Name: Confronto ad alta risoluzione delle frequenze di Coniugazione batterica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: Scopri un metodo ad alta risoluzione per rilevare le differenze nella frequenza di coniugazione batterica. Questa tecnica consente di misurare con precisione l'efficienza dei batteri donatori nell'iniziare il trasferimento di plasmidi.

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Ringraziamo il Dr. K. Kamachi del National Institute of Infectious Diseases (Giappone) per la fornitura di pBP136 e Dr. H. Nojiri dell'Università di Tokyo (Giappone) per la fornitura di pCAR1. Siamo anche grati al Professor Dr. Molin Sølen della Technical University of Denmark per fornire pJBA28. Questo lavoro è stato supportato da JSPS KAKENHI (Grant numeri 15H 05618 e 15KK0278) per MS (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).

1. preparazione di un donatore con la proteina fluorescente verde (GFP)- e kanamicina resistenza Gene-etichetta plasmidi
<ol><li>Introduzione di geni marcatori nel bersaglio plasmide pBP136 Nota: L'obiettivo del presente protocollo è quello di generare pBP136::gfp. I ceppi batterici e plasmidi utilizzati in questo studio sono elencati nella tabella 1.<ol>
<li>Coltivare colture di Escherichia coli DH10B che harboring pBP13617 a 5 mL di brodo di Luria sterile (LB) ed e. coli S17-1λpir18 che harboring pJBA2819 [contenente una kanamicina (Km)-resistenza gene e gfp mut3 * gene con il suo promotore e terminator in un mini-Tn5] in 5 mL di LB sterile contenente 50 μg/mL Km a 37 ° C durante la notte (O/N, 16 – 24 h) con agitazione a 200 giri al minuto (rpm).</li>
		<li>Raccolta e lavaggio<ol>
<li>Raccolta 1 mL di ciascuna cultura, metterlo in una microprovetta da 2 mL e centrifugare (10.000 × g, temperatura ambiente, 2 min). Quindi, eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 2 mL di soluzione salina sterile tamponata al fosfato (PBS).</li>
			<li>Centrifugare nuovamente (10.000 × g, temperatura ambiente, 2 min) e risospendere in 500 μL di PBS sterile.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Accoppiamento del filtro<ol>
<li>Preparare piatti della libbra sterile (con 1,6% agar) e inserire un filtro a membrana sterile 0.22 μm poro formato su di esso. Mix 500 μL di e. coli S17-1λpir pJBA28 harboring con Escherichia coli DH10B che harboring pBP136 e spot la miscela sul filtro sulla piastra LB. Incubare la piastra O/N a 30 ° C. Rimuovere il filtro dalla piastra LB, inserirlo in un tubo di plastica sterile 50 mL e aggiungere 1 mL di PBS sterile. Nota: pJBA28 può replicare in presenza di proteina Π, codificata dal gene pir 18e possono essere trasferiti da S17-1λpir a DH10B. pBP136 trasporta nessun marcatore gene17 e possono essere trasferiti da DH10B a S17-1λpir. Pertanto, non potremmo distinguere S17-1λpir che harboring pBP136 e pJBA28 da DH10B harboring pBP136 e il mini-Tn5 (recepita nel cromosoma o pBP136) in questa fase. Quindi, abbiamo usato miscele di essi come donatori nei passaggi successivi (1.1.4.–1.1.5.).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Far crescere una cultura di O/N di miscela degli amori di cui sopra in LB sterile contenente 50 μg/mL Km a 37 ° C con agitazione a 200 giri/min e una cultura di Pseudomonas putida KT2440 [Km-sensibili (Kms), sensibili alla rifampicina (Rif.s), gentamicina-sensibili (Gms) e tetraciclina resistente (Tcr)] in mezzo contenente Tc 12,5 µ g/mL a 30 ° C con agitazione a 200 giri/min.</li>
		<li>Dopo la raccolta e lavaggio le celle come descritto al punto 1.1.2 utilizzarli (accoppiamento miscela e KT2440) per il filtro per accoppiamento (O/N, 30 ° C) come descritto al punto 1.1.3.</li>
		<li>Preparare piatti della libbra sterile contenente 50 μg/mL Km e 12.5 μg/mL Tc (Tc + LB + Km piastre).</li>
		<li>Diluire la miscela sedimento su membrana filtrante con PBS sterile (101– 105-piega) e quindi diffusione ogni diluizione su LB + Km + Tc piastre e incubare le piastre a 30 ° C per 2 – 3 d.</li>
		<li>Pick colonie dalle piastre, far crescere una cultura di O/N in LB sterile contenente Km e Tc, nonché P. resinovorans CA10dm4RG (Rifr e Gmr)6 in LB sterile contenente Rif (25 μg/mL) e Gm (30 μg/mL) a 30 ° C e 200 giri/min. Nota: Come descritto nella nota precedente, le colonie sul LB + Km + Tc piastre (da 1.1.7.) potrebbe essere harboring pBP136 KT2440 portando un mini-Tn5 e KT2440 con un mini-Tn5, perché pJBA28 potrebbero essere trasferiti direttamente da S17-1λpir che harboring pBP136 e pJBA28 a KT2440. Ecco perché un altro accoppiamento con p. resinovorans CA10RG è necessaria per ottenere la pBP136 di destinazione con un mini-Tn5 nei passaggi seguenti.</li>
