Name: Montaggio veloce e scalabile e caricamento di proteine bioattive e immunostimolanti in nanovettori diversi sintetici tramite Flash nanoprecipitazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Scopri la flash nanoprecipitazione per assemblare nanostrutture complesse e caricare proteine bioattive in nanovettori sintetici. Questo metodo consente ai ricercatori di creare sistemi avanzati di drug delivery in modo scalabile e sterile.

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Riconosciamo che il personale e strumentazione sostiene provenienti dall'impianto di biologia strutturale alla Northwestern University. Il supporto dall'U.R. Lurie completa cancro centro della Northwestern University e le strutture di biologia strutturale Università nordoccidentale è riconosciuto. Il rivelatore di elettroni diretto Gatan K2 è stato acquistato con i fondi forniti dal Consorzio biomedica di Chicago con il supporto dei fondi Searle a The Chicago comunità Trust. Ringraziamo anche i seguenti servizi presso la Northwestern University: il laboratorio di Scienze Keck superficie interdisciplinare, la funzione di biologia strutturale, la struttura biologica di Imaging, il Center for Advanced Imaging molecolare e analitica Bionanotecnologia attrezzature Core. Questa ricerca è stata sostenuta dalla concessione della National Science Foundation 1453576, istituti nazionali di salute direttore nuovo Innovator Award 1DP2HL132390-01, il Center for rigenerativa nanomedicina Catalyst Award e il premio di catalizzatore McCormick 2014. SDA è stato in parte sostenuto da NIH predoctoral biotecnologia Training Grant T32GM008449.

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<li>Karabin, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+micellar+delivery+via+inducible+transitions+in+nanostructure+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Sustained micellar delivery via inducible transitions in nanostructure morphology.</a> Nature Communications. 9 (1), 624(2018).</li>
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<li>Gindy, M. E., Panagiotopoulos, A. Z., Prud'homme, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composite+block+copolymer+stabilized+nanoparticles%3A+simultaneous+encapsulation+of+organic+actives+and+inorganic+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Composite block copolymer stabilized nanoparticles: simultaneous encapsulation of organic actives and inorganic nanostructures.</a> Langmuir. 24 (1), 83-90 (2008).</li>
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Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Abbiamo fornito dettagliate istruzioni per la realizzazione rapida di polymersomes utilizzando PEG17-bl- PPS35-SH come il copolimero diblock. Polymersomes vescicolare sono la morfologia di aggregata primaria assemblata con questa proporzione di PEG idrofili e idrofobi PPS blocco molecolare peso. Quando impinged più volte, hanno un diametro e polidispersità che corrisponde polymersomes estruso attraverso una membrana nm 200 dopo essere stata formata tramite idratazione a film sottil...

