Name: Su piccola scala saggi colorimetrici di intracellulare lattato e piruvato nel Nematode Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Impara a estrarre e quantificare lattato e piruvato in Caenorhabditis elegans con saggi colorimetrici su piccola scala. La precipitazione proteica garantisce misurazioni accurate dei metaboliti intracellulari.

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Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente da una sovvenzione speciale di ricerca da Daito Bunka University a Sumino Yanase.

1. sincronizzata cultura di c. elegans
<ol><li>Prima della semina, cultura dell' Escherichia coli (Escherichia coli) ceppo OP50 durante la notte a 37 ° C in 300 mL di terreno liquido di brodo di Luria-Bertani (LB). Conservare il OP50 coltivate-4 ° C.<ol>
<li>Per rendere il mezzo liquido di brodo LB, utilizzare 10 g di triptone, 5 g di Estratto di lievito, 10 g di NaCl e 1,5 mL di NaOH N 1 e aggiungere a 1 L con acqua deionizzata. Sterilizzare in autoclave. Nota: Ceppi OP50 e c. elegans sono disponibili dal centro di genetica della Caenorhabditis (Università del Minnesota, St. Paul, MN, USA).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per rendere agar medio (NGM) crescita del nematode, utilizzare 3 g di NaCl, 2,5 g di peptone, 17 g di agar e 975 mL di acqua deionizzata. Sterilizzare in autoclave. Raffreddare a 55 ° C, quindi sterilmente aggiungere, in ordine, 1 mL di 1 M MgSO4, 1 mL di 1 M CaCl2, 1 mL di colesterolo 5 mg/mL di EtOH e 25 mL di 1 M potassio fosfato pH 6.0 in 90-mm piastre di Petri.<ol>
<li>Per 1 M potassio fosfato pH 6.0, utilizzare 108,3 g di KH2PO4 e 46,6 g di K2HPO4e aggiungere acqua deionizzata a 1 Autoclave L.6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spread 1-2 mL della OP50 coltivate su piastre di agar NGM. Per rendere un sottile strato di OP50, incubare le piastre durante la notte a temperatura ambiente prima di aggiungere qualsiasi nematodi. Nota: Le piastre di agar NGM a che OP50 inoculato può essere conservato temperatura ambiente per 2-3 settimane.</li>
	<li>Aggiungere almeno 100 vermi su una piastra di agar NGM con OP50 e cultura a 20 ° C fino allo stadio adulto. Almeno tre piastre sono necessari.</li>
	<li>Per raccogliere le uova nell'utero, trasferire gravid ermafroditi dalle tre NGM agar piastre ciascuna con 5 mL di buffer di S in una provetta conica da 15 mL e lavare i vermi 3 volte con 15 mL di buffer di S mediante centrifugazione a 300 x g per 30 s a temperatura ambiente.<ol>
<li>Per rendere S buffer, utilizzare 5,9 g di NaCl e 50 mL di 1 M potassio fosfato pH 6.0, aggiungere 1 L con acqua deionizzata. Autoclave6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sciogliere i vermi in una soluzione di ipoclorito alcalino per axenization e uovo isolamento di massa (0,5 mL di candeggina fresco o equivalente: 5-6% ipoclorito di sodio, 0,1 mL di NaOH 10 M, circa 4,5 mL di buffer di S)6, e riposare la soluzione per 10-15 min a temperatura ambiente con miscelazione invertendo. Nota: Entro 15 min, vermi adulti dovrebbero sciogliere, lasciando una soluzione nebuloso di uova liberati dalle loro carcasse (le uova liberate devono essere confermate usando un microscopio stereoscopico). Invece di 0,1 mL di NaOH 10 N, 0,2 mL di NaOH N 5 può anche essere utilizzato.</li>
	<li>Dopo il trattamento di ipoclorito, lavare la pallina di uovo 3 volte con 15 mL di buffer di S e risospendere in 5-6 mL di buffer di S. Si schiudono le uova rilasciate durante un'incubazione overnight a 20 ° C nel buffer di S senza Escherichia coli per una cultura età-sincrono di larve della fase L1.</li>
	<li>Per determinare il numero approssimativo di larve della fase L1, contare i vermi utilizzando un microscopio stereoscopico a 10 µ l di tampone di S dopo risospendere le larve almeno 3 volte e calcolare la media. Quindi, trasferire le larve della fase L1 a cinque piastre di agar NGM con OP50 (1.500-3.000 worm al piatto utilizzando una capsula di Petri di 90 mm) e della coltura a 20 ° C fino a quando non sono cresciuti alla fase adulta giovane, quando comincia l'autofecondazione e poche uova (in genere dopo 3 d AYS).</li>
</ol>2. estrazione della frazione cellulare da c. elegans
<ol><li>Raccogliere i giovani vermi fase adulta (5-giorno-vecchio animali) dalle cinque piastre di agar NGM con buffer di S (Figura 1A).<ol>
