Isolamento, espansione e adipogenico induzione di CD34 + CD31 + cellule endoteliali dal tessuto adiposo umano omentale e sottocutaneo

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'obesità, come l'identificazione dei fattori e dei meccanismi chiave che impediscono una robusta risposta adipogenica durante il rimodellamento del tessuto adiposo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'isolamento di cellule endoteliali CD34+CD31+ dal tessuto adiposo umano a partire da piccole quantità di tessuto. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando volevamo identificare le cellule nel sistema vascolare adiposo umano che rispondono alla stimolazione adipogenica.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le fasi di isolamento cellulare sono difficili da praticare a causa dell'accesso spesso limitato al tessuto adiposo umano fresco. Raccogliere tessuto adiposo umano omentale e sottocutaneo da soggetti umani sottoposti a chirurgia bariatrica. Immediatamente dopo l'estrazione del tessuto, conservare il tessuto adiposo umano omentale e sottocutaneo in fiale separate contenenti la soluzione salina tamponata di Hank con 50 microgrammi per millilitro di penicillina streptomicina a temperatura ambiente.

Una volta che il campione arriva in laboratorio dopo l'estrazione del tessuto, pulire e rimuovere accuratamente le sezioni fibrotiche e cauterizzate del tessuto utilizzando forbici e pinzette tamponate con etanolo al 70%. Pesare il tessuto adiposo e suddividerlo in aliquote da cinque grammi per la digestione della collagenasi. Usa due paia di forbici per tritare finemente cinque grammi di tessuto adiposo in cinque millilitri di una soluzione di collagenasi in una fiala di scintillazione a temperatura ambiente.

Aggiungere altri 10 millilitri di soluzione di collagenasi al tessuto tritato per un totale di 15 millilitri. Digerire i campioni per un'ora a 37 gradi Celsius in un bagno d'acqua con agitazione continua. Dopo la digestione, versare i campioni nella siringa da 20 millilitri con estremità smussata.

Filtrare il campione attraverso una rete di nylon da 250 micron nel tubo conico da 50 millilitri per separare gli adipociti e le cellule vascolari stromali dal tessuto non digerito. Lavare la fiala di scintillazione con 10 millilitri di KRBBS e versare il lavaggio attraverso il filtro per raccogliere le cellule residue prima di incubare i campioni filtrati per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, utilizzare una siringa da 20 millilitri e un ago di pipettaggio da 20 gauge per sei pollici per rimuovere lo strato di frazione vascolare stromale e trasferirlo in una provetta conica pulita da 50 millilitri.

Aggiungere 10 millilitri di KRBBS e lasciare riposare i campioni sul banco per cinque minuti a temperatura ambiente. Conservare le frazioni vascolari stromali di entrambi i depositi su ghiaccio per un'ulteriore lavorazione. Centrifugare le frazioni vascolari stromali a 500 volte G per cinque minuti a 4 gradi Celsius.

Rimuovere i campioni dalla centrifuga e versare con cura il surnatante, mantenendo il pellet contenente le cellule della frazione vascolare stromale. Risospendere delicatamente i pellet cellulari in cinque millilitri di PBS. Dopo aver centrifugato nuovamente i campioni, rimuovere il surnatante, risospendere le cellule in un millilitro di PBS e contare le cellule.

Pellettare i campioni per la terza volta e risospendere il pellet in 100 microlitri di tampone di isolamento CD34. Aggiungere 10 microlitri di cocktail CD34 e incubare il campione per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi aggiungere cinque microlitri di microsfere magnetiche e incubare il campione per 10 minuti a temperatura ambiente.

Quindi, aggiungere 2,5 millilitri di tampone di isolamento CD34 a ciascun campione e posizionare i campioni nel magnete per cinque minuti a temperatura ambiente. Capovolgere il magnete per cinque secondi per versare il tampone di isolamento. Dopo aver ripetuto questo processo quattro volte, rimuovere la provetta dal magnete e aggiungere due millilitri di tampone di isolamento CD34.

Dopo un'altra centrifugazione, sospendere nuovamente i pellet di cellule CD34+ in un millilitro di tampone di isolamento CD34 e contare le cellule. Pellettare nuovamente le celle e risospendere il pellet in 250 microlitri di tampone B e 250 microlitri di tampone di lavaggio. Quindi, risospendere accuratamente le perle CD31 facendo vorticare la provetta, quindi aggiungere 20 microlitri di perle CD31 al pellet di cella ri-sospeso e incubare il campione a dondolo per 30 minuti a temperatura ambiente.

