Name: Una schermata di 2-ibrido del lievito in Batch per confrontare interazioni proteina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Scopri il metodo di screening 2-ibrido del lievito in batch per confrontare profili di interazione proteica multipli. Utilizza il plasmide pTEF-GBD e il deep sequencing per identificare interattomi differenziali rilevanti per processi molecolari e cellulari.

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Ringraziamo il personale all'interno l'Istituto di genetica umana per il sequenziamento e preparazione di biblioteca NGS. Ringraziamo Einat Snir per la sua esperienza nella preparazione di frammenti di libreria genomica per la libreria di plasmide Y2H fatta qui. Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health: R21 NIH EB021870-01A1 e da NSF Research Project Grant: 1517110.

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<li>Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+two-hybrid%2C+a+powerful+tool+for+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).</li>
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<li>Rajagopala, S. V., Hughes, K. T., Uetz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+yeast+two-hybrid+systems+using+the+interactions+of+bacterial+motility+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Benchmarking yeast two-hybrid systems using the interactions of bacterial motility proteins.</a> Proteomics. 9 (23), 5296-5302 (2009).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare

Qui forniamo una guida per come eseguire le analisi di Y2H in batch utilizzando metodi ottimizzati. Ci sono pochi passaggi critici nella procedura per garantire che la popolazione di lievito che sarebbe stato posto sotto selezione è rappresentante della libreria di partenza e che basta con la popolazione di lievito partenza viene utilizzato per subire la selezione per limitare la variabilità . D'importanza, questi benchmark sono relativamente facili da realizzare a fianco di adattare i metodi e i materiali per un dosaggi...

