Misura di rigidità dei substrati in morbido Silicone per gli studi di Mechanobiology usando un microscopio a fluorescenza Widefield

Questo metodo può essere utilizzato per classificare i substrati utilizzati per studiare fenomeni chiave in meccanobiologia, migrazione cellulare e prima generazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che richiede l'uso di un microscopio a campo largo, un'apparecchiatura comunemente disponibile in molti laboratori. Questo metodo può essere applicato per misurare il modulo di Young del gel di silicio o poliacrilammide, nonché di qualsiasi materiale elastico lineare isotropo morbido.

Il substrato preparato e caratterizzato con questo metodo può essere utilizzato anche per esperimenti di auto-allungamento con la base in silicone rigido. Per fabbricare il substrato di silicone morbido dopo aver pesato circa 1,75 grammi ciascuno dei componenti A e B dal kit di elastomeri siliconici morbidi, aggiungere la maggior parte della parte pesata del componente A al vassoio di pesata in polistirene del componente B e utilizzare un bastoncino applicatore appropriato per mescolare i due componenti insieme per cinque minuti. Trasferire il composto in una capsula di Petri da 35 millimetri e lasciare che il substrato si distribuisca uniformemente sulla piastra di Petri per alcuni minuti.

Quindi, posizionare la capsula di Petri in una camera a vuoto per 15 minuti per rimuovere eventuali bolle d'aria e preriscaldare una piastra calda. Quando la piastra riscaldante raggiunge i 70 gradi Celsius, posizionare un vetrino sulla piastra riscaldante e posizionare la capsula di Petri sul lato di vetro. Quindi, lasciare indurire il silicone a 70 gradi Celsius per 30 minuti.

Per accoppiare il silicone morbido con le perle fluorescenti, posizionare il silicone polimerizzato in una camera UV profonda, da cinque a dieci centimetri di distanza dalla lampada UV ed esporre il campione alla luce UV profonda per cinque minuti. Durante il trattamento del silicone, sciogliere 19 milligrammi di EDC in 500 microlitri di acqua deionizzata in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. E vorticare il tubo per sciogliere la sostanza chimica.

Successivamente, aggiungere 500 microlitri di acqua deionizzata a 11 milligrammi di sulfo-NHS in un secondo tubo da 1,5 millilitri. E vortice per dissolvere la sostanza chimica. Quindi, combinare le soluzioni EDC e sulfo-NHS in un'unica provetta per microcentrifuga.

Ora, aggiungere alla miscela 30 microlitri di una sospensione appropriata di microsfere modificate con carbossilato coniugato al fluoro-4 e 0,02 milligrammi di collagene 1 per coda di ratto. Dopo un breve vortice, posizionare un pezzo di Parafilm sul coperchio di un secondo coperchio di diametro inferiore e trasferire un millilitro della miscela di collagene 1 di perline EDC-NHS nel Parafilm. Capovolgere la piastra di Petri contenente il silicone morbido sulla miscela, sostenendo la piastra su entrambi i lati con due vetrini, in modo che la superficie morbida del silicone entri in contatto con la soluzione del perline senza toccare direttamente la superficie del coperchio di diametro inferiore sottostante.

Quindi, coprire il campione con un foglio di alluminio per 30 minuti a temperatura ambiente, prima di lavare il silicone due volte, con due millilitri di PBS per lavaggio e lasciare che il silicone indurisca in posizione verticale in due millilitri di PBS fresco a 37 gradi Celsius durante la notte. La mattina dopo, usa una pinzetta appuntita per drappeggiare penetratori a sfera di zirconio da cinque millimetri sul silicone morbido a meno di almeno un millilitro di PBS dai bordi dello strato di silicone e ad almeno cinque diametri di penetratore dalla posizione degli altri penetratori. Quindi, posizionare il piatto di silicio morbido su un tavolino per microscopio ad ampio campo e utilizzare l'obiettivo 10x per ottenere un'immagine di fase di un intero penetratore senza difetti visibili.

Dopo aver salvato l'immagine, selezionare il canale fluorescente appropriato per visualizzare le microsfere fluorescenti. Con il centro del penetratore vicino al bordo destro del fotogramma, diminuisci le coordinate z fino a quando le microsfere fluorescenti sotto il centro del penetratore della sfera non vanno appena fuori fuoco. Quindi, acquisisci uno z-stack con un'immagine per ogni incremento di z di 0,5 micrometri fino a quando le microsfere nello strato superiore del silicone vicino al bordo sinistro del fotogramma di imaging entrano e poi scompaiono dalla messa a fuoco.

Per calcolare la rigidità del silicone, per prima cosa, apri l'immagine della fase del penetratore in ImageJ e fai clic su analizza e imposta scala e controlla l'unità di lunghezza per confermare che la lunghezza è impostata su pixel. Utilizzando lo strumento linea, fare clic e tenere premuto un punto sul bordo del penetratore, spostando il cursore su un punto sul bordo diametralmente opposto, per misurare il diametro del penetratore e annotare la lunghezza in pixel sulla barra di stato della finestra principale di ImageJ prima di rilasciare il cursore. Quindi, apri il menu File e seleziona importa una sequenza di immagini per consentire la selezione di un'immagine nella pila z di immagini di microsfere fluorescenti e fai clic su OK per aprire la pila.

Utilizzando lo strumento linea, disegna una linea su una micro-perlina ben definita in un'immagine e fai clic su Analizza profilo grafico in tempo reale per ottenere l'intensità di scansione della linea aggiornata attraverso la perlina, selezionando diversi fotogrammi. Il fotogramma che dà il valore più alto dell'intensità massima può quindi essere selezionato come fotogramma a fuoco. Le immagini a fluorescenza delle microsfere nella superficie superiore del silicone, scattate in una posizione x-y, posizionano la regione sotto il penetratore all'estrema destra del fotogramma.

La regione all'estrema sinistra del fotogramma viene quindi selezionata come regione lontana dal penetratore. In questo set rappresentativo di scansioni lineari di intensità misurate su una singola microsfera, la messa a fuoco varia con incrementi di z di 0,5 micrometri. Il valore z corrispondente all'immagine a fuoco può quindi essere selezionato oggettivamente in base al valore z corrispondente alla scansione lineare con l'intensità massima più alta.

Qui, il modulo di Young del silicone per vari rapporti di miscelazione dei componenti A:B, è stato ottenuto sulla base del metodo appena dimostrato. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare substrati di silicone morbido, avvolgere le perle fluorescenti su di essi e misurare la rigidità del substrato utilizzando un microscopio fluorescente ad ampio campo.