Name: Isolamento, espansione e adipogenico induzione di CD34 + CD31 + cellule endoteliali dal tessuto adiposo umano omentale e sottocutaneo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Scopri l'isolamento e l'espansione di cellule endoteliali CD34+CD31+ dal tessuto adiposo umano omentale e sottocutaneo. Questo metodo consente la differenziazione in adipociti bianchi e beige per studiare l'obesità.

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Gli autori desiderano riconoscere Becky Marquez, il coordinatore clinico presso il centro di Sentara bariatrica, per la sua assistenza con il processo del paziente di screening e consenzienti. Questa ricerca è stata sostenuta da R15HL114062 a Dobrian D. Anca.

Comitato di Consiglio di revisione istituzionale presso la Eastern Virginia Medical School ha approvato la ricerca e la raccolta di campioni di tessuto adiposo umano utilizzato nello studio. Consenso informato scritto è stato raccolto dai pazienti.
1. preparazione del buffer, i Media e gli strumenti
<ol><li>Preparare una soluzione di Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered (KRBBS): 135 mM di cloruro di sodio, 5 mM di cloruro di potassio, solfato di magnesio di 1 mM, 0.4 mM potassio fosfato bibasico, 5,5 millimetri di glucosio, adenosina di 1 mM, 0,01% antibiotico/antimicotico mix (50 µ g/mL di penicillina, 50 µ g/mL di streptomicina, 30 µ g/mL di gentamicina, 15 ng/mL di amfotericina) e 10 mM HEPES (pH = 7.4). Questa soluzione viene preparata fresco ogni volta per la raccolta di tessuto e la digestione.</li>
	<li>Preparare una soluzione di collagenasi fresche: 1 mg/mL di collagenasi, tipo 1, in KRBSS; fare 3 mL/g di grasso. Pre-riscaldare la soluzione della collagenosi a 37 ° C in un bagno di acqua prima della digestione del tessuto.</li>
	<li>Preparare un Buffer di isolamento delle cellule CD34: 2% siero bovino fetale (FBS) e 1 mM EDTA in soluzione fisiologica sterile di tampone fosfato (PBS).</li>
	<li>Preparare il supporto di Adipogenesis: DMEM/F12, 5% FBS, 50 µ g/mL di penicillina/streptomicina, 1.25 µ l/mL di insulina umana (5 µ g/mL o 144 mU/mL) e 0,36 µ l/mL di 2,8 mM rosiglitazone (1 µM).</li>
	<li>Preparare una soluzione stock di olio rosso O (ORO) 0,3% (peso/volume) da sciogliere 0,3 g di ORO in 100 mL di isopropanolo.</li>
</ol>2. adiposo frazione vascolare Stromal isolamento
Nota: Lo studio ha incluso un gruppo trasversale dei diabetici obesi tipo 2 (T2D) e oggetti non-diabetico, età compresa tra 18-65 anni, sottoposti a chirurgia bariatrica presso il Sentara metabolica e il centro di chirurgia di perdita di peso (Sentara Medical Group, Norfolk, VA). Criteri di esclusione comprendevano una malattia autoimmune, tra cui il diabete mellito di tipo 1, condizioni che richiedono la terapia immunosopressiva cronica, farmaci anti-infiammatori, thiazolinendiones, l'uso attivo del tabacco, infezioni croniche o acute o una storia di malignità trattati negli ultimi 12 mesi. T2D è stata definita come un glucosio plasmatico a digiuno di 126 mg/dL o maggiore, una glicemia di 200 mg/dL o maggiore dopo una tolleranza al glucosio di 2 h di prova o l'uso dei farmaci antidiabetici.
<ol><li>Raccogliere umano omentale (OM) e sottocutanea (SC) del tessuto adiposo (AT) da soggetti umani sottoposti a chirurgia bariatrica.</li>
	<li>Tenere l'OM e SC AT separate fiale contenente soluzione salina tamponata di Hank con 50 µ g/mL di penicillina/streptomicina a temperatura ambiente subito dopo l'estrazione del tessuto.</li>
	<li>Pulire accuratamente e rimuovere sezioni di tessuto fibrotici e cauterizzati utilizzando pinzette e forbici monitorate di etanolo 70% quando il campione arriva al laboratorio dopo l'estrazione del tessuto.</li>
	<li>Pesare il tessuto adiposo e aliquote di it in 5 g (o meno) per la digestione della collagenosi di partizione.</li>
	<li>Tritare finemente 5 g di AT in 5 mL di soluzione in un flaconcino di scintillazione a temperatura ambiente, collagenosi utilizzando due paia di forbici.</li>
	<li>Aggiungere un ulteriore 10 mL di soluzione della collagenosi al tessuto macinato per 15 mL totale.</li>
	<li>Digerire i campioni per 1h a 37 ° C, in un bagnomaria con agitazione continua.</li>
	<li>Tagliare la punta fuori una siringa da 20 mL per rendere una punta smussata.</li>
	<li>Ritagliare un quadrato di 9 x 9 cm da una maglia di 250 µm e spingerlo a metà in una provetta conica 50 mL utilizzando la siringa di estremità smussata.</li>
	<li>Versare i campioni nella siringa da 20 mL estremità smussata e filtro attraverso la rete di nylon 250 µm nella provetta conica 50 mL per separare adipociti e cellule vascolari stromale dal tessuto non digerito. Nota: Non utilizzare più di 5g di AT per provetta conica da 50 mL, come la mesh verrà intasarsi a causa di materiale non digerito fibrotico in eccesso.</li>