Una comprensione completa dei processi biologici delle cellule si basa sull'individuazione delle reti di interazione della proteina che sono alla base della loro meccanismi molecolari. Un approccio per identificare interazioni della proteina è il dosaggio di lievito 2-ibrido (Y2H), che funziona con l'assemblaggio di un fattore di trascrizione chimerica funzionante una volta due dominii della proteina di interesse associare ad uno altro1. Una tipica schermata di Y2H viene eseguita mediante la creazione di una popolazione di lievito che ospita sia una libreria di plasmidi che codificano le proteine interagenti fuse ad un attivatore trascrizionale (ad es., 'preda' proteina di fusione) e un plasmide dato 'esca' composta la proteina di interesse fusa a un dominio di legame del DNA (per esempio, il dominio legante il DNA di Gal4 che lega la sequenza d'attivazione Gal4-upstream). Uno dei principali vantaggi dell'approccio Y2H è che è relativamente facile e poco costoso per condurre in un tipico laboratorio attrezzato per lavoro biologico molecolare routine2. Tuttavia, quando tradizionalmente eseguita, un utente campioni diverse colonie che sorgono al momento della selezione per una positiva interazione Y2H. Questo limita fortemente il numero di cloni 'preda' libreria che può essere oggetto di indagine. Questo problema è aggravato quando l'abbondanza di una particolare preda interagente è molto alta rispetto alle altre, diminuendo la possibilità di rilevare l'interazione da plasmidi preda abbondanza bassa.
Una soluzione per l'utilizzo del principio di Y2H in una copertura completa del proteoma è l'uso di un approccio di matrice-formattato in cui una matrice contenente noto preda singoli plasmidi possa essere interrogata digitalmente. Tuttavia, tale approccio richiede un'infrastruttura che non è facilmente accessibile e conveniente per diversi ricercatori che sono interessati nella definizione Interactoma di un piccolo numero di proteine o domini3. Inoltre, librerie di prede molto complessa che possono codificare più frammenti di proteine interagenti sarebbero espandere le dimensioni di tali matrici matrice ai formati impraticabile. Un'alternativa consiste nell'eseguire saggi con librerie complesse in lotti e valutare la presenza di cloni interagenti mediante sequenziamento massivo di high throughput parallelo4. Questo può essere applicato per analizzare la presenza di prede plasmidi che sorgono nelle colonie multiple utilizzando un tipico Y2H formattato approccio nel quale lievito cellule alloggiamento un interagenti delle proteine di fusione sono autorizzate a crescere su una piastra5,6. Questa idea generale può essere accentuata per aumentare query di entrambi più esche e prede componenti al stesso tempo7,8.
Ancora, molte indagini richiedono che un più facile ancora più concentrati sforzo sulla proteina a pochi 'esche' e possono beneficiare più di una query esaustiva e semi-quantitativa di una libreria singola preda complessi. Abbiamo sviluppato e convalidato un metodo per eseguire gli studi di interazione della proteina su vasta scala utilizzando un principio di Y2H in batch formato4. Questo utilizza il tasso di espansione di un plasmide particolare preda come un proxy per la forza relativa di Y2H interazione9. Sequenziamento profondo di tutti i plasmidi all'interno di una popolazione sottoposta alla normale crescita o condizioni di crescita selettiva produce una mappa completa dei cloni che producono interazioni Y2H forti e deboli. Il repertorio di interattori possa essere ottenuto e confrontato direttamente attraverso più esca plasmidi. Il flusso di lavoro risultante definito profondo (arricchimento dinamico per la valutazione della proteina reti) quindi utilizzabile per identificare differenziale Interattomi dalle stesse librerie di preda per identificare le proteine, permettendo un confronto tra una proteina contro un altro.
Qui, noi dimostrare profondo e introdurre miglioramenti nei metodi di laboratorio che facilitano l'uso, che sono illustrati nella Figura 1. Miglioramenti significativi includono:
Generazione di popolazioni lievito preda. Uno dei requisiti chiavi di profondo sta generando popolazioni di lievito con i plasmidi di esche diverse che hanno la stessa distribuzione delle librerie preda del plasmide. Popolazioni di equivalente della linea di base della libreria plasmide preda sono essenziali per effettuare confronti accurati tra l'interattomi di diverse esche. Ciò si ottiene quando un plasmide di biblioteca occupa già una popolazione di lievito aploidi e lo spostamento di un plasmide dato esca in quella popolazione è ottenuto dall'accoppiamento per produrre un diploide. Qui, forniamo una guida chiara su come rendere tali popolazioni utilizzando librerie commerciali ospitate in lievito aploide. Anche se abbiamo trovato metodi che generano un elevato numero di diploidi, l'efficienza complessiva degli amori di questi ceppi di lievito commerciale libreria-contenente era basso. Di conseguenza, abbiamo costruito un nuovo ceppo che può ospitare la preda librerie che produce molto più diploidi per reazione di accoppiamento.
Nuovo set di plasmidi di esca. Molti plasmidi corrente che esprimono proteine di fusione 'esca' comprende della proteina di interesse e un dominio di legame al DNA sono basati su 2 µ, permettendo loro di amplificare il loro numero di copia. Questo numero di copia può essere abbastanza variabile nella popolazione e portare alla variabilità della risposta trascrizionale di Y2H. Questo a sua volta potrebbe inclinare la capacità di misurare la forza di un'interazione proteina data sulla base della risposta di crescita delle cellule in selezione. Questo può essere parzialmente indirizzo utilizzando un plasmide copia basso, alcuni dei quali precedentemente sono stati descritti come il pDEST32 commercialmente disponibili10. Abbiamo costruito un nuovo plasmide esca (pTEF-GBD) che produce proteine di fusione di dominio Gal4-DNA-binding all'interno di un plasmide copia basso basato su centromero TRP1 che trasporta il gene di resistenza Kanr che permette anche la clonazione di frammenti di esca sia a Monte e a valle del dominio legante il DNA di Gal4.
Libreria di frammento di nuovo ad alta densità Y2H. Abbiamo costruito un nuovo plasmide per librerie di casa Y2H preda e usato per costruire una libreria di Y2H altamente complessa composta casualmente tranciati frammenti di DNA genomico da Saccharomyces cerevisiae. Analisi di sequenza ha indicato che questa libreria ha avuto oltre 1 milione di elementi diversi, molto più complessi di lievito precedentemente descritti genomica Y2H plasmide biblioteche11. Con questa nuova libreria, siamo stati in grado di dimostrare che il flusso di lavoro profondo è abbastanza robusto per ospitare librerie complesse con molti plasmidi differenti in modo che sia affidabile e riproducibile.

