Un flessibile a basso costo sistema idroponico per valutare le risposte della pianta a piccole molecole in condizioni sterili

Un sistema idroponico in vitro semplice, versatile e a basso costo è stato ottimizzato con successo, consentendo esperimenti su larga scala in condizioni sterili. Questo sistema facilita l'applicazione di sostanze chimiche in soluzione e il loro efficiente assorbimento da parte delle radici per studi molecolari, biochimici e fisiologici. Abbiamo dimostrato che questo sistema era altamente efficiente nell'ottenere piantine omogenee durante lo sviluppo iniziale, oltre a separare radici e germogli utilizzando semi di arabidopsis thaliana.

I seguenti elementi sono necessari per costruire il sistema idroponico e coltivare piante in condizioni sterili e controllate. 7% etanolo, 10% soluzione di candeggina, polisorbato 20, terreno MS comprese le vitamine. MES monoidrato, agar, idrossido di potassio.

Cappa a flusso laminare, piastra riscaldante, camera di crescita. Scatole di plastica monouso, piastre di Petri sterili in vetro, nastro adesivo, puntali per pipette sterili da 200 e 300 microlitri, forbici, pipetta multicanale da 300 microlitri, pipetta da 200 microlitri, lama per bisturi, pinzette e rack per puntali da 200 microlitri. È fondamentale che la punta della pipetta abbia un'area da riempire con il mezzo solido.

Sterilizzare i rack dei puntali per pipette senza coperchio che verranno utilizzati come mini-serbatoi in autoclave a 121 gradi per 20 minuti. Al fine di evitare contaminazioni, tutti i materiali precedentemente menzionati sono stati sterilizzati in autoclave. Quando ciò non è stato possibile, come nel caso delle scatole di plastica usa e getta, i materiali sono stati puliti con etanolo al 7% prima di entrare nella cappa a flusso laminare.

Se il cappuccio lo consente, la luce UV può essere accesa per 10 minuti prima del montaggio del sistema idroponico. Sigillare la superficie superiore del puntale della pipetta con il nastro adesivo. Se possibile, lasciarli sotto la luce UV per 10 minuti.

Quindi, aggiungere 108 microlitri di terreno solido fuso in ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale. Se stai preparando molti serbatoi, usa una piastra riscaldante per evitare che il mezzo MS si solidifichi. Lasciare solidificare completamente il substrato, circa 30 minuti.

Durante il periodo di solidificazione, la luce UV può essere attivata. Riempire completamente la scatola dei puntali con terreno di coltura liquido. Garantisce la stretta compattezza tra fluidi solidi e liquidi.

Rimuovere i nastri adesivi dalla superficie superiore del puntale della pipetta e inserirlo con cura nel rack. Il sistema idroponico è ora pronto per ricevere i semi sterilizzati. La sterilizzazione con candeggina liquida qui descritta è un metodo pratico per sterilizzare i semi.

Per prima cosa, mettere 500 semi di arabidopsis in un microtubo da 1,5 ml. Utilizzare tutte le microprovette necessarie in base al numero di piante necessarie per l'esperimento. Lavare i semi con etanolo al 7% per due minuti agitando.

Rimuovere l'etanolo con cura. Aggiungere un ml di soluzione di candeggina al 10% contenente due microlitri di detergente polisorbato 20. Agitare per cinque minuti.

Rimuovere la soluzione con attenzione. Infine, sciacquare i semi con acqua distillata sterilizzata fino a rimuovere completamente tutti i residui di candeggina, circa cinque volte. Questo protocollo è fattibile per l'arabidopsis, tuttavia questo sistema può essere utilizzato anche per altre specie vegetali.

A tal fine, tale procedura di sterilizzazione dovrebbe essere modificata in base alle esigenze della specie. Dopo la sterilizzazione superficiale, i semi sono stati immersi in acqua distillata sterile e stratificati a quattro gradi al buio per cinque giorni per sincronizzare la germinazione. Tagliare leggermente l'estremità della punta della pipetta da 200 microlitri con l'aiuto di un bisturi sterile.

Pipetettare i semi di arabidopsis nel terreno di coltura solido sulla superficie superiore della punta della pipetta. Fai attenzione che il terreno non si allenti dall'appartamento, altrimenti i semi saranno ombreggiati e le piantine non cresceranno correttamente. Conserva il maggior numero possibile di mini-serbatoi all'interno di una scatola di plastica usa e getta per mantenere un'elevata umidità e l'ambiente privo di microrganismi.