<li>Per selezionare solo viti senza fine viventi che usando il saccarosio metodo6 per flottazione il saccarosio 30% (p/v), mescolare i vermi sospesi in 3-4 mL di buffer di S con un volume uguale di saccarosio ghiacciata di 60% (p/v) in una provetta conica da 15 mL. Girare il tubo a 1.500 x g per 15 s a 4 ° C e rimuovere il galleggiante vermi in una nuova provetta spostandoli fuori la parete del tubo con una pipetta Pasteur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavare i vermi 3 volte con tampone di S mediante centrifugazione a 1.500 x g per 30 s a 4 ° C. Controllare il volume bagnato di vermi lavati dopo centrifugazione utilizzando una punta di una micropipetta di 1.000 µ l (Figura 1B).</li>
	<li>Aggiungere i vermi lavati per un volume uguale di gelida 10% (p/v) l'acido tricloroacetico (TCA; concentrazione finale del 5%) per precipitazione della proteina (Figura 1). Invece di TCA, acido perclorico (PCA) o acido metafosforico può essere utilizzato.</li>
	<li>Omogeneizzare i vermi con il precipitante con 40 colpi di un pestello in un omogeneizzatore di Teflon (Potter-Chazen smerigliatrice di tessuto) con rotazione fino a 1.300 giri/min su ghiaccio.</li>
	<li>Trasferire l'omogeneizzato in una fresca microprovetta 1,5 mL con una pipetta Pasteur e sottoporre ad ultrasuoni utilizzando un omogeneizzatore ad ultrasuoni per 3 minuti (3 volte di 1 min) con un 20% duty cycle su ghiaccio.</li>
	<li>Chiarire l'omogeneizzato mediante centrifugazione a 8.000 x g per 10 min a 4 ° C. Neutralizzare i surnatanti con 4M KOH (0,25 volume 10% TCA) per 20 min in ghiaccio e centrifugare a 8.000 x g per 10 min a 4 ° C. Il surnatante (come un esempio di test) si possa depositare a-80 ° C fino a quando i seguenti saggi.</li>
</ol>3. lattato Dosaggio utilizzando un Kit di analisi colorimetrica
<ol><li>Misurare la concentrazione di lattato nei campioni di prova utilizzando un kit di analisi colorimetrica (Tabella materiali). Effettuare l'esame duplex per i campioni di prova. Aggiungere 5 o 10 µ l dei campioni in una piastra a 96 pozzetti e regolare il volume a 50 µ l per pozzetto con il lattato Assay Buffer fornito con il kit.</li>
	<li>Per la curva standard di lattato, diluire 100 mM L (+)-lattato Standard a 1 mM con tampone del lattato. Aggiungere 0, 2, 4, 6, 8 e 10 µ l della mM 1 L (+)-lattato Standard, che viene fornito con il kit, in una serie di pozzi.</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l di miscela di reazione (contenente 46:2:2 di tampone del lattato, Mix di enzima lattato e lattato sonda in DMSO, anidro; tutti i reagenti sono forniti con il kit) o sfondo controllo Mix (contenente 48,2 del tampone del lattato e del lattato Probe) in ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 30-60 min, mentre i campioni sono protetti dalla luce.</li>
	<li>Misurare l'assorbanza di ciascun pozzetto a 570 nm utilizzando un lettore di micropiastre e sottrarre l'assorbanza del controllo Mix sfondo dall'assorbanza della miscela di reazione.</li>
	<li>Tracciare la curva standard di lattato. Calcolare le concentrazioni di lattato dei campioni dalla curva standard del lattato.</li>
</ol>4. piruvato analisi usando un Kit di analisi colorimetrica
<ol><li>Misurare la concentrazione di piruvato nei surnatanti (campioni) utilizzando un kit di analisi colorimetrica (Tabella materiali). Effettuare l'esame duplex per i campioni di prova. Aggiungere 10 µ l di campioni e 90 µ l di reagente di lavoro (contenente 94:1 enzima Mix e il reagente colorante, che sono forniti con il kit) in una piastra a 96 pozzetti e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti, mentre i campioni sono protetti dalla luce.</li>
	<li>Misurare l'assorbanza di ciascun pozzetto a 570 nm utilizzando un lettore di micropiastre.</li>
	<li>Tracciare la curva standard del piruvato. Calcolare le concentrazioni di piruvato dei campioni dalla curva standard del piruvato.</li>
</ol>5. protein Assay per normalizzazione con contenuto proteico
<ol><li>Misurare la concentrazione di proteina nei surnatanti (campioni) utilizzando un kit di analisi colorimetrica (Tabella materiali). Tuttavia, questo passaggio non è limitato a un kit di dosaggio, e altri approcci possono essere utilizzati per misurare la concentrazione di proteina.</li>
	<li>Normalizzare i valori delle concentrazioni di lattato e piruvato fra i campioni di prova usando ogni concentrazione di proteine totali. Nota: Concentrazione nella proteina nei campioni di prova sufficientemente viene rilevato anche dopo la precipitazione della proteina ed è utilizzata per il passo di normalizzazione tra i campioni.</li>
</ol>

