Informatica analisi dei dati di sequenza da Batch lievito ibrido 2 schermi

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla natura degli interattomi proteici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che tutta l'elaborazione bioinformatica è gestita da un'interfaccia facile da usare. Questo software utilizza un'interfaccia utente grafica di facile utilizzo che i biologi molecolari, i biologi cellulari e i biochimici che non hanno molta esperienza in bioinformatica possono utilizzare per completare facilmente le loro analisi.

In generale, le persone che non conoscono l'elaborazione dei dati di sequenza hanno difficoltà perché i programmi per computer sono confusi e ingombranti. Pensavamo che rendere l'informatica facile avrebbe reso l'intera tecnica molto più accessibile e utile. Il primo passo di questa procedura consiste nel scaricare e installare il programma software MAPster come descritto nel protocollo di testo.

Quindi, inserisci i file e i parametri richiesti tramite la scheda Principale. Seleziona il pulsante Pairwise appropriato per inserire i file per l'analisi DEEPN. Impostare l'opzione Pairwise su Off per eseguire in formato a lettura singola.

Carica i file in MAPster trascinandoli nella finestra appropriata. Dai genomi indicizzati elencati nella casella Genoma, selezionare una fonte del genoma del DNA di riferimento che corrisponda alla fonte degli inserti della libreria delle prede Y2H. Poiché HISAT2 supporta il multi-threading, nella casella Threads, indicare il numero di processi informatici da dedicare al programma di mappatura.

Specificare un nome per il file di output, si consiglia un nome breve ma descrittivo senza spazi o caratteri speciali poiché questo nome file verrà utilizzato durante tutto il processo DEEPN. Utilizzando il pulsante Apri directory di output, specificare una cartella per l'output dei file mappati. Una volta selezionati i file e i parametri appropriati, utilizzare il pulsante Aggiungi alla coda per aggiungere il processo di mappatura alla coda dei lavori.

Una volta inseriti tutti i lavori nella coda dei lavori, fare clic sul pulsante Esegui coda. Inizia questa analisi aprendo il software DEEPN. Dalla finestra principale, selezionare le informazioni sulla libreria delle prede corrispondenti dalla casella di selezione in alto.

Seleziona una cartella in cui i file elaborati possono essere inseriti facendo clic sul pulsante Cartella di lavoro e navigando nella directory delle cartelle. Una volta selezionata una cartella di lavoro, DEEPN creerà tre sottocartelle con i nomi indicati. Per un'analisi corretta, assicurarsi di inserire i file SAM corretti nelle cartelle corrette e di sapere quali file hanno letture mappate e non mappate.

Se si utilizzano file sam contenenti letture mappate e non mappate, come quelli prodotti con le impostazioni predefinite del programma MAPster, inserirli nella cartella sam_files. Avviare l'elaborazione facendo clic sul pulsante Conteggio geni più Junction Make. Il tempo di elaborazione dipende dalle dimensioni e dal numero di file di dati di sequenza e dalla velocità di elaborazione del computer utilizzato.

Una volta che DEEPN ha elaborato i dati, verrà creato un set completo di cartelle. Il passaggio successivo consiste nell'eseguire l'analisi in Stat Maker. Apri Stat_Maker e fai clic sul pulsante Verifica installazione.

Se viene eseguito per la prima volta, Stat_Maker installerà automaticamente R, JAGS e Bioconductor estraendo queste risorse da Internet. Una volta rilevati R, JAGS e Bioconductor, Stat_Maker diventerà attivo e consentirà ulteriori input da parte dell'utente. Fare clic sul pulsante Scegli cartella per accedere alla cartella di lavoro elaborata da DEEPN.

Stat_Maker troverà ed elencherà automaticamente i file per l'analisi statistica nella finestra. Trascina e rilascia i file appropriati dalla finestra dell'elenco dei file in alto nelle finestre dei file sottostanti per ogni set di dati di vettori ed esche e per ogni condizione di crescita, non selezionata e selezionata. È importante sottolineare che Stat_Maker richiede set di dati duplicati solo per il vettore vuoto, due campioni di popolazioni non selezionate e due campioni di selezionati.

Questo fornisce una stima della variabilità all'interno dell'esperimento. Fare clic sul pulsante Esegui. A seconda della velocità del computer, il calcolo richiederà dai cinque ai 15 minuti.