	<li>Lavare il flaconcino di scintillazione con 10 mL di KRBBS e versarlo attraverso il filtro per raccogliere le cellule residue.</li>
	<li>Incubare i campioni filtrati per 5 min a temperatura ambiente. Nota: Questo passaggio è importante per consentire gli adipociti a galleggiare nella parte superiore del tubo e alcune delle cellule vascolari stromal di depositarsi sul fondo del tubo.</li>
	<li>Utilizzare una siringa da 20 mL e un 20 x 6 nell'ago di pipettaggio per rimuovere lo strato stromal frazione vascolare e trasferirlo in una provetta conica da mL 50 pulito.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di KRBBS e consentire ai campioni di sedersi sulla panchina per 5 minuti, a temperatura ambiente.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 2.12 – 2,14 due volte. Nota: Questa procedura garantisce che non esiste nessuna contaminazione delle cellule vascolari stromal con gli adipociti galleggiante.</li>
	<li>Mantenere le frazioni vascolare stromale da entrambi i depositi sul ghiaccio per un'ulteriore elaborazione, come descritto nella procedura seguente. Nota: Non lasciare le cellule sul ghiaccio per più di 1 h, come questo può avere un impatto sull'attuabilità delle cellule. Gli adipociti possono essere flash-congelati in azoto liquido per la conservazione a lungo termine o utilizzate freschi per gli esperimenti.</li>
</ol>3. isolamento di cellule endoteliali del tessuto adiposo
<ol><li>Girare le frazioni vascolare stromale (SVF) a 500 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Rimuovere i campioni dalla centrifuga e versare con cautela il sovranatante; tenere il pellet contenente le celle di SVF.</li>
	<li>Delicatamente e risospendere il pellet cellulare in 5 mL di PBS. Nota: Se più di 5 g di un deposito di AT è stato elaborato in aliquote multiple (Vedi punto 2.4), riunire il pellet cellulare.</li>
	<li>Girare i campioni a 500 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere le cellule in 1 mL di PBS contare le celle. Nota: Qui, un contatore di cellule automatica è stato usato per il conteggio delle cellule. La vitalità cellulare è stata ottenuta mescolando 12 µ l di sospensione cellulare con 12 µ l di una soluzione di acridina arancio/propidio ioduro (AO/PI) (Vedi Tabella materiali). Il numero medio di cellule per grammo di AT per ogni deposito è: (a) OM Depot: 1.69 x 105 ± 4,51 x 104; (b) SC Depot: 1,24 x 105 ± 6,45 x 104. L'attuabilità delle cellule da entrambi i depositi era > 90%.</li>
	<li>Pellet i campioni a 500 x g per 5 min a 4 ° C. Nota: Un protocollo di selezione immunomagnetica CD34 (Vedi Tabella materiali) è stato adattato per la procedura 3,7 – 3,15.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 100 µ l di tampone di isolamento di CD34. Nota: La conta totale delle cellule richiede i seguenti volumi di risospensione: (a) < 2 x 107 cellule: risospendere il pellet in 100 µ l; (b) 2 x 108– 5 x 108 celle: risospendere il pellet in 1 mL. Nei passaggi 3.9 – 3,16, i volumi dei reagenti utilizzati sono stati ridimensionati per < 2 x 107 cellule.</li>
	<li>Aggiungere 10 µ l di CD34 cocktail e incubare il campione per 15 minuti, a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere 5 µ l di biglie magnetiche e incubare il campione per 10 min, a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere 2,5 mL di tampone di CD34 isolamento per ogni campione e inserire i campioni nel magnete, per 5 minuti, a temperatura ambiente.</li>
	<li>Invertire il magnete per 5 s per versare il tampone di isolamento.</li>
	<li>Rimuovere i campioni dal magnete e ripetere i passaggi 4 x 3.10 e 3.11.</li>
	<li>Rimuovere il tubo dal magnete e aggiungere 2 mL di buffer di isolamento di CD34.</li>
	<li>Agglomerare le cellule a 500 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Risospendere il pellet di cellule in 1 mL di buffer di isolamento CD34 e contare le celle. Nota: Qui, il numero medio di cellule per grammo di AT è: (a) OM Depot: 4,75 x 104 ± 3,36 x 104; (b) SC Depot: 1,06 x 104 ± 9,53 x 103. Un protocollo di plastica immunobead CD31 è stato adattato per la procedura 3.16 – 3,34 (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>A pellet di cellule a 500 x g per 5 min e risospendere il pellet in 250 µ l di tampone B e 250 µ l di tampone di lavaggio.</li>
	<li>Risospendere accuratamente le perline CD31 nel Vortex il tubo.</li>
	<li>Aggiungere 20 µ l di CD31 perline. Nota: A causa della totale delle cellule conta > 1 x 106, il volume è stato ridimensionato secondo ingresso del produttore.</li>