Nanovettori consentono per la consegna controllata di merci piccole e macromolecolare, tra cui entità attive che, se non incapsulato, sarebbe troppo idrofobico per somministrazione in vivoe/o altamente degradabili. Delle morfologie di nanocarrier regolarmente fabbricate, polimeriche vescicole analoghe a liposomi (chiamati anche polymersomes) offrono la possibilità di caricare contemporaneamente idrofile e idrofobe cargo1,2. Malgrado i loro vantaggi promettenti, sono ancora rari in applicazioni cliniche polymersomes dovuta, in parte, alle diverse sfide chiave nella loro produzione. Per uso clinico, polymersome formulazioni devono essere effettuate in batch su vasta scala, sterile e coerente.
Una serie di tecniche può essere utilizzato per polymersomes forma da un copolimero diblock, ad esempio poly(ethylene glycol) -block-poli (solfuro di propilene) (PEG -bl- PPS), che includono dispersione solvente3, film sottile reidratazione1 , 4, microfluidica 5,6e idratazione diretta7. Dispersione di solvente comporta tempi di incubazione lungo in presenza di solventi organici, che possono denaturare alcuni payload bioattivi, come le proteine. Reidratazione di film sottile non offrono controllo sopra la polidispersità del formato polymersomes, spesso richiedono tecniche di estrusione costoso e richiede tempo per ottenere monodispersity accettabile. Inoltre, sia microfluidica e idratazione diretta sono difficili da scala per grandi volumi di produzione. Dei metodi di fabbricazione diversi nanocarrier, flash nanoprecipitazione (FNP) offre la possibilità di fare su larga scala e riproducibile formulazioni8,9,10. Mentre FNP precedentemente era riservata per la formulazione di nanoparticelle solid-core, il nostro laboratorio ha recentemente esteso l'utilizzo di FNP per includere la costante formazione di diversi PEG -bl- PPS nanostruttura morfologie11, 12, tra cui polymersomes11 e bicontinue nanosfere12. Abbiamo trovato che FNP era in grado di formare monodispersi formulazioni di polymersomes senza la necessità di estrusione, determinando i valori di indice di polidispersione superiore rispetto ai non-estruso polymersomes formata da dispersione di reidratazione e solvente di film sottile 11. bicontinue nanosfere, con loro grande domini idrofobici, non erano in grado di essere formata da reidratazione di film sottile, nonostante la formazione nell'ambito di una serie di condizioni solvente con FNP12.
Qui, forniamo una descrizione dettagliata per la sintesi di PEG -bl- PPS diblock Copolimero utilizzato nella formazione di polymersome, il mixer di getti (CIJ) di impingement confinati utilizzato per FNP, il FNP protocollo stesso e l'applicazione di un sistema automatizzato per ridurre la variabilità di utente. Sono disponibili informazioni su come sterilizzare il sistema sufficientemente per produrre privo di endotossina formulazioni per uso in vivoe dati rappresentativi riguardanti la caratterizzazione di polymersomes formata da FNP. Con queste informazioni, i lettori con interesse che utilizza polymersomes per lavoro in vitro e in vivo saranno in grado di fabbricare le proprie formulazioni monodispersi sterile. Lettori con esperienza nelle formulazioni di nanocarrier e con competenze di sintesi del polimero sarà in grado di testare rapidamente i propri sistemi di polimero usando FNP come un'alternativa potenziale alle loro tecniche di formulazione attuale. Inoltre, i protocolli descritti nel presente documento possono essere utilizzati come strumenti didattici per la formulazione dei nanovettori in corsi di laboratorio di nanotecnologia.