I risultati dell'output Stat_Maker vengono inseriti in una nuova sottocartella all'interno della cartella di lavoro principale denominata Stat_Maker Risultati. Esamina i risultati. Per esaminare i dati su ciascun potenziale candidato, aprire il software DEEPN, selezionare le informazioni sulla libreria delle prede corrispondenti, quindi selezionare la cartella di lavoro corretta utilizzando la cartella di lavoro.

Fare clic sul pulsante Blast Query per caricare una nuova finestra. Nella casella di testo in alto, digita il nome del gene o il numero GenBank NM per selezionare il gene candidato di interesse. Il nome del gene corrisponde al nome elencato nel file di output di Stat Maker.

Digitare Invio o Invio, che avvia il recupero del gene di interesse. Selezionare i set di dati che verranno utilizzati per l'analisi utilizzando i menu Seleziona set di dati. Tipicamente, questi includono solo il vettore e i campioni di esca cresciuti in condizioni non selettive e il campione di esca coltivato in condizioni di selezione.

Inizialmente, il caricamento dei dati e del nome del gene può richiedere un po' di tempo con il programma Blast Query, ma una volta caricato il set di dati, andrà molto più veloce. Blast_Query visualizzerà i punti di fusione lungo la sequenza di interesse e l'abbondanza di ciascun punto di fusione. Questo può essere visualizzato sia in formato tabella utilizzando la scheda Risultati che in formato grafico utilizzando la scheda Grafico.

Per esportare questi risultati in un file csv, fai clic sul pulsante Salva csv in alto a destra. Dalla finestra DEEPN, fare clic sul pulsante Profondità di lettura in Analizza dati. Una volta aperta la finestra Profondità di lettura, digitare il numero NM nella casella di testo superiore.

Utilizzare il menu a discesa per selezionare il set di dati pertinente che contiene il gene arricchito di interesse. Utilizzare la tabella a sinistra e la visualizzazione grafica a destra per determinare quante letture sono state trovate nei dati che corrispondono al gene di interesse. Il programma Stat Maker produce un file visualizzabile in Excel che riassume le informazioni pertinenti necessarie per identificare le proteine interagenti candidate.

Viene anche mostrata l'analisi corrispondente per verificare se i plasmidi corrispondenti alla preda candidate contengono il corretto frame di lettura aperto. La Blast Query valuta ogni gene e ordina le diverse posizioni in base alla loro abbondanza nel set di dati quantificato dal ppm del numero totale di giunzioni trovate all'interno del database. In questo esempio, la posizione più abbondante che è In ORF e In Frame è la posizione 867, indicando che il nucleotide 867 della sequenza di riferimento GenBank NCBI NM_019648 è l'inizio del frammento di preda.

Questo grafico mostra una sequenza ipotetica e come progettare l'oligo a cinque numeri primi per catturare il corretto frame e il punto di fusione tra il dominio di attivazione Gal4 e la sequenza di prede di interesse. Questa finestra Profondità di lettura mostra quante sequenze sono state trovate nei dati che corrispondono alle posizioni nucleotidiche della sequenza di interesse. Una volta padroneggiati, l'elaborazione dei dati può essere eseguita in 10-20 ore, il più delle volte senza supervisione.

Gli schermi DEEPN e la corrispondente analisi informatica apriranno la strada ai ricercatori in un'ampia gamma di campi per esplorare le reti di interazione con la loro proteina di interesse. Il programma MAPster è progettato per facilitare la mappatura dei file di sequenza dagli esperimenti DEEPN. Fornisce inoltre un metodo di facile utilizzo per mappare i file di sequenza per fare riferimento al DNA per una varietà di applicazioni, come RNA-Seq o ChIP-Seq.

Sebbene il software DEEPN sia costruito specificamente per elaborare dati di lievito batch a due ibridi, può essere utilizzato anche per elaborare dati RNA-Seq. Il programma Stat Maker non solo prevede quali geni danno un'autentica interazione tra due ibridi di lievito, ma raccoglie anche una serie di altri parametri, come la lettura delle informazioni sul frame, consentendo agli investigatori di filtrare rapidamente i risultati dei candidati. Una volta identificate le proteine interagenti candidate, è importante convalidare le interazioni utilizzando saggi standard su lievito a due ibridi, saggi biochimici pull-down o metodi correlati.