	<li>Incubare il campione con dondolo per 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Collegare una gabbietta in una provetta conica sterile 50 mL. Nota: L'apertura più grande del filtro deve essere sulla parte superiore.</li>
	<li>Prima la separazione delle cellule, aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio per equilibrare il colino. Applicare la miscela generata sotto passo 3.16 al filtro.</li>
	<li>Lavare il filtro con 5 mL di tampone di lavaggio in un movimento circolare per un volume totale di 20 mL. Collegare il connettore a una provetta conica sterile 50ml e chiudere luer-lock.</li>
	<li>Collegare la gabbietta al connettore. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio lungo la parete del filtro. Aggiungere 1 mL di tampone attivato D lungo la parete del filtro. Agitare delicatamente il campione e incubare per 10 minuti, a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio. Separare le cellule dalle perle pipettando su e giù per 10 volte. Nota: Evitare di generare bolle d'aria.</li>
	<li>Aprire luer-lock e permettono alle cellule indipendente di fluire la provetta conica da 50 mL. Lavare il filtro 10 x con 1 mL di tampone di lavaggio ogni volta.</li>
	<li>Eliminare il connettore e il colino e centrifugare i campioni a 300 x g per 10 min a 4 ° C. Risospendere il pellet cellulare in 2 mL di completa EGM-2 Media per la cultura. Nota: Il numero medio di cellule per grammo di AT a questo punto è: (a) OM Depot: 5.92 x 103 ± 4,27 x 103; (b) SC Depot: 4,12 x 103 ± 2.1 x 103. La vitalità delle cellule da entrambi i depositi era oltre il 90%.</li>
</ol>4. induzione di Adipogenesis in cellule endoteliali isolate
<ol><li>Crescere le cellule in piastre di coltura del tessuto-trattati 6-pozzetti con completa EGM-2 media in un 37 ° C, 5% CO2 incubator. Sostituire i media ogni 3 – 4 giorni fino a quando le cellule raggiungono la confluenza di 80 – 90%. Nota: Il raddoppio della popolazione è tra 2 – 3 giorni.</li>
	<li>Espandere le cellule da loro placcatura su piastre Petri da 100 mm e dividere le celle 1:3 una volta. In questa fase, le cellule sono il passaggio 2.</li>
	<li>Conta le celle utilizzando una cella automatica del contatore (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Celle di seme circa 100 – 200.000 in piastre da 6 pozzetti garantendo pozzetti duplicati per ogni deposito e cultura li in completo EGM-2 supporti per 2 giorni.</li>
	<li>Aspirate fuori qualsiasi media di crescita e sostituirlo con 2 mL di DMEM/F12 con 5% FBS e cellule di 50 µ g/mL di penicillina/streptomicina per il controllo e sostituirlo con 2 mL di Adipogenesis media (Vedi punto 1.4) per le cellule di trattamento.</li>
	<li>Incubare le cellule a 37 ° C in un umidificata 5% CO2 incubatore per 13 giorni, sostituendo i rispettivi media ogni 3-4 giorni. Nota: Cellule iniziano ad accumulare lipidi dopo 4 giorni di trattamento.</li>
	<li>Condotta di ORO e Nilo rosso colorazione secondo metodi pubblicati15–17.</li>
	<li>Per isolare le cellule per un'estrazione di RNA, rimuovere il supporto dalle piastre induzione 6 pozzetti e lavare con 1 mL di PBS sterile.</li>
	<li>Aggiungere 350 µ l di una soluzione di tiocianato-fenolo-cloroformio guanidium (Vedi Tabella materiali) di ogni bene e incubare a temperatura ambiente per 5 – 10 min.</li>
	<li>Raschiare le cellule fuori la piastra con un raschietto in cella e trasferire le cellule in una microcentrifuga da 1,5 mL. Nota: I campioni possono essere conservati nel congelatore-80 ° C per l'estrazione di RNA e ulteriore elaborazione in una data successiva.</li>
	<li>Estrarre il mRNA dai campioni utilizzando un'estrazione di RNA adattata protocollo (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Eseguire una reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR) per valutare l'espressione genica utilizzando le seguenti sonde: adiponectina, UCP-1 e CIDEA (Vedi Tabella materiali). Nota: Qui, RT-PCR procedure sono state effettuate utilizzando il protocollo standard seguente: denaturazione (95 ° C; 15 s), ricottura ed estensione (60 ° C; 1 min) per 40 cicli. Gli esempi di geni con CT valori espressi > 35 sono stati considerati non rilevabile.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il focus di questo lavoro è quello di fornire una metodologia per l'isolamento, espansione e adipogenico induzione di CD34 + CD31 + cellule endoteliali da depositi di viscerale e sottocutanei del tessuto adiposo umano.
Metodologie sono state segnalate per l'isolamento di cellule endoteliali da vari posti letto vascolare di roditori o di esseri umani che coinvolgono principalmente le tecniche utilizzando anticorpi CD31 fluorescente etichettati o accoppiato a biglie magnetiche1...