<ol><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13298683">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li>
<li>Matoba, S., et al. <a target="_blank" href="http://science.sciencemag.org/content/312/5780/1650.full">p53 regulates mitochondrial respiration.</a> Science. 312, 1650-1653 (2006).</li>
<li>Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+p53%2FCEP-1+is+associated+with+lifespan+extension+through+an+age-related+imbalance+in+the+energy+metabolism+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Impaired p53/CEP-1 is associated with lifespan extension through an age-related imbalance in the energy metabolism of C. elegans.</a> Genes to Cells. 22 (12), 1004-1010 (2017).</li>
<li>Page, A. P., Johnstone, I. L. The C. elegans. Research Community. The cuticle. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPage%2C+AP+%22WormBook%22">WormBook</a>. , (2007).</li>
<li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+the+worm%3A+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50, 4774-4807 (2011).</li>
<li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. <a target="_blank" href="https://www.elsevier.com/books/caenorhibditus-elegans-modern-biological-analysis-of-an-organism/epstein/978-0-12-564149-4">Methods in Cell Biology, Volume 48, Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism</a>. Epstein, H. F., Shakes, D. C. , Academic Press, Inc. 3-29 (1995).</li>
<li>Senoo-Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defect+in+the+cytochrome+b+large+subunit+in+complex+II+causes+both+superoxide+anion+overproduction+and+abnormal+energy+metabolism+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A defect in the cytochrome b large subunit in complex II causes both superoxide anion overproduction and abnormal energy metabolism in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 41553-41558 (2001).</li>
<li>Butler, J. A., Mishur, R. J., Bhaskaran, S., Rea, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+metabolic+signature+for+long+life+in+the+Caenorhabditis+elegans+Mit+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">A metabolic signature for long life in the Caenorhabditis elegans Mit mutants.</a> Aging Cell. 12, 130-138 (2013).</li>
<li>Marbach, E. P., Weil, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+enzymatic+measurement+of+blood+lactate+and+pyruvate%3A+Use+and+significance+of+metaphosphoric+acid+as+a+common+precipitant%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate: Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant.</a> Clinical Chemistry. 13 (4), 314-325 (1967).</li>
<li>Mishur, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+metabolites+extend+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial metabolites extend lifespan.</a> Aging Cell. 15, 336-348 (2016).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Quando si utilizzano questi kit di analisi colorimetrica, la fase più critica nell'estrazione del campione per rilevare cellulare del lattato e del piruvato con precisione in c. elegans è il processo di precipitazione della proteina durante l'omogeneizzazione (Figura 1). Non è strettamente necessario utilizzare un omogeneizzatore di Teflon, come altri omogeneizzatori (ad es., lisata e conico smerigliatrici del tessuto, o mulini del branello) sono adatti anche per l'estrazio...

