Name: Purificazione e la ricostituzione di TRPV1 per analisi spettroscopiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Scopri i protocolli di purificazione e ricostituzione di TRPV1 per analisi spettroscopiche EPR e DEER. Questi metodi permettono di ottenere quantità milligrammo di canale ionico funzionale per studi strutturali.

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Siamo molto grati al Dr. H. Mchaourab per fornire l'accesso per gli spettrometri EPR e cervi e Dr. T. Rosenbaum per fornire il plasmide di TRPV1 cisteina-meno full-length.

<ol><li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504, 107-112 (2013).</li>
<li>Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+structures+in+distinct+conformations+reveal+activation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms.</a> Nature. 504, 113-118 (2013).</li>
<li>Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+structures+in+nanodiscs+reveal+mechanisms+of+ligand+and+lipid+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action.</a> Nature. , (2016).</li>
<li>Yang, F., Xiao, X., Cheng, W., Yang, W., Yu, P., Song, Z., Yarov-Yarovoy, V., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanism+underlying+capsaicin+binding+and+activation+of+the+TRPV1+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural mechanism underlying capsaicin binding and activation of the TRPV1 ion channel.</a> Nat Chem Biol. 11, 518-524 (2015).</li>
<li>Bae, C., Anselmi, C., Kalia, J., Jara-Oseguera, A., Schwieters, C. D., Krepkiy, D., Won Lee, C., Kim, E. H., Kim, J. I., Faraldo-Gomez, J. D., Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+mechanism+of+activation+of+the+TRPV1+channel+by+a+membrane-bound+tarantula+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the mechanism of activation of the TRPV1 channel by a membrane-bound tarantula toxin.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+KvAP+voltage-dependent+K%2B+channel+in+a+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the KvAP voltage-dependent K+ channel in a lipid bilayer.</a> Science. 306, 491-495 (2004).</li>
<li>Cordero-Morales, J. F., Jogini, V., Lewis, A., Vasquez, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+driving+forces+determining+potassium+channel+slow+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular driving forces determining potassium channel slow inactivation.</a> Nat Struct Mol Biol. 14, 1062-1069 (2007).</li>
<li>Cordero-Morales, J. F., Cuello, L. G., Zhao, Y., Jogini, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+of+gating+at+the+potassium-channel+selectivity+filter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants of gating at the potassium-channel selectivity filter.</a> Nat Struct Mol Biol. 13, 311-318 (2006).</li>
<li>Basak, S., Schmandt, N., Gicheru, Y., Chakrapani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+and+dynamics+of+a+lipid-induced+potential+desensitized-state+of+a+pentameric+ligand-gated+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Crystal structure and dynamics of a lipid-induced potential desensitized-state of a pentameric ligand-gated channel.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+mechanism+for+MscS+gating+in+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers.</a> Science. 321, 1210-1214 (2008).</li>
<li>Perozo, E., Kloda, A., Cortes, D. M., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+principles+underlying+the+transduction+of+bilayer+deformation+forces+during+mechanosensitive+channel+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Physical principles underlying the transduction of bilayer deformation forces during mechanosensitive channel gating.</a> Nat Struct Biol. 9, 696-703 (2002).</li>
<li>Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+channel+structure+of+MscL+and+the+gating+mechanism+of+mechanosensitive+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels.</a> Nature. 418, 942-948 (2002).</li>
<li>Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+rearrangements+underlying+K%2B-channel+activation+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating.</a> Science. 285, 73-78 (1999).</li>
<li>Goehring, A., Lee, C. H., Wang, K. H., Michel, J. C., Claxton, D. P., Baconguis, I., Althoff, T., Fischer, S., Garcia, K. C., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nat Protoc. 9, 2574-2585 (2014).</li>
<li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20, 1293-1299 (2012).</li>
<li>Gonzales, E. B., Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pore+architecture+and+ion+sites+in+acid-sensing+ion+channels+and+P2X+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pore architecture and ion sites in acid-sensing ion channels and P2X receptors.</a> Nature. 460, 599-604 (2009).</li>
<li>McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motion+of+spin-labeled+side+chains+in+T4+lysozyme.+Correlation+with+protein+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics.</a> Biochemistry. 35, 7692-7704 (1996).</li>
<li>Columbus, L., Kalai, T., Jeko, J., Hideg, K., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motion+of+spin+labeled+side+chains+in+alpha-helices%3A+analysis+by+variation+of+side+chain+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular motion of spin labeled side chains in alpha-helices: analysis by variation of side chain structure.</a> Biochemistry. 40, 3828-3846 (2001).</li>
<li>Zou, P., McHaourab, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+sensitivity+and+extended+range+of+distance+measurements+in+spin-labeled+membrane+proteins%3A+Q-band+double+electron-electron+resonance+and+nanoscale+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers.</a> Biophys J. 98, L18-L20 (2010).</li>
<li>Vasquez, V., Sotomayor, M., Cortes, D. M., Roux, B., Schulten, K., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+architecture+of+membrane-embedded+MscS+in+the+closed+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional architecture of membrane-embedded MscS in the closed conformation.</a> J Mol Biol. 378, 55-70 (2008).</li>
<li>Autzen, H. E., Myasnikov, A. G., Campbell, M. G., Asarnow, D., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+TRPM4+ion+channel+in+a+lipid+nanodisc%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc.</a> Science. 359, 228-232 (2018).</li>
<li>Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Nanodiscs+as+a+Tool+for+High-Resolution+Structure+Determination+of+Membrane+Proteins+by+Single-Particle+Cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Lipid Nanodiscs as a Tool for High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins by Single-Particle Cryo-EM.</a> Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).</li>
<li>Guo, J., She, J., Zeng, W., Chen, Q., Bai, X. C., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+calcium-activated%2C+non-selective+cation+channel+TRPM4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4.</a> Nature. 552, 205-209 (2017).</li>