Dati recenti indicano che sia nei topi e nell'uomo, un sottoinsieme delle cellule che risiedono nel sistema vascolare del tessuto adiposo può essere differenziato nei adipocytes bianco o beige/marrone1,2,3. Il fenotipo di tali cellule è un argomento di polemica, con prove a sostegno di cellule endoteliali, muscolo liscio/pericyte o uno spettro di fenotipi intermedi4,5,6,7. L'ambito di sviluppo di questa metodologia è stato testare il potenziale adipogenico di CD34 + CD31 + cellule endoteliali isolate da diversi depositi di grasso da esseri umani obesi. Altri studi in letteratura si stanno concentrando sull'adipogenico potenziale della frazione vascolare stromal totale o del adipocyte noti progenitori2,8,9. Poiché le tecnologie attualmente esistenti possono indirizzare specificamente le cellule endoteliali del tessuto adiposo per droga consegna10, comprendere le potenzialità di tali cellule per subire adipogenico induzione verso adipocytes bianco o beige è importante per futuro di terapie mirate.
Diversi gruppi hanno riferito la combinazione di marcatori CD31 e CD34 come surrogati per isolare le cellule endoteliali dal tessuto adiposo umano11,12,13. In genere, l'isolamento viene eseguita utilizzando due punti sequenziali e una selezione positiva utilizzando biglie magnetiche. In questo rapporto, è stato utilizzato immunoseparation utilizzando CD34 + biglie magnetiche combinati con perline in plastica CD31. Abbiamo trovato questa tecnica superiore alla immunoseparation magnetica sequenziale per quanto riguarda la conservazione della morfologia endoteliale tipico acciottolato. Inoltre, siamo stati in grado di generare abbastanza cellule necessarie per l'induzione di espansione e adipogenico a partire da un minimo di 1 – 2 g di grassi. Una biopsia di piccolo campione di grasso sottocutaneo è sufficiente per produrre la quantità necessaria di cellule per applicazioni a valle. Questo aspetto è potenzialmente importante, soprattutto se questo metodo sarà utilizzato per lo screening per una reattività ad induzione adipogenico nei soggetti umani.
A differenza di altri sistemi segnalati nella letteratura, questo metodo utilizza solo due ingredienti per l'induzione di adipogenico del CD34 + CD31 + cellule: un agonista PPARγ — rosiglitazone — e l'insulina umana. D'importanza, la quantità di insulina usata cade all'interno della gamma normale/alto di fare circolare l'insulina in esseri umani14. Il grado di reattività all'insulina del cellule in vitro, misurata dalla fosforilazione di Akt, non correla con la loro capacità di rispondere all'induzione cocktail. È interessante notare che, utilizzando questa condizioni di cocktail e sperimentale di induzione, un mix di bianche e beige/marrone cellule sono stati ottenuti come determinato dalle dimensioni e numeri di goccioline del lipido intracellulare e l'espressione di marcatori molecolari. Questo protocollo di induzione semplice e conveniente con la valutazione quantitativa del fenotipo delle cellule del radar-risponditore (bianco vs beige) permette uno screening degli agenti che potenzialmente possono alterare l'equilibrio del beige differenziato : bianco adipocytes.
Questo metodo fornisce anche un approccio traslazionale per comprendere i meccanismi di fondo del adipogenesis di progenitori endoteliali vascolari nel tessuto adiposo umano. Utilizzando questa tecnica di isolamento/differenziazione specifica, gli investigatori possono interrogare varie vie responsabili adipogenesis in un sottoinsieme delle cellule endoteliali vascolari da vari depositi di grasso in esseri umani magri ed obesi.