Le concentrazioni di lattato e piruvato sono ampiamente considerate come prodotti intermedi del metabolismo energetico e sono correlate agli Stati di glicolisi, ciclo dell'acido tricarbossilico (TCA) e catena di trasporto degli elettroni nelle cellule degli organismi aerobici. Una serie di reazioni nella glicolisi ossidare il glucosio a piruvato, che si trova a un bivio metabolico e può essere convertito per carboidrati attraverso gluconeogenesi, acidi grassi e metabolismo energetico attraverso acetil-CoA e l'aminoacido alanina. Ciclo del TCA si verifica in presenza di sufficiente ossigeno disciolto ed è fondamentale per la conversione del glucosio in energia. Soprattutto, l'alterazione del metabolismo secondario è un fenomeno interessante in cui la glicolisi è usata principalmente per la produzione di energia e la respirazione mitocondriale aerobica, che coinvolge il ciclo del TCA e la catena di trasporto degli elettroni, è downregulated in mammiferi cancro cellule1,2. Abbiamo mostrato recentemente che i livelli di lattato e il rapporto lattato/piruvato conseguente (L/P) è diminuito durante l'invecchiamento dell'organismo modello Caenorhabditis elegans (c. elegans). Allo stesso modo, abbiamo trovato che il mammifero tumore soppressore p53 ortholog CEP-1 c. elegans ha un ruolo importante nelle alterazioni del metabolismo energetico attraverso l'attivazione dei suoi bersagli trascrizionali3età-correlate.
In saggi biologici, come la misurazione delle concentrazioni di lattato e piruvato in cellule, sono stati migliorati drammaticamente la sensibilità, precisione, dimensione del campione e tempo di incubazione di kit di saggio colorimetrico/fluorimetrico. A causa di innovazioni tecnologiche, siamo ora in grado di analizzare vari metaboliti e metaboliti intermedi senza la cultura su larga scala di c. elegans, che è difficile date le sue piccole dimensioni. In generale, la sensibilità di un saggio colorimetrico è un ordine di grandezza più piccolo di quello di un'analisi fluorimetrica; Tuttavia, l'approccio colorimetrico è più adatto nella cornice di laboratori comuni. Inoltre, una tecnica di estrazione contenente la precipitazione della proteina e di omogeneizzazione è cruciale per la determinazione quantitativa delle concentrazioni di lattato e piruvato in cellule di c. elegans , perché questo nematode è racchiuso in un esoscheletro chiamato la cuticola, a differenza di linee cellulari di mammifero coltivate4,5. Qui, descriviamo un protocollo per analizzare le concentrazioni di lattato e piruvato usando i kit di analisi colorimetrica commerciali compresi suggerimenti per l'estrazione del campione da c. elegans.

<table><tbody><tr><td>Kit per il dosaggio colorimetrico/fluorimetrico del lattato&nbsp;</td><td>BioVision</td><td>#K607-100</td><td>colorimetrico/fluorimetrico 100 saggi; Conservare a -20oC</td></tr><tr><td>Kit di analisi EnzyChrom Pyruvate </td> Sistemi <td>di analisi Bio </td><td>#EPYR-100</td><td>colorimetrico/fluorimetrico 100 saggi; Conservare a -20oC</td></tr><tr><td>Kit di analisi delle proteine BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>#23225</td><td>test colorimetrico; conservare a &nbsp; temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Acido tricloroacetico</td><td>Wako Pure Chemical</td><td>#207-04955</td><td>conservare a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Omogeneizzatore in teflon&nbsp;</td><td>Iwaki/Pyrex</td><td>#358034 (Wheaton)</td><td>Invece di Iwaki/Pyrex, disponibile da Wheaton</td></tr></tbody></table>

