Su piccola scala saggi colorimetrici di intracellulare lattato e piruvato nel Nematode Caenorhabditis elegans

Questa ricerca può aiutare a rispondere a qualsiasi domanda in essi nel campo del biochimica e della metodologia come un'analisi dei diritti di sviluppo nel nematode. Il principale vantaggio di questa tecnica è la precipitazione proteica nell'estroduzione e nella bevanda e l'omogeneizzazione dei vermi. Inizia questo esperimento coltivando il ceppo E.coli OP50 in 300 millilitri di mezzo liquido di brodo LB a 37 gradi Celsius durante la notte.

Archiviare OP50 di successo a quattro gradi Celsius. Pipetta due millilitri dell'OP50 coltivato su almeno tre NGM precedentemente preparati, o Nematode Growth Media Agar Plates e spalmato a mano ruotando la piastra. Incubare le piastre a temperatura ambiente durante la notte per creare un sottile strato di OP50.

Quindi, utilizzare uno stuzzicadenti sterile per raccogliere un pezzo di agar da un piatto con vermi, per aggiungere almeno 100 vermi a ogni piastra NGM OP50. Coltura almeno tre piastre con i vermi a 20 gradi Celsius, fino a quando i vermi raggiungono lo stadio adulto, che è confermato al microscopio stereoscopico. Individua gli ermafroditi gravidi pieni di uova usando un microscopio stereoscopico.

Dopo aver aggiunto cinque millilitri di S-buffer alle piastre, utilizzare la pipetta Pasteur per trasferire i vermi da tutte e tre le piastre a un tubo conico da 15 millilitri. Lavare i vermi tre volte aggiungendo 15 millilitri di S-buffer e quindi centrifugando a 300 volte G a temperatura ambiente per 30 secondi. Se il volume di S-buffer supera i cinque millilitri, rimuovere il buffer in eccesso dopo la centrifugazione.

Per un'esonizzazione riuscita e l'isolamento delle uova sfuse, sciogliere i vermi in 0,5 millilitri di soluzione di ipoclorato alcalino. Mescolare invertendo e incubando a temperatura ambiente per 10-15 minuti. Centrifugare a 1.400 giri/min per 30 secondi per rimuovere la soluzione.

Utilizzare 15 millilitri di S-buffer per lavare il pellet di uova. Dopo la centrifugazione rimuovere il supernatante e ripetere questo lavaggio almeno tre volte. Dopo l'ultimo lavaggio, sospendiamo il pellet in cinque o sei millilitri di S-buffer, senza E.coli e incubamo le uova durante la notte a 20 gradi Celsius per schiuderle e raggiungere la coltura sincrona H delle larve dello stadio L1.

Pipetta 10 microlitri di tampone S contenenti vermi L1 su tre scivolamenti di copertura. Contare le larve al microscopio stereoscopico e calcolare la media per determinare il numero approssimativo di larve dello stadio L1. Infine, trasferisci le larve dello stadio L1 in cinque piastre Agar NGM con OP50 e coltivale a 20 gradi Celsius fino allo stadio del giovane adulto, durante il quale si verifica l'autofertilizzazione e vengono deposte alcune uova.

Osserva i vermi ogni giorno al microscopio e poi raccogli i giovani vermi adulti o di cinque giorni. Per selezionare solo vermi viventi, aggiungere i vermi sospesi in tre o quattro millilitri di S-buffer a un tubo conico da 15 millilitri. Quindi aggiungere un volume uguale di saccarosio al 60% ghiacciato e mescolare.

Centrifugare il tubo a 1.500 volte G a quattro gradi Celsius per 15 secondi. Quindi utilizzare una pipetta Pasteur per spostare attentamente i vermi dalla parete del tubo, quindi rimuovere i vermi galleggianti in un tubo fresco. Riempire il tubo con S-buffer per lavare i vermi e centrifugare a 1500 volte G a quattro gradi Celsius per 30 secondi.