<table><tbody><tr><td>Illumina HiSeq 4000</td> Piattaforma <td>di sequenziamento profondo</td><td>Illumina</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi monoclonali anti-HA</td><td>Biolegend</td><td></td><td>901514 Anticorpo primario per rilevare l'espressione di HA nei costrutti pGal4AD Anticorpi</td></tr><tr><td>policlonali anti-myc</td><td>QED Biosciences Inc</td><td>18826</td><td>Anticorpo primario per rilevare l'espressione di MYC nei costrutti pTEF-GBD NarI</td></tr><tr><td></td><td>New England BioLabs</td><td>R0191S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3236S</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicole 3350, polvere</td><td>J.T. Baker</td><td>U2211-08</td><td></td></tr><tr><td>Salmon Sperm DNA</td><td>Trevigen, Inc venduto da Fisher Scientific</td><td>50-948-286</td><td>DNA trasportatore per la trasformazione del lievito Sezione 3.2.1.</td></tr><tr><td>Kanamicina monosolfato</td><td>Research Products International</td><td>K22000</td><td></td></tr><tr><td>LE Agarose</td><td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td>utilizzato per la produzione di gel di DNA agarosio</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Research Products International</td><td>S23025</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Research Products International</td><td>T60060</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitolo</td><td>Research Products International</td><td>S23080</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di litio diidrato</td><td>MP Biomedicals</td><td>155256</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>ThermoFisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Sale di sodio Prodotti</td><td>di ricerca internazionali</td><td>E57020</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito in polvere</td><td>Prodotti di ricerca internazionali</td><td>Y20020</td><td></td></tr><tr><td>Lievito base di azoto (solfato di ammonio) senza aminoacidi</td><td>International</td><td>Y20040</td><td></td></tr><tr><td>CSM-TRP-LEU+40ADE</td><td>Formedium</td><td>DCS0789</td><td></td></tr><tr><td>CSM-TRP-LEU-HIS+40ADE</td><td>Formedium</td><td>DCS1169</td><td></td></tr><tr><td>CSM-LEU-MET</td><td>Formedium</td><td>DCS0549</td><td></td></tr><tr><td>CSM-TRP-MET</td><td>Bio 101, Inc</td><td>4520-922</td><td></td></tr><tr><td>L-Metionina</td><td>Formedium</td><td>DOC0168</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Research Products International</td><td>A11500</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Research Products International</td><td>G32045</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>utilizzato per la produzione di piastre per terreni nella sezione 1</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Research Products International</td><td>P20240</td><td></td></tr><tr><td>3-ammino-1,2,4 Triazole</td><td>Sigma</td><td>A8056</td><td></td></tr><tr><td>2- Mercaptoehanol (BME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>USBiologico</td><td>Z1004</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio bibasico</td><td>Sigma</td><td>P8281</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo:Cloroformio:IAA</td><td>Ambion</td><td>AM9732</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di ammonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238074</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories, INC</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>RNAsi A</td><td>ThermoFisher</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Research Products International</td><td>U20200</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Research Products International</td><td>L22010</td><td></td></tr><tr><td>glicerolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Gibco</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>blu di bromofenolo</td><td>Amresco</td><td>449</td><td></td></tr><tr><td>Kit di clonazione per l'assemblaggio Gibson</td><td>New England Biolabs</td><td>E5510S</td><td>Metodo di assemblaggio rapido per la clonazione di plasmidi nella sezione 2</td></tr><tr><td>NEBNext 2x PCR Master Mix New</td><td>England Biolabs</td><td>M0541S</td><td>Utilizzato per l'amplificazione di prodotti per l'assemblaggio Gibson nella sezione 2.3 e per la preparazione del campione per il sequenziamento profondo DEEPN nella sezione 6.2.1</td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>Amresco</td><td>0492-5G</td><td></td></tr><tr><td>Kit di purificazione QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Utilizzato per la purificazione dei prodotti pcr nella sezione 6.2.3</td></tr><tr><td>Qiaquick Kit di estrazione del gel di DNA</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Utilizzato per la purificazione del pTEF-GBD digerito nella sezione 2.1</td></tr><tr><td>Kit KAPA Hyper Prep Kit</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK8500</td><td>per il sequenziamento profondo</td></tr><tr><td>http://www.jcat.de</td><td></td><td></td> di<td>ottimizzazione del codone</td></tr><tr><td>Ottimizzazione dei codoni</td><td>https://www.idtdna.com/CodonOpt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gBlocks</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>Frammenti di DNA utilizzati per la clonazione nella Sezione 2.2</td></tr><tr><td>Stringhe</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>Frammenti di DNA utilizzati per la clonazione nella Sezione 2.2</td></tr><tr><td>GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit</td><td>EPOCH Life Sciences</td><td></td><td>Utilizzato per preparare quantità di DNA nella Sezione 2.3</td></tr><tr><td>Covaris E220</td><td>Ultra-suonatore ad alte prestazioni</td><td>Covaris</td><td></td> in sezione 7</tr><tr><td>oligo nucelotide 5'- CGGTCTT CAATTTCTCAAGTTTCAG -3'</td><td>Tecnologie DNA integrate o Thermofisher</td><td></td><td>utilizzate per l'amplificazione e il sequenziamento della pcr 5' inserto pTEF-GBD durante la costruzione del plasmide</td></tr><tr><td>oligo nucelotide 5'-GAGTAACG ACATTCCCAGTTGTTC-3'</td><td>Tecnologie DNA integrate o Thermofisher</td><td></td><td>utilizzato per l'amplificazione e il sequenziamento della pcr 5' inserto pTEF-GBD durante la costruzione del plasmide</td></tr><tr><td>oligo nucelotide 5'-CACCGTAT TTCTGCCACCTCTTCC-3'</td><td>Tecnologie DNA integrate o Thermofisher</td><td></td><td>utilizzate per l'amplificazione e il sequenziamento della pcr Inserto da 3' pTEF-GBD durante la costruzione del plasmide</td></tr><tr><td>oligonucelotide 5'-GCAACCGC ACTATTTGGAGCGCTG-3'</td><td>Integrated DNA Technologies o Thermofisher</td><td></td><td>utilizzati per l'amplificazione e il sequenziamento della pcr 3' insert