su piccola scala saggi colorimetrici di intracellulare lattato e piruvato nel nematode caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Lattato e piruvato sono intermedi chiave delle vie metaboliche di energia intracellulare. Monitoraggio del rapporto lattato/piruvato in cellule aiuta a determinare se vi è uno squilibrio nel metabolismo energetico senile tra fosforilazione ossidativa mitocondriale e glicolisi aerobica. Qui, ci mostra l'utilizzo di kit di analisi colorimetrica commerciale per lattato e piruvato nell'organismo modello di c. elegans. Recentemente, la sensibilità e la precisione dei kit colorimetrico/fluorimetrica dosaggio sono stati migliorati notevolmente dalla ricerca e sviluppo condotti da produttore di reagente. I reagenti migliorati hanno permesso l'uso di dosaggi in piccola scala con una piastra a 96 pozzetti in c. elegans. In generale, un'analisi fluorimetrica è superiore nella sensibilità a un saggio colorimetrico; Tuttavia, l'approccio colorimetrico è più adatto per l'uso nei comuni laboratori. Un'altra questione importante in queste analisi per la determinazione quantitativa è precipitazione della proteina di omogeneizzato di c. elegans campioni. Nel nostro metodo di precipitazione della proteina, precipitanti comune (ad es., acido tricloroacetico, acido perclorico e acido metafosforico) vengono utilizzati per la preparazione del campione. Un campione di analisi senza proteine è preparato aggiungendo direttamente freddo precipitante (concentrazione finale del 5%) durante l'omogeneizzazione.

Utilizzando l'analisi colorimetriche per la determinazione quantitativa delle concentrazioni di lattato e piruvato, abbiamo mostrato la precisione di questi saggi rispetto ai rapporti precedenti in c. elegans7,8. Qui, il processo di precipitazione della proteina durante l'estrazione del campione è stato il passaggio più importante per generare valori accurati. Per precipitazione della proteina, precipitanti comune (ad...

Descriviamo un estrazione modificate su piccola scala e analisi colorimetriche del lattato e del piruvato nel nematode elegans del c. Quando si utilizzano i corredi di analisi commerciale, lo sviluppo tecnico della loro sensibilità e la precisione è importante. Precipitazione della proteina nell'estrazione è la fase più critica per la determinazione quantitativa dei metaboliti intracellulari.

Su piccola scala saggi colorimetrici di intracellulare lattato e piruvato nel Nematode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Questa ricerca può aiutare a rispondere a qualsiasi domanda in essi nel campo del biochimica e della metodologia come un'analisi dei diritti di sviluppo nel nematode. Il principale vantaggio di questa tecnica è la precipitazione proteica nell'estroduzione e nella bevanda e l'omogeneizzazione dei vermi. Inizia questo esperimento coltivando il ceppo E.coli OP50 in 300 millilitri di mezzo liquido di brodo LB a 37 gradi Celsius durante la notte.Archiviare OP50 di successo a quattro gradi Celsius. Pipetta due millilitri dell'OP50 coltivato su almeno tre NGM precedentemente preparati, o Nematode Growth Media Agar Plates e spalmato a mano ruotando la piastra. Incubare le piastre a temperatura ambiente durante la notte per creare un sottile strato di OP50.Quindi, utilizzare uno stuzzicadenti sterile per raccogliere un pezzo di agar da un piatto con vermi, per aggiungere almeno 100 vermi a ogni piastra NGM OP50. Coltura almeno tre piastre con i vermi a 20 gradi Celsius, fino a quando i vermi raggiungono lo stadio adulto, che è confermato al microscopio stereoscopico. Individua gli ermafroditi gravidi pieni di uova usando un microscopio stereoscopico.Dopo aver aggiunto cinque millilitri di S

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