<li>McGoldrick, L. L., Singh, A. K., Saotome, K., Yelshanskaya, M. V., Twomey, E. C., Grassucci, R. A., Sobolevsky, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opening+of+the+human+epithelial+calcium+channel+TRPV6%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Opening of the human epithelial calcium channel TRPV6.</a> Nature. 553, 233-237 (2018).</li>
<li>Dang, S., Feng, S., Tien, J., Peters, C. J., Bulkley, D., Lolicato, M., Zhao, J., Zuberbuhler, K., Ye, W., Qi, L., Chen, T., Craik, C. S., Nung Jan, Y., Minor, D. L. Jr, Cheng, Y., Yeh Jan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structures+of+the+TMEM16A+calcium-activated+chloride+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structures of the TMEM16A calcium-activated chloride channel.</a> Nature. , (2017).</li>
<li>Velisetty, P., Stein, R. A., Sierra-Valdez, F. J., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+Purification+of+the+Pain+Receptor+TRPV1+for+Spectroscopic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Expression and Purification of the Pain Receptor TRPV1 for Spectroscopic Analysis.</a> Sci Rep. 7, 9861(2017).</li>
<li>Salazar, H., Llorente, I., Jara-Oseguera, A., Garcia-Villegas, R., Munari, M., Gordon, S. E., Islas, L. D., Rosenbaum, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+N-terminal+cysteine+in+TRPV1+determines+activation+by+pungent+compounds+from+onion+and+garlic%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A single N-terminal cysteine in TRPV1 determines activation by pungent compounds from onion and garlic.</a> Nat Neurosci. 11, 255-261 (2008).</li>
<li>Cao, E., Cordero-Morales, J. F., Liu, B., Qin, F., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+channels+are+intrinsically+heat+sensitive+and+negatively+regulated+by+phosphoinositide+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">TRPV1 channels are intrinsically heat sensitive and negatively regulated by phosphoinositide lipids.</a> Neuron. 77, 667-679 (2013).</li>
<li>Braman, J., Papworth, C., Greener, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+using+double-stranded+plasmid+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis using double-stranded plasmid DNA templates.</a> Methods Mol Biol. 57, 31-44 (1996).</li>
<li>Gracheva, E. O., Cordero-Morales, J. F., Gonzalez-Carcacia, J. A., Ingolia, N. T., Manno, C., Aranguren, C. I., Weissman, J. S., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganglion-specific+splicing+of+TRPV1+underlies+infrared+sensation+in+vampire+bats%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ganglion-specific splicing of TRPV1 underlies infrared sensation in vampire bats.</a> Nature. 476, 88-91 (2011).</li>
<li>Guan, B., Chen, X., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-electrode+voltage+clamp%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-electrode voltage clamp.</a> Methods Mol Biol. 998, 79-89 (2013).</li>
<li>Jarecki, B. W., Makino, S., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+Shaker+potassium+channels+produced+by+cell-free+translation+upon+injection+into+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Function of Shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into Xenopus oocytes.</a> Sci Rep. 3, 1040(2013).</li>
<li>Jeschke, G., Polyhach, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurements+on+spin-labelled+biomacromolecules+by+pulsed+electron+paramagnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance.</a> Phys Chem Chem Phys. 9, 1895-1910 (2007).</li>
<li>Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dead-time+free+measurement+of+dipole-dipole+interactions+between+electron+spins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins.</a> J Magn Reson. 142, 331-340 (2000).</li>
<li>Mishra, S., Verhalen, B., Stein, R. A., Wen, P. C., Tajkhorshid, E., McHaourab, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+dynamics+of+the+nucleotide+binding+domains+and+the+power+stroke+of+a+heterodimeric+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Conformational dynamics of the nucleotide binding domains and the power stroke of a heterodimeric ABC transporter.</a> Elife. 3, e02740(2014).</li>
<li>Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+labeled+cysteines+as+sensors+for+protein-lipid+interaction+and+conformation+in+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin.</a> Photochem Photobiol. 56, 1019-1033 (1992).</li>
<li>Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+capsaicin+receptor%3A+a+heat-activated+ion+channel+in+the+pain+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway.</a> Nature. 389, 816-824 (1997).</li>
<li>McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+fourth+dimension+of+membrane+protein+structure%3A+insight+into+dynamics+from+spin-labeling+EPR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy.</a> Structure. 19, 1549-1561 (2011).</li>
<li>Jeschke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEER+distance+measurements+on+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">DEER distance measurements on proteins.</a> Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).</li>
<li>Jeschke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurements+in+the+nanometer+range+by+pulse+EPR%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">Distance measurements in the nanometer range by pulse EPR.</a> Chemphyschem. 3, 927-932 (2002).</li>
<li>Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+determination+of+pair+distance+distributions+by+pulsed+ESR+using+Tikhonov+regularization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization.</a> J Magn Reson. 172, 279-295 (2005).</li>
<li>He, Y., Wang, K., Yan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recombinant+expression+systems+for+structure+determination+of+eukaryotic+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">The recombinant expression systems for structure determination of eukaryotic membrane proteins.</a> Protein Cell. 5, 658-672 (2014).</li>
<li>Ghimire, H., McCarrick, R. M., Budil, D. E., Lorigan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significantly+improved+sensitivity+of+Q-band+PELDOR%2FDEER+experiments+relative+to+X-band+is+observed+in+measuring+the+intercoil+distance+of+a+leucine+zipper+motif+peptide+%28GCN4-LZ%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Significantly improved sensitivity of Q-band PELDOR/DEER experiments relative to X-band is observed in measuring the intercoil distance of a leucine zipper motif peptide (GCN4-LZ).</a> Biochemistry. 48, 5782-5784 (2009).</li>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Tecnologie attuali per espressione e purificazione di proteine di membrana dei mammiferi hanno reso possibile ottenere una quantità sufficiente di proteina per gli studi spettroscopici14,15,16,42. Qui, abbiamo adattato queste tecnologie per esprimere, purificare, ricostituire ed eseguire analisi spettroscopiche in TRPV1.
Tra i passaggi critici nel protocollo, qui sot...