<table><tbody><tr><td> Grandi apparecchiature </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Armadio di biosicurezza </td><td> Nuaire </td><td> nu-425-400 </td><td></td></tr><tr><td> Incubatore per colture cellulari </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 800 DH </td><td></td></tr><tr><td> Bagno d'acqua </td><td> Forma Scientific </td><td> 2568 </td><td> Agitatore reciproco </td></tr><tr><td> RT-PCR Machine </td><td> BIO-RAD </td><td> CFX96-C1000 </td><td></td></tr><tr><td> Scatola per elettroforesi </td><td> BIO-RAD </td><td> Mini PROTEAN 3 celle </td><td></td></tr><tr><td> Transblot Box </td><td> BIO-RAD </td><td> Mini Trans-Blot Cell </td><td></td></tr><tr><td> Alimentatore per elettroforesi </td><td> BIO-RAD </td><td> PowerPac Basic </td><td></td></tr><tr><td> ELISA Reader </td><td> Molecular Devices </td><td> SpectraMax M5 </td><td></td></tr><tr><td> Blot Reader </td><td> LI-COR </td><td> Odyssey </td><td> Near Infrared </td></tr><tr><td> Centrifuga refrigerata </td><td> Eppendorf </td><td> 5810 R </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuga da tavolo </td><td> Eppendorf </td><td> MiniSpin Plus </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio a fluorescenza </td><td> Olympus </td><td> BX50 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio invertito </td><td> Nikon </td><td> TMS </td><td></td></tr><tr><td> KRBSS Buffer </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Research Products International </td><td> H75030 </td><td></td></tr><tr><td> Bicarbonato di sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 792519 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di calcio diidrato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7902 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato di potassio monobasico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5655 </td><td></td></tr><tr><td> Solfato di magnesio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2643 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 746398 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio fosfato monobasico monoidrato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9638 </td><td></td></tr><tr><td> Potassio cloruro </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> Acros Organics </td><td> 410950010 </td><td></td></tr><tr><td> Adenosina </td><td> Acros Organics </td><td> 164040250 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina sierica bovina </td><td> GE Bioscienze sanitarie </td><td> SH30574.02 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina/Streptomicina </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 15070063 </td><td></td></tr><tr><td> Digestione tissutale </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 20 mL Siringa </td><td> Global Medical </td><td> 67-2020 </td><td></td></tr><tr><td> Rete di nylon, 250 &; m </td><td> Sefar </td><td> 03-250/50 </td><td></td></tr><tr><td> Aghi per pipettaggio </td><td> Popper </td><td> 7934 </td><td></td></tr><tr><td> Forbici fini </td><td> Strumenti per le scienze fini </td><td> 14058-11 </td><td></td></tr><tr><td> Pinze per tessuti </td><td> George Tiemann & Co </td><td> 160-20 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase, Tipo I </td><td> Worthington Biochemical </td><td> LS004196 </td><td></td></tr><tr><td> Petri Dish, 100 mm </td><td> USA Scientific </td><td> 5666-4160 </td><td> TC Treatated </td></tr><tr><td> Eppendorf Tubes, 1,5 mL </td><td> USA Scientific </td><td> 1615-5500 </td><td></td></tr><tr><td> Provette coniche, 15 mL </td><td> Nest Scientific </td><td> 601052 </td><td></td></tr><tr><td> Tubi conici, 50 mL </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td><td></td></tr><tr><td> Fiale a scintillazione </td><td> Kimble </td><td> 74505-20 </td><td> Tissue Dicing </td></tr><tr><td> Cell Isolation </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cellometer </td><td> Nexcelom </td><td> Auto 2000 </td><td></td></tr><tr><td> Cellometer Slides </td><td> Nexcelom </td><td> CHT4-SD100-002 </td><td></td></tr><tr><td> Cellometer Viability Stain </td><td> Nexcelom </td><td> CS2-0106-5mL </td><td> Acridine Orange/Propid iodio </td></tr><tr><td> Perle magnetiche anti-CD34 </td><td> StemCell Technologies </td><td> 18056 </td><td> Kit </td></tr><tr><td> EasySep Magnete </td><td> StemCell Technologies </td><td> 18000 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD31 Plastic Beads </td><td> pluriSelect USA </td><td> 19-03100-10 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect 10x Wash Buffer </td><td> pluriSelect USA </td><td> 60-00080-10 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect Anello connettore </td><td> pluriSelect USA </td><td> 41-50000-03 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect Tampone di distacco </td><td> pluriSelect USA </td><td> 60-00046-12 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect Tampone di incubazione </td><td> pluriSelect USA </td><td> 60-00060-12 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect S Cell Strainer </td><td> pluriSelect USA </td><td> 43-50030-03 </td><td></td></tr><tr><td> Cell Culture </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6-pozzetti Plates </td><td> USA Scientific </td><td> CC7682-7506 </td><td> TC Treatated </td></tr><tr><td> 4- vetrini ben camerati </td><td> Corning Life Sciences </td><td> 354559 </td><td> vetrini rivestiti con fibronectina </td></tr><tr><td> 4 pozzetti </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 154526PK </td><td> Vetro non rivestito </td></tr><tr><td> Cellule endoteliali microvascolari adipose umane (HAMVEC) </td><td> Sciencell Research Laboratories </td><td> 7200 </td><td> Linea cellulare primaria </td></tr><tr><td> Terreni cellulari endoteliali (ECM) </td><td> ScienCell Research Laboratories </td><td> 1001 </td><td> Kit completo </td></tr><tr><td> DMEM/F12 Terreni basali </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 11320082 </td><td></td></tr><tr><td> Siero fetale bovino (FBS) </td><td> Rocky Mountain Biologicals </td><td> FBS-BBT </td><td></td></tr><tr><td> Insulina </td><td> Lilly </td><td> U-100 </td><td> Humalog </td></tr><tr><td> Rosiglitazone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R2408 </td><td></td></tr><tr><td> Cell Analysis </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Oil Red O Dye </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O0625 </td><td> Preparato in isopropanolo </td></tr><tr><td> 96 piastre pozzetti </td><td> USA Scientific </td><td> 1837-9600 </td><td></td></tr><tr><td> 96 piastre PCR pozzetto </td><td> Genesee Scientific </td><td> 24-300 </td><td></td></tr><tr><td> Estrazione dell'RNA </td><td> Zymo Research </td><td> R2072 </td><td> Kit </td></tr><tr><td> cDNA Synthesis </td><td> BIO-RAD </td><td> 1708841 </td><td> Supermix </td></tr><tr><td> JumpStart PCR polimerasi </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9307-250UN </td><td> Hot start, con tampone PCR N </td></tr><tr><td> Soluzione di cloruro di magnesio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M8787-5ML </td><td> 3 mM finali in reazione PCR </td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> Promega </td><td> U1515 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan AdipoQ </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> Hs00605917_m1 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan CIDEA </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> Hs00154455_m1 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan RPL27 </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> Hs03044961_g1 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan UCP1 </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> Hs00222453_m1 </td><td></td></tr><tr><td> BCA Assay </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> QPBCA-1KT </td><td> Kit </td></tr><tr><td> Bis-acrilammide </td><td> BIO-RAD </td><td> 1610146 </td><td> 40% soluzione madre </td></tr><tr><td> Persolfato di ammonio </td><td> BIO-RAD </td><td> 1610700 </td><td></td></tr><tr><td> TEMED </td><td> BIO-RAD </td><td> 1610800 </td><td></td></tr><tr><td> Tris </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td> Glicina </td><td> BIO-RAD </td><td> 1610718 </td><td></td></tr><tr><td> Sodium Dodecal Sulfate </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L3771 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Fisher Scientific </td><td> S311-100 </td><td></td></tr><tr><td> Blu di bromofenolo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B8026 </td><td></td></tr><tr><td> Blot Membrane </td><td> EMD Millipore </td><td> IPFL00010 </td><td></td></tr><tr><td> Metanolo </td><td> Fisher Scientific </td><td> A452-SK4 </td><td></td></tr><tr><td> Odyssey Blocking Buffer, Tris </td><td> LI-COR </td><td> 927-50000 </td><td></td></tr> <td> p>Anticorpo anti-AKT </td><td> Tecnologia di segnalazione cellulare </td><td> 2920S </td><td> Monoclonale di topo </td></tr><tr><td> Anticorpo anti-pAKT </td><td> Tecnologia di segnalazione cellulare </td><td> 9271S </td><td> Coniglio policlonale </td></tr><tr><td> Anticorpo anti-UCP1 </td><td> Abcam </td><td> ab10983 </td><td> Policlonale di coniglio </td></tr><tr><td> Anticorpo IgG anti-topo </td><td> LI-COR </td><td> 926-68070 </td><td> Goat Polyclonal, IRDye 680RD </td></tr><tr><td> Anti-Rabbit IgG antibody </td><td> LI-COR </td><td> 926-32211 </td><td> 7Policlonale di capra, IRDye 800CW </td></tr><tr><td> Anticorpo IgG anti-coniglio </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 111-025-003 </td><td> Policlonale di capra, TRITC </td></tr><tr><td> Soluzione salina tampone fosfato <p<>> </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 10010049 </td><td></td></tr><tr><td> Soluzione di formaldeide al 37% </td><td> Microscopia elettronica Sciences </td><td> 15686 </td><td> 4% soluzione per fissazione cellulare </td></tr><tr><td> Siero normale di capra </td><td> Vector Laboratories </td><td> S-1000 </td><td> 10% soluzione bloccante </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X-100 </td><td> 0,1% soluzione di permeabilizzazione </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> D1306 </td><td></td></tr><tr><td> Calcein AM </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 65-0853-39 </td><td> Visualizzazione fluorescente cellulare </td></tr><tr><td> Matrigel Basement Membrane Matrix </td><td> Corning Life Sciences </td><td> 356231 < </td><td> p>Fattore di crescita ridotto </td></tr><tr><td> DiI marcato Acetilato LDL </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> L3484 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento, espansione e adipogenico induzione di cd34 + cd31 + cellule endoteliali dal tessuto adiposo umano omentale e sottocutaneo