<table><tbody><tr><td>CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate Starter Kit - Edizione 32 GB</td><td>CanaKit</td><td>UPC 682710991511</td><td></td></tr><tr><td>Piattaforma di cuscinetti lineari (piccola) - Diametro 8 mm</td><td>Movimento lineare Adafruit</td><td>1179</td><td></td></tr><tr><td>Albero da 8 mm, lunghezza 330 mm, cromato, cementato, metrico</td><td>VXB</td><td>kit11868</td><td></td></tr><tr><td>Guida/supporto albero per guida lineare - Diametro 8 mm</td><td>Adafruit</td><td>1182</td><td></td></tr><tr><td>Scivolo di precisione in posizione manuale 4,5" Corsa, capacità di carico 15 lb</td><td>McMaster-Carr</td><td>5236A16</td><td></td></tr><tr><td>MTPM-P10-1JK43 Iron Horse Motore CC</td><td>Iron Horse</td><td>MTPM-P10-1JK43</td><td></td></tr><tr><td>Raspberry Pi Foundation Display LCD touchscreen da 7" ufficiale</td><td>Raspberry Pi</td><td>B0153R2A9I (ASIN)</td><td></td></tr><tr><td>PicoBorg Reverse - Controllo motore avanzato per Raspberry Pi</td><td>PiBorg</td><td>BURN-0011</td><td></td></tr><tr><td>Pololu Carrier con sensore di distanza digitale Sharp GP2Y0D810Z0F 10cm</td><td>Pololu</td><td>1134</td><td></td></tr><tr><td>Ruland PSR16-5-4-A Giunto a vite di fermo, alluminio lucidato, pollici, 5/16" Foro A Diametro, 1/4" Foro B Diametro, 1" OD, 1-1/4" Lunghezza, 44 lb-in Coppia nominale</td><td>Ruland</td><td>PSR16-5-4-A</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicole monometil etere</td><td>Sigma Aldrich</td><td>202495</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di metansolfonile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>471259</td><td></td></tr><tr><td>Toluene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>179418</td><td></td></tr><tr><td>Toluene, Anidro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>Trietilammina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>Celite 545 (Terra di diatomee)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>419931</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>320269</tr><tr><td>Etere dietilico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimetilformammide, anidro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato di potassio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>791776</td><td></td></tr><tr><td>Acido tiocetico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T30805</td><td></td></tr><tr><td>Tetraidrofurano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>360589</td><td></td></tr><tr><td>Alluminio ossido, neutro, attivato, Brockmann I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>199974</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di metossido di sodio, 0,5 M in metanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>403067</td><td></td></tr><tr><td>Solfuro di propilene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P53209</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320390</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di idrossido di sodio 1,0 N</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2770</td><td></td></tr><tr><td>Acqua priva di endotossine</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30529.01</td><td></td></tr><tr><td>Strisce di pH in carta</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-640-508</td><td></td></tr><tr><td>PBS di Dulbecco senza endotossine Fiale</td> a scintillazione in vetro borosilicato <td>Sigma Sigma Aldrich</td><td>TMS-012</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-4</td><td></td></tr><tr><td>1 mL siringa interamente in plastica</td><td>Thermo Scientific</td><td>S75101</td><td></td></tr><tr><td>Sepharose CL-6B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CL6B200</td><td></td></tr><tr><td>Colonna per cromatografia liquida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4169</td><td></td></tr><tr><td>Miscelatore CIJ, HDPE</td><td>Custom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di perossido di idrogeno</td><td>Sigma</td><td>Aldrich 216763</td><td></td></tr><tr><td>HEK-Blue hTLR4</td><td>InvivoGen</td><td>hkb-htlr4</td><td></td></tr><tr><td>RAW-Blue Cells</td><td>InvivoGen</td><td>raw-sp</td><td></td></tr><tr><td>QUANTI-Blue</td><td>InvivoGen</td><td>rep-qb1</td><td></td></tr><tr><td>PYROGENT Gel Clot LAL Saggi</td><td>Lonza</td><td>N183-125</td><td></td></tr></tbody></table>

montaggio veloce e scalabile e caricamento di proteine bioattive e immunostimolanti in nanovettori diversi sintetici tramite flash nanoprecipitazione

Rapid, Scalable Assembly and Loading of Bioactive Proteins and Immunostimulants into Diverse Synthetic Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation

Nanomateriali presentano una vasta gamma di opzioni per personalizzare il rilascio controllato di payload molecolare singolo e combinato per applicazioni terapeutiche e imaging. Questa specificità aumentata può avere implicazioni cliniche significative, tra cui una riduzione di effetti collaterali e i dosaggi più bassi con potenza superiore. Inoltre, in situ di mira e modulazione controllata dei sottoinsiemi delle cellule specifiche può migliorare le indagini in vitro e in vivo dei fenomeni biologici fondamentali e sonda la funzione delle cellule. Purtroppo, le competenze necessarie in nanoscala scienza, chimica e ingegneria spesso vietare laboratori senza esperienza in questi campi da fabbricare e personalizzazione dei nanomateriali come strumenti per i loro studi o veicoli per loro strategie terapeutiche. Qui, forniamo i protocolli per la sintesi e l'assemblaggio scalabile di un sistema di copolimero versatile non tossico blocco suscettibile alla formazione facile e carico di veicoli su scala nanometrica per applicazioni biomediche. Flash nanoprecipitazione si presenta come una metodologia per la fabbricazione rapida di nanovettori varia da poly(ethylene glycol) -bl-copolimeri di poly (solfuro di propilene). Questi protocolli permetterà laboratori con una vasta gamma di competenze e risorse per facilmente e riproducibile fabbricare nanocarrier avanzati sistemi di consegna per le loro applicazioni. Processo di progettazione e costruzione di uno strumento automatizzato che impiega una pompa a siringa ad alta velocità per facilitare la nanoprecipitazione flash e per consentire un controllo maggiore sull'omogeneità, dimensione, morfologia e caricamento dei nanovettori polymersome è descritto.