pTEF-GBD durante la costruzione del plasmide</td></tr><tr><td>oligonucleotide 5'-GTTCCGATG CCTCTGCGAGTG-3'</td><td>Integrated DNA Technologies o Thermofisher</td><td></td><td>5' Pimer utilizzato per l'amplificazione dell'inserto di pGAL4AD</td></tr><tr><td>oligonucelotide 5'-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3'</td><td>Integrated DNA Technologies o Thermofisher</td><td></td><td>3' Pimer utilizzato per l'amplificazione dell'inserto dell'oligonucelotide pGAL4AD</td></tr><tr><td>5'-ACCCAAGCA GTGGTATCAACG-3'</td><td>Integrated DNA Technologies o Thermofisher</td><td></td><td>5' Pimer utilizzato per l'amplificazione dell'inserto di pGADT7</td></tr><tr><td>oligonucelotide 5'- TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3'</td><td>Integrated DNA Technologies o Thermofisher</td><td></td><td>3' Pimer utilizzato per l'amplificazione dell'inserto del ceppo di lievito pGADT7</td></tr><tr><td>PJ69-4A MatA</td><td>http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: librerie genomiche e un ceppo ospite progettato per una selezione altamente efficiente di due ibridi nel lievito. GENETICA 1996 144:1425-1436</td><td></td><td>MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7</td></tr><tr><td>pTEF-GBD</td><td>Dr. Robert Piper Lab</td><td></td><td>Gal4-DNA binding doimain espressione plasmide</td></tr><tr><td>pGal4AD (pPL6343)</td><td>Dr. Robert Piper Lab</td><td></td><td>Gal4-activation domain expression plasmid</td></tr><tr><td>100 mm Petri plates</td><td>Kord-Vallmark venduto da VWR</td><td>2900</td><td></td></tr><tr><td>125 mL pallone di Erlenmeyer</td><td>PYREX Fisher Scientific</td><td>S63270</td><td></td></tr><tr><td>pallone da 250 mL di PYREX Fisher</td><td>Scientific</td><td>S63271</td><td></td></tr><tr><td>1.000 mL di pallone di Erlenmeyer PYREX</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63274</td><td></td></tr><tr><td>pallone di Erlenmeyer da 2.000 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63275</td><td></td></tr><tr><td>provetta di coltura monouso da 20 x 150 mm</td><td>Thermofisher</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>pipetta-aid</td><td>Drummond</td><td>4-000-100</td><td></td></tr> 5 <tr><td>mL Pipetta sierologica</td><td>Denville</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipetta sierologica</td><td>Denville</td><td>P7128</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Pipetta sierologica</td><td>Denville</td><td>P7129</td><td></td></tr><tr><td>1.000 mL PYREX Griffin Beaker</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-540P</td><td></td></tr><tr><td>1.000 mL PYREX Flacone per la conservazione dei terreni riutilizzabile</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-414-1D</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro graduato da 1.000 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-572-6G</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax 190</td><td>Dispositivi</td><td></td> molecolari <td>utilizzati per misurare la densità ottica delle cellule</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific Spettrofotometro</td><td>ND-2000</td><td>utilizzato per quantificare la quantità di DNA</td></tr><tr><td>UV elettronico transilluminatore</td><td>Ultra Lum</td><td>MEB 20</td><td>utilizzato per visualizzare il DNA in un gel di agarosio di bromuro di etidio</td></tr><tr><td>P1000 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td></td></tr><tr><td>P200 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123601G</td><td></td></tr><tr><td>P20 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123600G</td><td></td></tr><tr><td>P10 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F144802G</td><td></td></tr><tr><td>1250 &micro; L Puntali per pipette a bassa ritenzione</td><td>GeneMate</td><td>P-1236-1250</td><td></td></tr><tr><td>200 &; Puntali per pipette di ritenzione LLow</td><td>VWR</td><td>10017-044</td><td></td></tr><tr><td>10 & Puntali per pipette a bassa ritenzione L XL VWR</td><td></td><td>10017-042</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica da 50 mL</td><td>VWR</td><td>490001-627</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica da 15 mL</td><td>Raschietto cellulare VWR</td><td>490001-621</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Denville Scientific</td><td>TC9310</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,5 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fluka Analytical</td><td>318949-1L</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>J.T. Baker</td><td>5674-02</td><td></td></tr><tr><td>Applicatori in legno</td><td>Solon Care</td><td>55900</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga Eppendorf 5424</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-400-005</td><td>microcentrifuga</td></tr><tr><td>Sorvall ST16R</td><td>Thermo Fisher Scientific 75004381</td><td></td><td>centrifuga da banco</td></tr><tr><td>Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked Ab intero (da asino)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-1ML</td><td>Anticorpo secondario</td></tr><tr><td>Amersham ECL IgG di topo, Ab intero legato a HRP (da pecora)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931-1ML</td><td>Anticorpo secondario</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Substrato chemiluminescente</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34080</td><td>Soluzione di rilevamento ECL</td></tr><tr><td>Incubatore Isotemp</td><td>Incubatore Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mutitron 2</td><td>INFORS HT</td><td></td><td>Incubatore a scuotimento</td></tr><tr><td>Isotemp Bagno d'acqua a controllo digitale Modello 205</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Bagno d'acqua</td></tr><tr><td>Libreria di cDNA di topo Y2H in Y187 (tessuto piatto)</td><td>Libreria</td> di cDNA <td>Clontech 630482</td><td>disponibile in commercio Libreria</td></tr><tr><td>di cDNA di topo Y2H in Y187 (cervello di topo)</td><td>Clontech</td><td>630488</td><td>libreria di cDNA disponibile in commercio</td></tr><tr><td>pGADT7 AD Vector</td><td>Clontech</td><td>630442</td><td>vettore AD disponibile in commercio che ospita molte librerie di cDNA</td></tr><tr><td>pGBKT7 DNA-BD Vector Clontech</td><td></td><td>630443</td><td>disponibile in commercio DNA-BD Vector</td></tr><tr><td>Biolase DNA polimerasi</td><td>Bioline</td><td>BIO-21042</td><td>DNA polimerasi utilizzata per la sezione 2.4</td></tr><tr><td>GeneMate GCL-60 Thermal Cycler</td><td>BioExpress</td><td>P-6050-60</td><td>pcr</td></tr><tr><td>TempAssure 0,5 mL provette per PCR</td><td>Stati Uniti Scientifico</td><td>1405-8100</td><td></td></tr></tbody></table>