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

L'obesità è accompagnata da un vasto rimodellamento del tessuto adiposo soprattutto via l'ipertrofia degli adipociti. Estremi del adipocyte crescita determina una scarsa risposta all'insulina, ipossia locale e l'infiammazione. Stimolando la differenziazione degli adipociti bianchi funzionale da progenitori, ipertrofia radicale della popolazione degli adipociti può essere prevenuta e, di conseguenza, la salute metabolica del tessuto adiposo può essere migliorata con una riduzione di infiammazione. Inoltre, stimolando una differenziazione degli adipociti beige/marrone, il dispendio energetico totale del corpo può essere aumentato, con conseguente perdita di peso. Questo approccio potrebbe prevenire lo sviluppo di comorbilità dell'obesità come diabete di tipo 2 e malattie cardiovascolari.
Questo articolo descrive l'isolamento, espansione e la differenziazione degli adipociti bianchi e beige da un sottoinsieme delle cellule endoteliali di tessuto adiposo umano che co-esprimono i marcatori CD31 e CD34. Il metodo è relativamente economico e non è alta intensità di lavoro. Richiede l'accesso al tessuto adiposo umano e il deposito sottocutaneo è adatto per il prelievo. Per questo protocollo, campioni di tessuto adiposo fresco da oggetti morboso obesi [indice di massa corporea (BMI) > 35] vengono raccolti durante le procedure di chirurgia bariatrica. Utilizzando un immunoseparation sequenziale dalla frazione vascolare stromal, abbastanza cellule sono prodotte da un minimo di 2 – 3 g di grassi. Queste cellule possono essere espanse in coltura oltre 10 – 14 giorni, possono essere crioconservate e mantengono le proprietà adipogenico con passaggio fino a passaggio 5 – 6. Le cellule sono trattate per 14 giorni con un adipogenico cocktail utilizzando una combinazione di insulina umana e l'agonista PPARγ-rosiglitazone.
Questa metodologia può essere utilizzata per l'ottenimento della prova degli esperimenti di concetto sui meccanismi molecolari che guidano le risposte adipogenico in cellule endoteliali adipose, o per lo screening di nuovi farmaci che possono migliorare l'adipogenico risposta diretta sia verso il bianco o differenziazione del adipocyte beige/marrone. Utilizzando piccole biopsie sottocutanee, questa metodologia utilizzabile per identificare i soggetti non responsivi per studi clinici voluti a stimolare adipociti bianchi e beige/marrone per il trattamento dell'obesità e co-morbidità.

Il nostro protocollo mira a fornire un approccio in vitro per determinare il potenziale adipogenico di CD34 + CD31 + cellule vascolari da diversi depositi del tessuto adiposo umano. Un diagramma semplificato è mostrato in Figura 1A. Il primo passaggio utilizzando una selezione positiva di CD34 in cellule che esprimono risultati in &gt; 95% cellule CD34 + nella popolazione delle cellule appena isolate (Figura 1A). D'impor...

La differenziazione degli adipociti bianchi e beige da progenitori vascolari del tessuto adiposo porta il potenziale di miglioramento metabolico nell'obesità. Descriviamo i protocolli per CD34 + CD31 + isolamento di cellule endoteliali da grasso umano e per una successiva in vitro espansione e differenziazione in adipociti bianchi e beige. Diverse applicazioni a valle sono discussi.

Isolamento, espansione e adipogenico induzione di CD34 + CD31 + cellule endoteliali dal tessuto adiposo umano omentale e sottocutaneo

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'obesità, come l'identificazione dei fattori e dei meccanismi chiave che impediscono una robusta risposta adipogenica durante il rimodellamento del tessuto adiposo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'isolamento di cellule endoteliali CD34+CD31+ dal tessuto adiposo umano a partire da piccole quantità di tessuto. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando volevamo identificare le cellule nel sistema vascolare adiposo umano che rispondono alla stimolazione adipogenica.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le fasi di isolamento cellulare sono difficili da praticare a causa dell'accesso spesso limitato al tessuto adiposo umano fresco. Raccogliere tessuto adiposo umano omentale e sottocutaneo da soggetti umani sottoposti a chirurgia bariatrica. Immediatamente dopo l'estrazione del tessuto, conservare il tessuto adiposo umano omentale e sottocutaneo in fiale separate contenenti la soluzione salina tamponata di Hank con 50 microgrammi per millilitro di penicillina streptomicina a temperatura ambiente.Una volta che il campione arriva in laboratorio dop

isolation-expansion-adipogenic-induction-cd34-cd31-endothelial-cells

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo video mostra una tecnica per isolare e coltivare cellule staminali derivate dalla cresta neurale (ADSC) derivate da creste neurali marcate in modo fluorescente da tessuto adiposo dell'arco periaortico murino. Dopo l'isolamento, le NCADSC vengono rilevate, selezionate utilizzando la smistamento cellulare attivata dalla fluorescenza e successivamente coltivate su una piastra, promuovendo la proliferazione cellulare.