Con gli avanzamenti recenti nella singola particella cRIO-microscopia elettronica (cryo-EM), strutture di canale ionico dei mammiferi sono stati ottenuti ad un ritmo straordinario. In particolare, gli studi strutturali dei canali ionici polimodali, ad esempio il vanilloide potenziale transitorio del ricevitore 1 (TRPV1), hanno fornito ulteriore comprensione della sua attivazione meccanismi1,2,3, 4 , 5. Tuttavia, sono necessari comprendere i loro meccanismi di gating e droga-associazione polimodali informazioni dinamiche su canali ionici incorporati in un ambiente di membrana.
Risonanza paramagnetica elettronica (EPR) e spettroscopie di risonanza (cervi) doppia elettrone-elettrone hanno fornito alcuni dei modelli meccanicistici più definitivi per ioni canali6,7,8,9 , 10 , 11 , 12 , 13. questi approcci sono state principalmente limitati all'esame dei procarioti e dello ione archeal canali che producono una grande quantità di proteine detersivo-purificato quando sovraespresso nei batteri. Con lo sviluppo della produzione di proteine di membrana eucariotiche in insetto e cellule di mammifero per caratterizzazione strutturale e funzionale14,15,16, è ora possibile ottenere biochimici quantità di proteine detersivo-purificato per studi spettroscopici.
I segnali EPR e cervi derivano da un'etichetta di paramagneticspin (SL) (cioè, methanethiosulfonate) legata a un residuo di singolo-cisteina della proteina. Le etichette di spin segnalano tre tipi di informazioni strutturali: movimento, accessibilità e distanze. Queste informazioni consentono di determinare se i residui sono sepolti all'interno della proteina o sono esposti a membrana o ambiente acquoso nella apo e -ligando stati13,17,18,19. Nel contesto di una struttura ad alta risoluzione (quando disponibile), i dati EPR e cervi forniscono un insieme di vincoli per la derivazione di modelli dinamici nel loro ambiente nativo durante il monitoraggio reversibile gating transizione (cioè, chiuso, aperto, sensibilizzato e desensibilizzati). Inoltre, regioni flessibile che potrebbero essere difficile da determinare mediante cristallografia a raggi x o cryo-EM si otteneva utilizzando questi insiemi di dati ambientali per assegnare strutture secondarie così come la posizione all'interno della proteina20. Cryo-EM strutture ottenute in lipidi nanodiscs fornite preziose informazioni circa il gating dello ione canali3,21,22,23,24, 25; Tuttavia, approcci spettroscopici potrebbero fornire informazioni dinamiche da stati conformazionali (ad es., sbalzi termici) che potrebbe essere difficile da determinare utilizzando cryo-EM.
Molte difficoltà devono essere superate per implementare EPR e cervi, compresa la mancanza di funzione della proteina durante la rimozione di tutti i residui di cisteina (particolarmente abbondante nei canali dei mammiferi), proteine di basso rendimento, instabilità proteica durante purificazione e dopo spin labeling e l'aggregazione proteica in detergente o liposomi. Qui, abbiamo progettato protocolli per superare queste barriere critiche e hanno ottenuto informazioni di spettri di cervi ed EPR per un recettore sensoriale dei mammiferi. Lo scopo qui è di descrivere metodologie per l'espressione, purificazione, etichettatura e la ricostituzione di un ratto di cisteina-meno minimo funzionale TRPV1 (eTRPV1) costruire per analisi spettroscopiche. Questa metodologia è adatta per quelle proteine di membrana che mantengono la loro funzione nonostante la rimozione di residui di cisteina o contenenti cisteina che formano legami bisolfurico. Questa raccolta dei protocolli può essere adattata per l'analisi spettroscopica di altri canali ionici dei mammiferi.