una schermata di 2-ibrido del lievito in batch per confrontare interazioni proteina

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Lo screening per le interazioni proteina-proteina usando il dosaggio di 2-ibrido del lievito è stato a lungo uno strumento efficace, ma il suo utilizzo in gran parte è stato limitato alla scoperta di interattori di alto-affinità che sono altamente arricchito nella biblioteca di candidati interagenti. In un formato tradizionale, il dosaggio di 2-ibrido del lievito può produrre troppo molte colonie per analizzare quando condotto presso stringenza dove potrebbero essere trovati Interactiani bassa affinità. Inoltre, senza un interrogatorio esaustivo e completo della stessa libreria contro esca diversi plasmidi, un'analisi comparativa non possono essere realizzata. Anche se alcuni di questi problemi possono essere risolto utilizzando librerie allinearono preda, il costo e l'infrastruttura necessaria per far funzionare questi schermi possono essere proibitivi. In alternativa, abbiamo adattato il dosaggio di 2-ibrido del lievito per scoprire contemporaneamente decine di transitori e interazioni proteina statico all'interno di un unico schermo che utilizzano una strategia definita profondo (arricchimento dinamico per la valutazione della proteina reti), che incorpora il sequenziamento del DNA di alto-rendimento e calcolo per seguire l'evoluzione di una popolazione di plasmidi che codificano interattori. Qui, descriviamo su misura reagenti e protocolli che consentono un profondo schermo per essere eseguito facilmente e a costi contenuti.