Qui, abbiamo presentato un semplice protocollo per la formulazione dei nanovettori in grado di caricare merci idrofilici e idrofobici che sono sicuri per in vivo mouse e primate non umano amministrazione11,13. Abbiamo anche incluso un protocollo dettagliato per la sintesi del polimero utilizzato nei nostri risultati rappresentativi, insieme a una descrizione per la realizzazione di uno strumento personalizzato per l'urto ...

Nanomateriali forniscono meccanismi versatili di consegna controllata terapeutico per scienza di base e traslazionale applicazioni, ma spesso la loro fabbricazione richiede competenze che non sono disponibile in più biomedical laboratories. Qui, presentiamo i protocolli per la fabbricazione scalabile e terapeutico carico di diversi nanovettori auto-assemblati utilizzando flash nanoprecipitazione.

Montaggio veloce e scalabile e caricamento di proteine bioattive e immunostimolanti in nanovettori diversi sintetici tramite Flash nanoprecipitazione

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging ...

Riteniamo che l'uso della nanoprecipitazione flash per assemblare nanostrutture complesse consentirà ai ricercatori che non hanno una vasta esperienza in chimica, ingegneria o scienza dei nanomateriali di fabbricare sistemi avanzati di somministrazione di farmaci in modo indipendente per le proprie applicazioni ed esigenze specifiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è la generazione di grandi volumi di diverse nanostrutture ad alta concentrazione, bassa polidispersità e caricate con molecole bioattive, inclusi farmaci a piccole molecole e proteine, tutte formate in condizioni sterili. In generale, gli individui che non conoscono la sintesi dei polimeri possono avere difficoltà perché il componente del solfuro di polipropilene è altamente sensibile all'ossidazione dovuta all'esposizione all'aria.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi multiple dell'impingement sono difficili da apprendere perché devono essere eseguite molto rapidamente in successione. Per sterilizzare i getti a impatto confinato, o miscelatore CIJ, lavorare all'interno di una cabina di sicurezza biologica per immergere il miscelatore con tutte le parti smontate in idrossid

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Questo articolo descrive un metodo per sintetizzare nanoprecipitation polimero a base di nanoparticelle utilizzando diblock co-polimeri. Discuteremo la sintesi di copolimeri diblock, la tecnica nanoprecipitation e potenziali applicazioni.

Formulazione di nanoparticelle polimeriche diblock attraverso Tecnica Nanoprecipitation

In questo articolo, un metodo ad alta velocità viene presentato per la sintesi di oligosaccaridi e fissaggio alla superficie delle nanoparticelle polianidride per ulteriore uso in mira specifici recettori sulle cellule presentanti l'antigene.

High-throughput sintesi dei carboidrati e funzionalizzazione di nanoparticelle polianidride

Descriviamo tecniche basate sull'imaging di animali interi e citometria a flusso per monitorare l'espansione delle cellule T CD8+ antigene-specifiche in risposta all'immunizzazione con nanoparticelle in un modello murino di vaccinazione.

Imaging Whole-animale e di citometria a flusso tecniche di analisi di Antigen-specific CD8 + cellule T Risposte dopo nanoparticelle vaccinazione

Segnaliamo un'applicazione intelligente di nanotubi di carbonio per la stabilizzazione cinetica di particelle lipidiche che contengono nanostrutture auto-assemblate nei loro nuclei. La preparazione di particelle lipidiche richiede concentrazioni piuttosto basse di nanotubi di carbonio che ne consentono l'uso in applicazioni biomediche come la somministrazione di farmaci.