Isolamento di cellule staminali di derivazione adiposa da tessuto adiposo periaortico murino

L'eterogeneità trascrizionale all'interno delle cellule stromali umane di derivazione adiposa può essere definita a livello di singola cellula utilizzando marcatori di superficie cellulare e geni osteogenici.  Descriviamo un protocollo che utilizza la citometria a flusso per l'isolamento di sottopopolazioni cellulari con aumentato potenziale osteogenico, che può essere utilizzato per migliorare la ricostruzione scheletrica craniofacciale.

Isolamento e arricchimento di Human derivate da tessuto adiposo cellule stromali di Osteogenesi avanzata

Qui riportiamo un metodo per l'isolamento delle popolazioni di cellule progenitrici di Adipocyte (APC) da tessuto adiposo perivascolare (PVAT) utilizzando la selezione delle cellule magnetiche (MCS). Questo metodo consente un aumento dell'isolamento di APC per grammo di tessuto adiposo se confrontato con la selezione delle cellule attivate con fluorescenza (FACS).

L&#39;espansione e l&#39;adipogenesi dell&#39;induzione di progenitori adipociti da tessuto adiposo perivascolare isolati da cellule magnetiche attivate

Questo protocollo descrive l'approccio tecnico per isolare sottopopolazioni di cellule stromali adipogeniche e fibro-infiammatorie da depositi di tessuto adiposo bianco (WAT) murino intra-addominale mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza o separazione di microsfere immunomagnetiche.

Isolamento di sottopopolazioni di cellule stromali adipogeniche e fibro-infiammatorie da depositi adiposi intra-addominali murini

Presentiamo un metodo semplice per isolare le cellule progenitrici adipose altamente vitali dalle pastiglie di grasso epididimale del topo utilizzando lo smistamento delle cellule attivato a fluorescenza.

Preparazione di cellule progenitrici adipose dai tessuti adiposi epididimali del topo

Questo protocollo fornisce un metodo efficiente di digestione della collagenasi per l'isolamento di adipociti vitali e cellule di frazione vascolare stromale-SVF dal grasso viscerale umano in un unico processo, compresa la metodologia per ottenere RNA di alta qualità dagli adipociti e la fenotipizzazione dei macrofagi SVF attraverso la colorazione di più marcatori legati alla membrana per l'analisi mediante citometria a flusso.

Isolamento di adipociti vitali e frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo viscerale umano adatto per l'analisi dell'RNA e la fenotipizzazione dei macrofagi

Questo protocollo descrive un metodo per la dissezione dei depositi adiposi di topo e l'isolamento e la digestione delle rispettive arterie per liberare e quindi identificare la popolazione di cellule endoteliali. Le cellule appena isolate utilizzate nelle applicazioni a valle faranno progredire la comprensione della biologia delle cellule vascolari e dei meccanismi della disfunzione vascolare.

Isolamento e identificazione di cellule endoteliali vascolari da depositi adiposi distinti per applicazioni a valle

Questo protocollo descrive una metodologia per isolare e identificare le cellule staminali mesenchimali (MSC) derivate dal tessuto adiposo da ratti Sprague Dawley.

Isolamento e identificazione di cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo di ratti Sprague Dawley

Qui, descriviamo l'isolamento, la coltura e l'induzione adipogenica di preadipociti derivati dalla frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo periaortico di topo, consentendo lo studio della funzione del tessuto adiposo perivascolare e della sua relazione con le cellule vascolari.

Isolamento, coltura e induzione adipogenica di preadipociti derivati dalla frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo periaortico di topo

Il tessuto adiposo è un'ottima fonte di cellule staminali mesenchimali. Qui, portiamo l'estrazione, la coltivazione e la caratterizzazione passo dopo passo di cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ADSC) da topi svizzeri tessuto adiposo epididimale.

Isolamento, espansione in vitro e caratterizzazione di cellule staminali mesenchimali da tessuto adiposo epididimo di topo

Le dimensioni e la fragilità degli adipociti maturi hanno limitato le tecniche e gli strumenti disponibili per il loro studio e isolamento. Qui viene descritto un protocollo per l'isolamento di adipociti murini maturi, che può essere facilmente adattato a diversi depositi adiposi e diete di topi.

Isolamento e coltura di adipociti murini primari da topi magri e obesi

Scopri l'isolamento e l'espansione di cellule endoteliali CD34+CD31+ dal tessuto adiposo umano omentale e sottocutaneo. Questo metodo consente la differenziazione in adipociti bianchi e beige per studiare l'obesità.

Isolamento, espansione e adipogenico induzione di CD34 + CD31 + cellule endoteliali dal tessuto adiposo umano omentale e sottocutaneo (Video) | JoVE Journal

Isolamento, espansione e adipogenico induzione di CD34 + CD31 + cellule endoteliali dal tessuto adiposo umano omentale e sottocutaneo

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