Il dosaggio di Y2H è stato ampiamente utilizzato per la ricerca di interazioni proteina/proteina e diversi adattamenti e sistemi sono stati sviluppati. Per la maggior parte, le stesse considerazioni che aiutano a garantire il successo con questi approcci precedenti sono importanti per profondo. Sono alcuni dei punti di riferimento importanti: garantire espressione del dominio di legame al DNA proteine di fusione, garantendo un basso fondo di spurie suo + crescita in diploidi contenente l'...

Elaborazione batch delle schermate di lievito 2-ibrido consente di confronto diretto tra i profili di interazione delle proteine multiple esca con un insieme molto complesso di proteine di fusione di preda. Qui, descriviamo raffinati metodi, nuovi reagenti e come implementare il loro utilizzo per tali schermi.

Una schermata di 2-ibrido del lievito in Batch per confrontare interazioni proteina

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Questo metodo utilizza il principio del sistema 2-ibrido di lievito in entrambe le popolazioni per identificare le interazioni proteina-proteina che rispondono a domande chiave su una varietà di processi molecolari e cellulari. Questa tecnica sfrutta il sequenziamento profondo per vedere le interazioni di una proteina rispetto a un'altra. Poiché questo approccio è orientato a fare confronti paralleli, può identificare insiemi di proteine che interagiscono con una proteina rispetto a un'altra o diverse conferme della stessa proteina o durante la tipizzazione di una versione mutante che causa la malattia, per rivelare interattomi differenziali.Per questa procedura è stato costruito un nuovo plasmide esca 2-ibrido di lievito pTEF-GBD come descritto nel protocollo di testo. Questo plasmide produce proteine di fusione del dominio di legame del DNA Gal4 all'interno di un plasmide a bassa copia basato sul centromero TRP1 che trasporta il gene di resistenza alla kanamicina che consente anche il clonaggio di frammenti di esca sia a monte che a valle del dominio di legame del DNA Gal4. Questo plasmide esca è stato utilizzato per trasformare il lievito MATa e l'espressione delle proteine di f

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MITO permette di rilevare sensibile delle interazioni transienti e stabili tra proteine ​​che sono espresse nel modello organismo Saccharomyces cerevisiae. E 'stato applicato con successo allo studio esogeni e lievito proteine ​​integrali di membrana allo scopo di individuare i propri partner che interagiscono in modo elevato throughput.

Split-Ubiquitina membrana a base di lievito Due-Hybrid (MITO) Sistema: un potente strumento per identificare interazioni proteina-proteina

Abbiamo sviluppato completa, imparziale genoma schermate per capire gene-farmaco e interazioni gene-ambiente. Metodi per lo screening queste collezioni mutanti sono presentati.

Schermi competitivo genomica delle Biblioteche di lievito con codice a barre

Questo video mostra il saggio a due ibridi di lievito per rilevare specifiche auto-interazioni proteiche. In questo saggio, la proteina di interesse è marcata in due domini di un fattore di trascrizione che codifica per l'enzima β-galattosidasi. Quando le due proteine interagiscono, ciò provoca la trascrizione e la traduzione per formare l'enzima, che viene poi rilevato utilizzando un saggio biochimico.