Preparazione facile di Internamente auto-assemblato Lipid particelle stabilizzati da nanotubi di carbonio

L'omogeneizzazione semplice è stata usata per preparare nanoparticelle nuove, ad alta densità, che simulano lipoproteine ​​per incapsulare il fattore di crescita del nervo. Le sfide, i protocolli dettagliati per la preparazione di nanoparticelle, la caratterizzazione in vitro e gli studi in vivo sono descritti in questo articolo.

Preparazione e caratterizzazione di novel nanoparticelle che imitano HDL per l&#39;incapsulamento del fattore di crescita del nervo

Flash nanoprecipitazione (FNP) è un approccio scalabile per produrre nanoparticelle core-shell polimeriche. Formulazioni su scala di laboratorio per l'incapsulamento di terapeutica idrofila o idrofoba sono descritti.

Flash nanoprecipitazione per l'incapsulamento di composti idrofobi e idrofili in nanoparticelle polimeriche

All'interfaccia di solventi organici e acquosi, proteine arofhiliche elastine su misura si assemblano in complesse strutture supramolecolari come vescicoli, fibre e coacervate innescate da parametri ambientali. I protocolli di assemblaggio descritti producono compartimenti basati su membrana proteica (PMBC) con proprietà regolabili, consentendo l'incapsulamento di vari carichi.

Diretto Assemblea di proteine Elastin-like in strutture supramolecolari definite e Incapsulamento di carico In Vitro

Le nanoparticelle lipidiche sono sviluppate utilizzando un approccio di piattaforma di miscelazione microfluidica per l'incapsulamento di mRNA e DNA.

Formulazione e caratterizzazione di nanoparticelle lipidiche per la somministrazione genica utilizzando una piattaforma di miscelazione microfluidica

Qui viene presentato un semplice protocollo per la produzione di nanoparticelle di mRNA basate su polimeri poli(beta aminoestere), facili da personalizzare cambiando l'mRNA incapsulato. Viene inoltre descritto il flusso di lavoro per la sintesi dei polimeri, le nanoparticelle e la loro caratterizzazione essenziale in vitro. Viene aggiunta anche una prova di concetto per quanto riguarda l'immunizzazione.

Sintesi e caratterizzazione di nanoparticelle poli(beta aminoesters) caricate con mRNA a fini vaccinali

I nanogel sono un'eccellente e versatile piattaforma di nanoparticelle per la somministrazione di farmaci biologici. I nano-gel polimerici a base di poli(etilene) glicole responsivi agli stimoli, in grado di incapsulare carichi utili basati su proteine, sono stati sintetizzati utilizzando una strategia di co-nanopolimerizzazione cross-linking in un'unica fase in condizioni acquose. La fabbricazione e la caratterizzazione ottimali di queste nuove nanoparticelle sono presentate qui.

Sintesi di nanogel responsivi agli stimoli mediante reticolazione acquosa in un solo passaggio e co-nanopolimerizzazione

Viene dimostrato un protocollo dettagliato per la sintesi di nanoparticelle lipidiche (LNP) utilizzando tecnologie di miscelazione a getto a impatto confinato (CIJ), tra cui un CIJ a due getti e un miscelatore a vortice multi-ingresso a quattro getti (μMIVM). I miscelatori CIJ generano ambienti di micromiscelazione riproducibili e turbolenti, con conseguente produzione di LNP monodispersi.

Sintesi di nanoparticelle lipidiche mediante flusso turbolento in miscelatori a getto a impatto confinato

Scopri la flash nanoprecipitazione per assemblare nanostrutture complesse e caricare proteine bioattive in nanovettori sintetici. Questo metodo consente ai ricercatori di creare sistemi avanzati di drug delivery in modo scalabile e sterile.

Montaggio veloce e scalabile e caricamento di proteine bioattive e immunostimolanti in nanovettori diversi sintetici tramite Flash nanoprecipitazione (Video) | JoVE Journal

Montaggio veloce e scalabile e caricamento di proteine bioattive e immunostimolanti in nanovettori diversi sintetici tramite Flash nanoprecipitazione

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