<table><tbody><tr><td>QuikChange Kit per mutagenesi sito-diretta Lightning</td><td>Agilent Technologies</td><td>210519-5</td><td></td></tr><tr><td>2-propanolo (isopropanolo)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416</td><td></td></tr><tr><td>Albumina Siero bovino (BSA)</td><td>GoldBio.com</td><td>A-420-10</td><td></td></tr><tr><td>Resina di amilosio</td><td>NEB</td><td>E8021L</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>GoldBio.com</td><td>A-655-25</td><td></td></tr><tr><td>Asolectina da soia</td><td>Sigma</td><td>11145</td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Sistema di espressione del baculovirus</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10359016</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads SM-2 Adsorbenti&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>Pipette in vetro borosilicato (3,5'') (iniezione di ovociti)</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203 G/X</td><td></td></tr><tr><td>Pipette in vetro borosilicato (registrazioni di ovociti)</td><td>Sutter Instrument</td><td>B150-110-10HP</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillina (Disodium)</td><td>GoldBio.com</td><td>C-103-5</td><td></td></tr><tr><td>Reagente cellfectin</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10362-010</td><td></td></tr><tr><td>cellSens</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Fisher Scientific</td><td>C606SK</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi Tipo 1</td><td>Worthington-Biochem</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>Critiseal</td><td>VWR</td><td>18000-299</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosio</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Maltosio Monoidrato</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP684</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside)</td><td>Anatrace</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo ad alto glucosio (Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium)</td><td>Sigma</td><td>D0572&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Colonne di desalinizzazione monouso PD-10</td><td>GE Healthcare</td><td>45-000-148</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>O2783</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>GenCatch Plus Kit mini-preparazione del DNA plasmidico</td><td>Epoch Life Science, Inc</td><td>2160250</td><td></td></tr><tr><td>Kit di pulizia GenCatch PCR</td><td>Epoch Life Science, Inc</td><td>2360050</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina solfato</td><td>Lonza</td><td>17-518Z</td><td></td></tr><tr><td>Capillare in vetro (25 &; l)</td><td>VWR</td><td>53432-761</td><td></td></tr><tr><td>Pallone di vetro 2800 mL</td><td>Pyrex USA</td><td>4423-2XL</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>HEK293S GnTl-ATCC</td><td></td> <td>CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (isopropil-tio-B-galattoside)</td><td></td><td>GoldBio.com I2481C25</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina solfato</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>LB Brodo, Miller</td><td>Fisher bioReagents</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin emisulfato</td><td>GoldBio.com</td><td>L-010-5</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 7H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1344</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher bioReagents</td><td>BP2936</td><td></td></tr><tr><td>MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Methyl Metanotiosolfonato</td><td>Toronto Research Chemicals, Inc</td><td>O873900</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatina A</td><td>GoldBio.com</td><td>P-020-5</td><td></td></tr><tr><td>Acido pluronico F-127 (20%)</td><td>PromoKine&nbsp; &nbsp;</td><td>CA707-59004</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>GoldBio.com</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Capillare sigillato</td><td>VitroCom</td><td>ordine</td><td></td>speciale</tr><tr><td>SF-900 II SFM (terreno cellulare per insetti)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>10902-088</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 Cellule (adattate a SFM)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11496-015</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lipidi polari di soia</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc</td><td>541602C</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25590</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 Increase 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>29091596</td><td></td></tr><tr><td>TCEP HCl</td><td>GoldBio.com</td><td>TCEP1</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina cloridrato</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>Triptone</td><td>Difco</td><td>0123-01</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>GoldBio.com</td><td>X4281C</td><td></td></tr><tr><td>Xenopus ovociti</td><td>Nasco</td><td>LM00935M</td><td></td></tr><tr><td>XL1 - Blue Competent Cells</td><td>Agilent Technologies, Inc</td><td>200249</td><td></td></tr><tr><td>Lievito Estratto</td><td>Difco</td><td>0127-01-7</td><td></td></tr><tr><td>Colonna per cromatografia Econo-Pack</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Gel prefabbricati senza macchie</td><td>Bio-Rad</td><td>17000436</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac1 Vettore di espressione</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10360-014</td><td></td></tr><tr><td>DH10Bac Competent Cells</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>Sigillante per tubi capillari Critiseal</td><td>Leica Microsystems</td><td>02-676-20</td><td></td></tr><tr><td>ABI Modello 3130XL Analizzatori genetici</td><td>Applied Biosystems</td><td>4359571</td><td></td></tr><tr><td>Pipete di trasferimento</td><td>Fishebrand</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr></tbody></table>