Rimuovere il tampone e ripetere il lavaggio altre due volte. Dopo il terzo lavaggio, rimuovere con cura il supernatante, assicurandosi di non rimuovere alcun verme, e utilizzare una punta di pipetta da 1.000 microliter per misurare il volume umido dei vermi lavati. Per la precipitazione proteica, utilizzare una pipetta Pasteur per aggiungere i vermi lavati a un volume uguale di acido tricloroacetico ghiacciato al 10% in un omogeneizzatore posto sul ghiaccio.

Omogeneizzare utilizzando 40 tratti di passel con rotazione, fino a 1.300 giri/min. Utilizzare un omogeneizzatore ad ultrasuoni con ciclo di servizio del 20% per sonicare l'omogeneizzatore. Utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire l'omogeneato in un tubo da 1,5 millilitri posto sul ghiaccio.

Dopo aver trasferito l'omogeneato in un tubo di micro centrifuga, centrifugare a 8.000 volte G a quattro gradi Celsius per 10 minuti per chiarirlo. Trasferire il supernatante su un tubo fresco e aggiungere quattro cloruri di potassio molare e incubare sul ghiaccio per 20 minuti per neutralizzarlo. Quindi centrifugarlo a 8.000 volte G a quattro gradi Celsius per 10 minuti.

Trasferire il supernatante in un tubo fresco e conservare a 80 gradi Celsius fino a quando necessario per ulteriori test. Per misurare la concentrazione di lattato, utilizzare un kit di saggi colorimetrici per effettuare analisi duplicate per i campioni di prova. Aggiungere 10 microlitri dei campioni di prova a ciascun pozzo di una piastra da 96 porcili, quindi aggiungere il tampone di dosaggio del lattato a ciascun campione per regolare il volume a 15 microlitri.

Diluire 100 millimolare L+Lattato Standard con tampone di dosaggio del lattato a un millimolare. Quindi, in una serie di pozzi, aggiungere zero, due, quattro, sei, otto e 10 microlitri di L+Lattato Standard diluito. Aggiungere 50 microlitri di miscela di reazione ad ogni pozzo e incubare a temperatura ambiente protetta dalla luce per almeno 30 minuti affinché il colore si sviluppi.

Infine, utilizzare un lettore di micropiastrine per misurare l'assorbanza di ogni pozzo a 570 nanometri. Sottrarre l'assorbanza della miscela di controllo dello sfondo dall'assorbanza della miscela di reazione. Quindi tracciare la curva standard del lattato e calcolare le concentrazioni di lattato dalla curva moltiplicando ogni concentrazione per 2,25.

Utilizzare un kit di dosaggio colorimetrico per misurare la concentrazione di piruvato nei campioni di prova ed eseguire esami duplex. Aggiungere 10 microlitri dei campioni di prova a diversi pozzi di una piastra da 96 porri e aggiungere 90 microlitri di reagente funzionante a ciascun campione. Incubare coperto per 30 minuti a temperatura ambiente.

Quindi posizionare la piastra nel lettore di micropiastrine per misurare l'assorbenza di ogni pozzo a 570 nanometri. Tracciare la curva standard del piruvato e calcolare le concentrazioni di piruvato dalla curva standard moltiplicando ogni concentrazione per 2,25. E infine, per misurare la concentrazione proteica nei campioni di prova, utilizzare un kit di saggi colorimetrici come descritto nel protocollo di testo.

Dopo la precipitazione delle proteine, i saggi colorimetrici possono essere utilizzati per la determinazione quantitativa delle concentrazioni di lattato e piruvato. Questo esperimento mostra l'accuratezza dei saggi colorimetrici contrari ai precedenti rapporti in C.Elegans. Inoltre, questi saggi sono sufficientemente sensibili da misurare le concentrazioni di lattato e piruvato anche in campioni su piccola scala in un breve periodo di tempo.

Per rilevare con precisione lattato e piruvato in C.elegans, è fondamentale eseguire precipitazioni proteiche durante l'omogeneizzazione dei vermi. La quantità di lattato e piruvato rilevata è più elevata quando i campioni vengono precipitati in proteine durante l'omogeneizzazione, rispetto alla frazione citosolica intatta o dopo l'omogeneizzazione quando non è stato rilevato alcun lattato o piruvato.