Prima della separazione cellulare, aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio per equilabare il colino. Quindi, applicare la miscela preparata di cellule risospese in perle CD31 sul colino. Lavare il colino con cinque millilitri di tampone di lavaggio con un movimento circolare per un volume totale di 20 millilitri.

Collegare il connettore a un tubo conico sterile da 50 millilitri e chiudere il leur lock. Dopo aver collegato il filtro al connettore, aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio lungo la parete del filtro, quindi aggiungere un millilitro di tampone D attivato lungo la parete del filtro. Agitare delicatamente il campione e incubarlo per 10 minuti a temperatura ambiente.

Quindi, aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio e separare le cellule dalle perle pipettando su e giù 10 volte. Aprire il leur lock e lasciare che le cellule staccate fluiscano nel tubo conico da 50 millilitri. Lavare il colino 10 volte con un millilitro di tampone di lavaggio ogni volta.

Eliminare il connettore e il filtro e centrifugare i campioni a 300 volte G per 10 minuti a 4 gradi Celsius. Infine, risospendere il pellet cellulare in due millilitri di terreno EGM2 completo per la coltura. Coltivate le cellule in piastre trattate con coltura tissutale a sei pozzetti con terreni EGM2 completi in un incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.

Sostituire il terreno ogni tre o quattro giorni fino a quando le celle raggiungono l'80-90% di confluenza. Quindi, seminare circa 100-200 mila cellule in piastre a sei pozzetti, garantendo pozzetti duplicati per ogni deposito, e coltivarle in terreno EGM2 completo per due giorni. Dopo due giorni, aspirare tutti i terreni di coltura.

Sostituire il terreno con due millilitri di terreno DMEM/F-12 con il 5% di FBS e 50 microgrammi per millilitro di penicillina streptomicina per le cellule di controllo. Per le cellule di trattamento, sostituire il terreno con due millilitri di terreno adipogenetico. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica per 13 giorni, sostituendo i rispettivi terreni ogni tre o quattro giorni.

Sono stati mostrati risultati rappresentativi che mostrano la tipica morfologia endoteliale a ciottoli delle cellule CD34+CD31+ dopo due passaggi in coltura. È stata anche dimostrata la capacità delle cellule di formare tubuli quando vengono coltivate in Matrigel come previsto. L'assorbimento uniforme di LDL acetilato marcato con fluorescenza mostra la presenza di una popolazione cellulare omogenea con identità endoteliale.

Qui è mostrata la colorazione Oil Red O di goccioline lipidiche neutre in cellule CD34+CD31+ dopo 13 giorni di induzione adipogenica. È stato dimostrato che le risposte rappresentative di cellule provenienti da depositi omentali e sottocutanei di tre diversi soggetti umani illustrano la grande variabilità in risposta all'induzione adipogenica tra depositi di grasso dello stesso donatore e tra donatori. Questa immagine mostra la colorazione fluorescente dei lipidi intracellulari nelle cellule CD34+C31+ dopo induzione adipogenica per 13 giorni.

L'immagine mostra cellule con lipidi uniloculare, lipidi multilocuari e nessun accumulo di lipidi. La PCR in tempo reale mostra l'espressione del marcatore adipocitario adiponectina e dei marcatori beige marroni CIDEA e UCP-1. Questi risultati confermano che le cellule che seguono l'induzione adipogenica esprimono marcatori molecolari coerenti con un fenotipo adipocitario misto bianco beige.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare tessuto adiposo umano fresco che è stato raccolto e conservato per non più di due ore. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la citometria a flusso, l'immunoistochimica e la RT-PCR per identificare sottogruppi specifici di cellule rispondenti e l'espressione di marcatori adipocitari maturi che possono essere utilizzati per identificare un fenotipo adipocitario marrone beige.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'obesità per esplorare i ruoli del tessuto adiposo, delle cellule vascolari e dell'adipogenesi negli esseri umani. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare, coltivare ed espandere le cellule CD34+31+. Non dimenticare che lavorare con i tessuti umani può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni, come le norme di biosicurezza.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle comorbidità associate all'obesità, come l'insulino-resistenza, perché identifica la risposta adipogenica delle cellule a un potenziale intervento terapeutico.