Sigillare la scatola di plastica usa e getta con del nastro adesivo. I sistemi idroponici sono ora pronti per entrare nella camera di crescita. Questo sistema idroponico è stato inizialmente sviluppato per facilitare la somministrazione di sostanze chimiche alle piante, come i composti marcati con isotopi, che in generale sono molto costosi da applicare in esperimenti su larga scala.

Come prova di concetto, abbiamo utilizzato l'inibitore competitivo dell'ATP AZD8055, che ha come bersaglio specifico il sito di legame dell'ATP della proteina chinasi rapamicina bersaglio. La TOR chinasi è un importante regolatore che integra il rilevamento dei nutrienti e la segnalazione energetica per promuovere la proliferazione e la crescita cellulare. Al fine di valutare le risposte primarie dell'inibizione di TOR mediata da AZD, i semi di arabidopsis sono stati coltivati idroponicamente fino allo stadio di sviluppo desiderato sotto un periodo fotografico di 12 ore.

Il terreno fresco contenente due micromolari di AZD o 0,05% di DMSO come controllo è stato sostituito nelle vasche idroponiche alla fine della notte. Le piantine sono state raccolte in diversi momenti dopo il trattamento, separate in radici e germogli congelati in azoto liquido, macinate in una polvere fine e conservate a meno 80 gradi fino al momento dell'uso. Il pattern di fosforilazione della proteina ribosomiale S6 chinasi, RPS6, uno dei ben noti bersagli della via TOR.

L'immunoblotting mostra la quantità di RPS6 totale e fosforilato nelle radici, grafico A, e nei germogli, grafico B. La repressione della fosforilazione in presenza di ADZ855 si è verificata non appena 30 minuti dopo il trattamento farmacologico sia nelle radici che nei germogli, dimostrando che nelle condizioni sperimentali utilizzate, ADZ ha anche dimostrato di essere un potente inibitore di TOR che reprime rapidamente la sua attività chinasica. Le linee di arabidopsi transgenica con ridotta espressione del gene TOR o dei componenti del complesso TOR presentano un chiaro fenotipo di eccesso di amido. L'analisi qualitativa dell'amido utilizzando la soluzione di Lugol rivela il modello previsto di accumulo e degradazione dell'amido durante il ciclo.

Le piantine che non hanno ricevuto l'applicazione dell'MSO o dell'AZD855 non hanno mostrato un maggiore accumulo di amido nelle foglie alla fine della notte, e l'accumulo di amido nelle piante di controllo, l'MSO, era coerente con la letteratura. Inoltre, le piante trattate con AZD presentavano una maggiore quantità di amido residuo alla fine della notte rispetto alle piantine di controllo. Questi risultati indicano l'utilità del sistema idroponico proposto nella coltivazione di piantine che imitano le condizioni fisiologiche.

L'amido si accumula nelle foglie durante il giorno e viene rimobilitato durante la notte per sostenere le attività metaboliche. In condizioni normali, alla fine della notte rimane solo una piccola frazione di amido, tra il 5 e il 10% della quantità totale dopo la fine della giornata. Questi risultati sono testati che il fenotipo degli amidi osservato sotto la repressione di TOR si verifica durante tutto il ciclo.

Le piante coltivate idroponicamente sono state confrontate con piantine che coltivano substrato orticolo in condizioni climatiche molto simili per quanto riguarda il livello di espressione dell'acido abscissico con fattore di legame dell'elemento reattivo, il gene ABF3, mostrato nella figura 5-A. L'espressione di ABF3 è direttamente correlata ai livelli interni di ABA, una classe di ormoni ampiamente nota come marcatore a causa del suo ruolo in molteplici risposte allo stress abiotico. Sebbene le piante coltivate in idroponica abbiano presentato un aumento significativo dell'espressione di ABF3 rispetto alle piante coltivate in terra, i livelli di espressione dell'asparagina sintetasi ASN1 non sono stati influenzati dai trattamenti MSO o AZD mostrati nella figura 5-B.

Tuttavia, l'espressione della trealosio fosfato sintasi cinque, TPS5, aumenta significativamente dopo otto ore di repressione di TOR. ASN1 e TPS5 rispondono rispettivamente a bassi e alti livelli di zucchero, suggerendo che queste piante non sono state sperimentate nello stress genetico. Siamo riusciti ad utilizzare questo sistema per valutare l'applicazione di piccole molecole nelle piante.

In sintesi, questo sistema idroponico possiede molti vantaggi perché è molto veloce e facile da montare, e ha un costo contenuto, in quanto i componenti principali sono economici e possono essere ampiamente riutilizzati. Inoltre, questo sistema è versatile, consentendo lo studio di piantine intatte o distinzioni lungo lo sviluppo delle piante, ed è altamente scalabile, consentendo la coltivazione di un numero enorme di piante in un'area molto piccola.