purificazione e la ricostituzione di trpv1 per analisi spettroscopiche

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Canali ionici polimodali trasducono stimoli multipli di diversa natura allosterico dei cambiamenti; Queste conformazioni dinamiche sono difficili da determinare e rimangono in gran parte sconosciuti. Con gli avanzamenti recenti nella luce spargimento di singola particella cryo-elettrone microscopia (cryo-EM) le caratteristiche strutturali dei siti di legame dell'agonista e il meccanismo di attivazione dei diversi canali ionici, la scena è pronta per un'approfondita analisi dinamica di loro gating meccanismi di utilizzando approcci spettroscopici. Tecniche spettroscopiche quali risonanza paramagnetica elettronica (EPR) e risonanza doppia elettrone-elettrone (cervi) sono state principalmente limitate allo studio dei canali ionici procariote che può essere purificato in grande quantità. Il requisito per grandi quantità di proteine di membrana funzionale e stabile ha ostacolato lo studio dei canali ionici dei mammiferi utilizzando questi approcci. EPR e cervi offrono molti vantaggi, tra cui la determinazione della struttura e cambiamenti dinamici delle regioni della proteina mobile, anche se a bassa risoluzione, che potrebbe essere difficile da ottenere mediante cristallografia a raggi x o cryo-EM, e monitoraggio gating reversibile transizione (cioè, chiuso, aperto, sensibilizzato e desensibilizzati). Qui, forniamo i protocolli per l'ottenimento di milligrammi di funzionale detergente-solubilizzato transitoria del ricevitore potenziale catione canale sottofamiglia V membro 1 (TRPV1) che possono essere etichettati per spettroscopia EPR e cervi.

Caratterizzazione funzionale del minimo cisteina-meno TRPV1 costruire (eTRPV1) e Single-cisteina mutanti
Il primo passo verso gli studi spettroscopici è ingegnere e caratterizzare costrutti di cisteina-meno proteina (Figura 2A) che sono funzionali e biochimiche quantità di proteine di produrre. eTRPV1 è funzionale come determinato da Ca2 + imaging e TEVC (Figura 2B</stro...

Questo articolo descrive metodi specifici per ottenere biochimico quantità di detersivo-solubilizzato TRPV1 per analisi spettroscopica. I protocolli combinati forniscono strumenti biochimici e biofisici che possono essere adattati per facilitare studi strutturali e funzionali per canali ionici dei mammiferi in un ambiente controllato di membrana.