Saggio a due ibridi di lievito per determinare l'autoassociazione proteica nelle cellule di lievito

In questo video, dimostriamo il test del lievito modificato one-hybrid, che rileva più proteine che interagiscono con il DNA bersaglio. Le cellule di lievito trasformate contengono la sequenza di DNA bersaglio a monte del gene reporter. Inoltre, esprimono proteine del fattore di trascrizione. Quando le proteine formano complessi e si legano al DNA bersaglio, il gene reporter viene espresso e può essere rilevato enzimaticamente.

Saggio ibrido lievito-uno modificato per rilevare le interazioni eteromeriche tra complesso proteico e DNA

Questo articolo si concentra sulla identificazione di alta fiducioso set di dati di interazione tra ospite e patogeno proteine ​​usando una combinazione dei due metodi ortogonali: lievito di doppio ibrido seguita da un saggio di interazione high-throughput in cellule di mammifero chiamato HT-GPCA.

Un approccio comparato alla caratterizzano il paesaggio di ospite-patogeno interazioni proteina-proteina

Utilizzando microarray proteici contenenti quasi tutta la S. cerevisiae proteoma è sondato per un rapido interrogatori imparziale di migliaia di interazioni proteina-proteina in parallelo. Questo metodo può essere utilizzato per la proteina-piccola molecola, modificazione post-traslazionale, e altri saggi in high-throughput.

Probing ad alta densità di microarrays della proteina funzionali per rilevare le interazioni proteina-proteina

Le proteine interagiscono tra loro e queste interazioni determinano in gran parte le loro funzioni. I partner di interazione proteica possono essere identificati ad alto rendimento in vivo utilizzando un saggio di fitness del lievito basato sul saggio di complementazione del frammento proteico diidrofolato reduttasi (DHFR-PCA).

Genome-wide proteina-proteina interazione Screening per Protein-frammento Complementation Assay (PCA) in cellule viventi

proteine ​​effettrici batteriche sono importanti per stabilire le infezioni di successo. Questo protocollo descrive l'identificazione sperimentale di partner di legame proteici di una proteina batterica effettrici nel suo ospite vegetali naturali. Identificare queste interazioni effettrici via lievito schermi doppio ibrido è diventato uno strumento importante per svelare le strategie di patogenicità molecolari.

Svelare la funzione di un batterica Effector da un non-coltivabili fitopatogeni Utilizzando un lievito schermo doppio ibrido

Il saggio di un ibrido di lievito modificato qui descritto è un'estensione del saggio classico del lievito un ibrido (Y1H) per studiare e convalidare l'interazione heteromera della proteina-complesso del DNA in un sistema eterologo per qualsiasi studio genomico funzionale.

Un lievito modificato - un sistema ibrido per studi di interazione tra DNA e proteine ​​eteromeriche

Sequenziamento profondo delle popolazioni di lieviti selezionati per le interazioni di lievito positivo 2-ibrido potenzialmente produce una ricchezza di informazioni su proteine partner interagenti. Qui, descriviamo il funzionamento di strumenti bioinformatici specifico e personalizzato aggiornato il software per analizzare i dati di sequenza da questi schermi.

Informatica analisi dei dati di sequenza da Batch lievito ibrido 2 schermi

Le interazioni delle biomolecole, come le interazioni proteina-proteina, sono la base molecolare delle funzioni biologiche. Se i mutanti con interazione nulla/alterata che mancano specificamente dell'interazione rilevante possono essere isolati, saranno di grande aiuto per comprendere le funzioni di questa interazione. Questo articolo presenta un modo efficiente per isolare i mutanti con interazione, null/impromesse.

Isolamento di mutanti nulli/alterati di interazione utilizzando il saggio a due ibridi di lievito

Scopri il metodo di screening 2-ibrido del lievito in batch per confrontare profili di interazione proteica multipli. Utilizza il plasmide pTEF-GBD e il deep sequencing per identificare interattomi differenziali rilevanti per processi molecolari e cellulari.

Una schermata di 2-ibrido del lievito in Batch per confrontare interazioni proteina

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