJ, lavorare all'interno di una cabina di sicurezza biologica per immergere il miscelatore con tutte le parti smontate in idrossido di sodio molare a punto zero durante la notte. Rimontare il miscelatore CIJ e far fluire acqua priva di endotossine attraverso il miscelatore utilizzando siringhe luerlock, testare il ph dell'acqua e continuare a far scorrere l'acqua fino a quando il ph non viene registrato come neutro.

Per preparare la soluzione di urmingement uno, pesare prima 20 milligrammi del polimero sintetizzato in una provetta da cinque millilitri. Quindi, aggiungi coloranti idrofobici, farmaci o altro carico. Infine, aggiungere 500 microlitri di tetraidrofurano al 100% al polimero e caricare, vorticare energicamente per sciogliere.

Per preparare la soluzione di impingement due, sciogliere il carico idrofilo da caricare all'interno delle vescicole polimeriche in 500 microlitri di un tampone acquoso. Aggiungere 2,5 millilitri di un tampone acquoso a scelta in un serbatoio di dimensioni adeguate. Ora, posizionare il serbatoio sotto il miscelatore CIJ in modo tale che il deflusso dal miscelatore entri direttamente nel serbatoio.

Caricare le soluzioni di uringement in siringhe monouso di plastica separate da un millilitro, far entrare le soluzioni l'una contro l'altra per formare simultaneamente nanostrutture inserendo siringhe negli adattatori luerlock nella parte superiore del miscelatore CIJ. Con un movimento unico, fluido e rapido, premere entrambe le siringhe contemporaneamente e con la stessa forza. Se devono essere eseguiti più impingement, è fondamentale che vengano eseguiti il più rapidamente possibile per ridurre la perdita di solvente organico valtower.

Per eseguire più impingement, dividere la soluzione di nanostruttura nascente tra due siringhe e ripetere questo passaggio fino a quattro volte. Raccogliere il deflusso nel serbatoio acquoso riempito di tampone e mescolare delicatamente per garantire la miscelazione. Ci sono diverse opzioni per rimuovere il carico scaricato e il solvente organico.

La formulazione di nanocarrier può essere rimossa attraverso l'esclusione delle accise o la colonna di desalinizzazione, attraverso un sistema di filtrazione a flusso tangenziale, attraverso l'essiccazione sotto vuoto o attraverso la dialisi, come dimostrato qui. Dializzare la formulazione del nanovettore nello stesso tampone acquoso e nello stesso serbatoio utilizzato per l'impingement. Utilizzare un tubo con un cutoff di peso molecolare appropriato per almeno 24 ore, con almeno due cambi di tampone.

Una volta che il carico scaricato è stato rimosso dal solvente organico, concentrare la formulazione del nanocarrier utilizzando un sistema di concentrazione di centrifuga seguendo le istruzioni del produttore. I nanovettori possono essere conservati a quattro gradi Celsius per settimane o mesi. Prima dell'uso dopo lo stoccaggio, le formulazioni di nanocarrier devono essere brevemente agitate.

Eseguire la fabbricazione di una pompa a siringa ad alta velocità come descritto nel protocollo di testo. Per utilizzare la modalità di esecuzione automatica, selezionare l'esecuzione automatica dal menu principale. Il sistema chiederà agli utenti di consentire al motore di posizionare automaticamente la piattaforma di espulsione della siringa all'inizio del vetrino di precisione.

Assicurarsi che il percorso davanti e dietro la piastra metallica sia libero prima di procedere. Caricare il miscelatore CIJ nell'apertura rettangolare del carrello di espulsione posteriore. Quindi, caricare siringhe di plastica da un millilitro come prima e montare le siringhe sui connettori femmina dell'esca del miscelatore CIJ.

Prima di avviare lo strumento, impostare la velocità del motore desiderata e verificare che il sistema sia libero come descritto nel protocollo di testo. Per espellere i reagenti dalle siringhe e nel miscelatore CIJ, premere il pulsante di esecuzione nell'interfaccia del software. Micrografie elettroniche a trasmissione criogenica rappresentative dimostrano polimerisomi più piccoli e più monodispersi dopo ripetuti impingement.

L'analisi dinamica della diffusione della luce ha confermato uno spostamento verso sinistra della distribuzione dimensionale dei polimeri dopo ripetuti impingement. Dopo cinque impatti ripetuti, il diametro medio e la polidispersione dei polimerisomi corrispondono a quelli dei campioni estrusi formati dalla reidratazione del film sottile. La nanoprecipitazione flash può essere utilizzata per caricare una varietà di piccole molecole e macromolecole idrofobiche e idrofile nei polimerisomi.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni su come funzionano le immunoterapie e i vaccini, può anche essere applicato allo studio di come i polimeri si autoassemblano in complesse nanostrutture. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come la somministrazione endovenosa o sottocutanea a modelli animali per determinare quali sottogruppi cellulari internalizzano le nanoparticelle o qual è la via di eliminazione per le diverse nanostrutture. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle malattie cardiache e del cancro, nonché allo sviluppo di vaccini per le malattie infettive perché questi nanovettori possono indirizzare più farmaci a cellule immunitarie molto specifiche.