Purificazione e la ricostituzione di TRPV1 per analisi spettroscopiche

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Qui in laboratorio, pensiamo che l'utilizzo di un approccio spettroscopico possa aiutare a rispondere a domande chiave nella famiglia dei canali ionici del potenziale recettoriale transitorio. Come determinare i cambiamenti informativi dinamici associati all'attivazione polimodale. Il vantaggio principale di questo protocollo è che consente milligrammi di canale ionico rimanente puro e funzionale per la risonanza paramagnetica elettronica e l'epitroscopia a doppia risonanza elettronica elettronica.Questo metodo può fornire informazioni sui cambiamenti conformazionali compatibili con il gating termico e indipendente dalla luce di 3B1. Può essere applicato anche ad altri canali di sgancio, come ad esempio 3B2. Inizia questa procedura con i primer di mutagenesi di progettazione con strumenti online.Preparare la reazione PCR come descritto nel protocollo di testo e centrifugare la miscela. Posizionare le provette nel termociclatore ed eseguire la mutagenesi PCR utilizzando i parametri PCR elencati nel protocollo di testo. Quindi aggiungere due microlitri di enzima DPN1 alla reazione e mescolare.Incubare le reazioni a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, eseguire la trasformazione aggiungendo 75 microlitri di cellule competenti di E.Coli scongelate e 10 microlitri di miscela PCR trattata con DPN1 a una provetta sterile da 14 millilitri pre-raffreddata. Dopo aver mescolato delicatamente, incubare la reazione su ghiaccio per 30 minuti.Mantieni il tubo a 42 gradi Celsius per 45 secondi e poi mettilo immediatamente sul ghiaccio per due minuti. Impiattare la miscela su una piastra di agar LB contenente carbenicillina e incubare per una notte a 37 gradi Celsius. Dopo aver raccolto singole colonie e preparato durante la notte come descritto nel protocollo di testo, centrifugare le colture durante la notte a 8000 volte G per 10 minuti.Quindi, estrarre il DNA seguendo le istruzioni dei mini kit di preparazione disponibili in commercio. Per generare il bacmide ricombinante, trasformare 100 microlitri di cellule competenti DH10bac E.Coli con 7,5 nanogrammi del vettore donatore ricombinante. I vettori contengono il TRPV1 di ratto funzionale minimale privo di cisteina, l'abbreviato eTRPV1 e/o mutanti di cisteina singola.Dopo aver seminato e incubato le cellule come descritto nel protocollo di testo, selezionare colonie bianche di due millimetri di diametro poiché le colonie blu mancano dell'inserto di interesse. Usa uno stereomicroscopio per verificare che le colonie bianche non contengano macchie blu. Raccogliere almeno tre colonie singole e trasferirle in una provetta sterilare da 14 millilitri contenente quattro millilitri di terreno LB integrato.Incubare le cellule per una notte a 37 gradi Celsius a 250 giri/min. Prelevare 1,5 millilitri di colture notturne e isolare il DNA ricombinante di bacmid. Per generare il baculovirus ricombinante, è necessario placcare un milione di cellule SF9 in due millimetri di terreno cellulare di insetto.Lasciare che le celle si attacchino per almeno 45 minuti. Dopo aver lavato una volta con un millilitro di terreno fresco, rimuovere il mezzo di lavaggio e aggiungere la miscela di reagenti per la trasfezione del DNA alle cellule. Incubare le cellule a 27 gradi Celsius per cinque ore senza agitazione.Dopo l'incubazione, rimuovere la miscela di trasfezione e sostituirla con due millilitri di terreno di coltura cellulare contenente lo 0,5% di siero fetale bovino. Quindi, incubare le cellule a 27 gradi Celsius per cinque giorni. Trasferire i terreni di coltura cellulare in una provetta da centrifuga da 15 millilitri.Isolare il primo passaggio del brodo virale ruotando la provetta a 8000 volte G per 15 minuti a 4 gradi Celsius. Trasferire il surnatante in una provetta da centrifuga pulita da 15 millilitri e conservarla immediatamente a quattro gradi Celsius. Della seconda generazione di stock virali, pipettare una coltura in sospensione da 25 millilitri di terreno cellulare di insetto a un milione di cellule SF9 per millilitro contenente il 2% di FBS in un pallone da 125 millilitri.Aggiungere 25 microlitri del virus P1 alla coltura da 25 millilitri. Quindi, incubare la coltura a 27 gradi Celsius per 72 ore. Per raccogliere il ceppo virale P2, trasferire la coltura in una nuova provetta da 50 millilitri e centrifugarla a 8000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius.Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 50 millilitri e conservarlo immediatamente a quattro gradi Celsius. Aggiungere un millilitro di brodo di virus P2 alla coltura da un litro e incubarlo a 27 gradi Celsius per 72 ore. Raccogli la coltura in sospensione di cellule di insetto da un litro centrifugando a 4500 G per 20 minuti a quattro gradi Celsius.Pesare il pellet della cella. Si prevede che sia di circa sei-nove grammi. Risospendere il pellet cellulare in 25 millilitri di tampone ghiacciato A in presenza di inibitori della proteasi.Disaggregare i grumi cellulari per ottenere una sospensione omogenea e ruotare a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Rompere le celle utilizzando un omogeneizzatore manuale o ad alta pressione. Dopo aver rimosso i detriti cellulari mediante centrifugazione a 8000 volte G per 20 minuti a quattro gradi Celsius, raccogliere il surnatante e centrifugare nuovamente a 100, 000 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius.Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e sospendere il pellet di membrana in un volume totale di 20 millilitri di tampone B ghiacciato integrato con inibitori della proteasi. Aliquotare 20 millilitri di sospensione a membrana in provette da 50 millilitri. Per eseguire la purificazione delle proteine aggiungere tre millilitri di DDM per provetta.Ruotare i tubi per due ore a quattro gradi Celsius. Dopo aver centrifugato il campione a 100.000 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius, raccogliere il surnatante e aggiungere un millilitro di resina di amilosio pulita e umida. Ruotare il composto per due ore a quattro gradi Celsius.Quindi caricare la miscela di proteina amilosio nelle colonne di cromatografia a flusso per gravità. Lavare la resina di amilosio legata alle proteine con 10 volte il volume del letto del tampone freddo ghiacciato C, seguita da 10 volumi del letto del tampone freddo ghiacciato D.Elute eTRPV1 proteina con frazioni di 0,5 millilitri fino a cinque millilitri di tampone degassato ghiacciato D integrato con 20 millimolari di maltosio. Eseguire i lavaggi e l'eluizione a quattro gradi Celsius.Utilizzando un'unità di filtro centrifugo cutoff da 100 kilodalton, concentrare le frazioni contenenti eTRPV1 tra due e 2,5 milligrammi per millilitro per l'etichettatura. Successivamente, aggiungere un eccesso molare di dieci volte dell'etichetta di spin MTSSL da una soluzione madre da 100 millimolari in DMSO alla proteina concentrata. Ripeti l'operazione due volte ogni 30 minuti.Mantenere la reazione al buio a temperatura ambiente per un'ora e 30 minuti, seguita da un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius. Quindi, caricare l'etichetta di centrifuga su eTRPV1 su una colonna cromatografica ad esclusione dimensionale bilanciata nel tampone E, controllata da un sistema di cromatografia liquida a proteine veloci. Raccogli le frazioni contenenti il tetramero eTRPV1.Asciugare 10 milligrammi di asolectina utilizzando un evaporatore rotante sotto vuoto per un'ora a 40 gradi Celsius. Per preparare i liposomi di asolectina, aggiungere un millilitro di tampone F e sonicare la miscela per 15 minuti o fino a quando il campione non è omogeneo. Destabilizzare i liposomi aggiungendo DDM a una concentrazione finale di due millimolari e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.Dopo aver regolato la miscela alla concentrazione critica di micel DDM, come dettagliato nel protocollo di testo, raddoppiare il volume della miscela di liposomi proteici con il tampone F.Rimuovere il detergente aggiungendo in sequenza tre aliquote di perle assorbenti di polistirene non polare a intervalli di un'ora con una leggera agitazione a temperatura ambiente. Caricare la miscela su un filtro a colonna per rimuovere le microsfere e trasferire la miscela di proteoliposomi in una provetta per ultracentrifuga. Centrifugare i campioni a 100.000 volte G per un'ora a quattro gradi Celsius.Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 30 microlitri di tampone F, quindi eseguire misurazioni e analisi spettroscopiche. Il primo punto di controllo è l'analisi funzionale di mutanti a singola cisteina prima di intraprendere protocolli di espressione e purificazione. Qui, le cellule hek293 che esprimono TRPV1, eTRPV1 e mutanti wild type sono state analizzate per le risposte evocate dalla capsaicina utilizzando l'imaging del calcio in florescenza.Il secondo punto di controllo è la caratterizzazione biochimica di mutanti a cisteina singola marcati con spin attraverso cromatografia ad esclusione dimensionale prima di procedere con la ricostituzione e l'analisi spettroscopica. Il terzo punto di controllo è la caratterizzazione funzionale di mutanti ricostituiti marcati con spin singolo a cisteina prima di intraprendere l'analisi spettroscopica. Le relazioni di tensione di corrente determinate da due elettrodi di voltage clamp di ovociti di Xenopus micro-iniettati con proteoliposomi contenenti spin marcati con A702C sono stati sfidati con pH5 e bloccati da capsazepina.Infine, è possibile ottenere le mobilità di mutanti eTRPV1 marcati con spin determinate mediante EPR ad onda continua. I primi spettri derivati sono mostrati per mutanti di cisteina marcati con spin in soluzione DDM e ricostituiti in liposomi di asolectina. Anche le distanze e la mobilità dei mutanti eTRPV1 marcati con spin nel detersivo sono state determinate da DEER.Viene mostrata l'eco del cervo e la distribuzione della distanza del mutante E651C marcato con spin. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come esprimere, abbellire e ricostituire un canale ionico di mammifero per l'analisi spettroscopica. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa della mancanza di funzione proteica nella rimozione dei residui di cisteina, della bassa resa proteica e dell'instabilità proteica sia nella purificazione che dopo la marcatura dello spin e dell'aggregazione proteica in detergenti o liposomi.Dopo il suo sviluppo, questi protocolli consentiranno di ottenere cambiamenti di distanza e dinamicità per esplorare modelli meccanicistici per il gating polimodale TRPV1.

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Descriviamo un semplice protocollo per identificare le proteine ​​del cervello che si legano al capolinea pieno C lunghezza di ATP-dipendenti P2X2 recettori. L'estensione e l'applicazione sistematica di questo approccio a tutti i recettori P2X dovrebbe portare ad una migliore comprensione di segnalazione dei recettori P2X.

Proteomica per identificare proteine ​​che interagiscono con P2X2 Ligand-Gated canali di comunicazione

Isotachophoresis (ITP) è una separazione solido elettrocinetico e tecnica preconcentrazione con applicazioni che vanno dal rilevamento della tossina alla preparazione del campione. Esaminiamo i principi fisici di ITP e la metodologia di applicazione di questa tecnica per due applicazioni specifiche esempio: separazione e la rilevazione di piccole molecole e di purificazione degli acidi nucleici da lisato di coltura cellulare.

On-Chip Isotachophoresis per separazione degli ioni e purificazione di acidi nucleici

Thermophoresis microscala (MST) può essere ampiamente usato per la determinazione di affinità di legame senza purificazione della proteina bersaglio da lisati cellulari. Il protocollo prevede sovraespressione della proteina GFP-fusa, lisi cellulare in condizioni non denaturanti, e la rilevazione di segnale MST in presenza di concentrazioni variabili di ligando.

Protein Purification-libera Metodo di Binding Affinity Determinazione Thermophoresis microscala

Per completare i metodi comunemente usati per studiare TRPV4 di, sono descritti due metodi: la sua mechanosensitivity può essere studiato da Ca 2 + luminometria-aequorina in lievito transgenico upon sfida ipo-osmotico. Può pure esaminato TRPV4-RNA oociti di Xenopus iniettati da cellula intera clamp a due elettrodi tensione o Patch Clamp on-cella o modalità asportato.

Lievito luminometrici e Xenopus ovocita elettrofisiologiche Esami del mechanosensitivity molecolare del TRPV4

I passaggi chiave della funzione delle proteine, in particolare i cambiamenti conformazionali della spina dorsale e le reazioni di trasferimento protonico, spesso avvengono su una scala temporale da microsecondi a millisecondi. Questi processi dinamici possono essere studiati mediante spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier a scansione a gradini risolta nel tempo, in particolare per le proteine la cui funzione è attivata dalla luce.

Proton Transfer e conformazione proteica Dynamics in proteine ​​fotosensibili da Time-risolto Step-scan trasformata di Fourier Infrared Spectroscopy

La ricostituzione della proteina transmembrana, KvAP, in giganti vescicole unilamellari (GUVs) è dimostrato per due metodi di disidratazione, reidratazione - electroformation, e gonfiore gel assistita. In entrambi i metodi, piccole vescicole unilamellari contenenti la proteina sono fusi insieme per formare GUVs che possono poi essere studiate mediante microscopia a fluorescenza e patch-clamp elettrofisiologia.

Ricostituzione di una proteina transmembrana, la tensione gated canali ionici, KvAP, in Giant unilamellari vescicole per la microscopia e Patch Clamp Studies

Questo manoscritto descrive come condurre saggi basati su (singola molecola) basati sul trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) per misurare le dinamiche di legame tra il recettore dell'antigene delle cellule T (TCR) e le molecole MHC caricate con peptidi antigenici mentre si verificano all'interno della sinapsi immunologica di una cellula T a contatto con un doppio strato lipidico supportato planare funzionalizzato.

Misurazione TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Utilizzando un microscopio saggio basato FRET-

Studiare canali ionici, attraverso un sistema di espressione eterologhi è diventata una tecnica di base nella ricerca biomedica. In questo manoscritto, presentiamo un metodo efficiente tempo per realizzare canali ionici strettamente controllato eseguendo trasfezione transiente sotto il controllo di un promotore inducibile.

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Espressione e purificazione di TRPC3 la scanalatura del catione del lipido sensibili umani per determinazione strutturale di singola particella cRIO-microscopia elettronica

Sulla base del meccanismo di assemblaggio del complesso proteico INAD, in questo protocollo è stata sviluppata una strategia di purificazione dell'affinità modificata più concorrenza per purificare il canale Endogeno Drosophila TRP.

Purificazione dei canali potenziali del recettore transitorio della drosophila endogena

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Purificazione e la ricostituzione di TRPV1 per analisi spettroscopiche

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