		<li>Dopo la raccolta e lavaggio le celle come descritto al punto 1.1.2, utilizzarli per il filtro per accoppiamento (O/N, 30 ° C) come descritto al punto 1.1.3.</li>
		<li>Preparare piatti della libbra sterile contenente Rif, Gm e Km (LB + Rif + Km Gm piastre).</li>
		<li>Risospendere la miscela sul filtro e quindi diluirlo 101– 105-piegare, diffonderlo sul LB + Rif + Km Gm piastre e incubare le piastre per 2 – 3 d a 30 ° C.</li>
		<li>Scegli le colonie e verifica se loro porto pBP136 mediante PCR utilizzando primers specifici per il plasmide.</li>
	</ol></li>
	<li>Introduzione di un gene marcatore selettivo il bersaglio plasmide pCAR1 Nota: L'obiettivo del presente protocollo è quello di generare pCAR1::gfp
	<ol>
<li>Far crescere una cultura di O/N di p. putida KT2440 che harboring pCAR1 (Kms, Gms, Rifs, Tcr)20 a 200 giri/min e 30 ° C ed e. coli S17-1λpir18 che harboring pJBA28 in 5 mL di LB sterile contenente 50 μg/mL Km a 200 giri/min e 37 ° C.</li>
		<li>Dopo la raccolta e lavaggio le celle come descritto al punto 1.1.2, utilizzarli per il filtro per accoppiamento (O/N, 30 ° C) come descritto al punto 1.1.3.</li>
		<li>Rimuovere il filtro dalla piastra LB, inserirlo in un tubo di plastica sterile 50 mL e aggiungere 1 mL di PBS sterile.</li>
		<li>Diluire la miscela di sedimento con PBS sterile (101– 105-piega) e diffondere la miscela diluita sulla sterile selettiva LB + Tc + Km piastre. Nota: pCAR1 non replica in e. coli; così, p. putida KT2440 harboring pCAR1 con un mini-Tn5 può essere selezionato su LB + Tc + Km piastre.</li>
		<li>Scegli una colonia dalla piastra e far crescere una cultura di O/N in LB sterile contenente Km e Tc e una cultura di P. resinovorans CA10dm4RG in LB sterile contenente Rif e Gm (200 giri/min, 30 ° C).</li>
		<li>Dopo la raccolta e lavaggio come al punto 1.1.2, utilizzare le celle per il filtro per accoppiamento (O/N, 30 ° C) come descritto al punto 1.1.3.</li>
		<li>Risospendere la miscela sul filtro e quindi diluirlo, stendere su LB + Rif + Km Gm piastre e incubare le piastre per 2 – 3 d a 30 ° C.</li>
		<li>Scegli le colonie e verifica se loro porto pCAR1 mediante PCR con primers specifici per il plasmide.</li>
	</ol></li>
	<li>Confermare la trasferibilità dei plasmidi taggati e preparare i donatori per i prossimi passi Nota: L'obiettivo del presente protocollo è quello di confermare la trasferibilità dei plasmidi costruiti sopra e preparare i donatori per i passaggi successivi.<ol>
<li>Far crescere una cultura di O/N di p. resinovorans CA10dm4RG che harboring pBP136::gfp o pCAR1::gfp in LB sterile contenente Km e una cultura di p. putida SMDBS [Kms, Gms, Rifr, Tcr, lacI q, in cui PA1/O4/O3-gfpmut3* non è espresso a causa del relativo geneq cromosomiche lacI]21 in 3 mL di LB contenente Tc (200 giri/min, 30 ° C).</li>
		<li>Dopo la raccolta e lavaggio le celle come descritto al punto 1.1.2, utilizzarli per il filtro per accoppiamento (O/N, 30 ° C) come descritto al punto 1.1.3.</li>
		<li>Posizionare il filtro in un tubo di plastica sterile 50ml e risospendere con 1 mL di PBS sterile. Diluire la miscela di sedimento con PBS sterile (101– 105-piega), stendere l'impasto diluito sulla sterile selettiva LB + Tc + Km piastre.</li>
		<li>Scegli le colonie e verifica se loro porto di ciascuno dei plasmidi mediante PCR con primers specifici. Nota: Conferma della posizione di inserimento delle mini-Tn5 mediante sequenziamento diretto dopo l'estrazione del plasmide è facoltativo, per confermare che l'inserimento non pregiudica la funzione di trasferimento del plasmide.</li>
	</ol></li>
</ol>2. calcolo della frequenza di coniugazione dal metodo MPN
<ol><li>Preparare sterile LB + Km e LB Gm piastre.</li>
	<li>Far crescere una cultura di O/N di p. putida SMDBS che harboring pBP136::gfp o pCAR1::gfp in 3 mL di LB sterile contenente Km e una cultura di p. putida KT2440RGD (Gmr, Rifr) in 3 mL di LB contenente Gm (140 giri/min, 30 ° C).</li>
	<li>Dopo la raccolta e lavaggio le celle come descritto al punto 1.1.2, utilizzarli per il filtro per accoppiamento a 30 ° C per 45 min come descritto al punto 1.1.3.</li>
	<li>In serie diluito sopra donatore e del ricevente di cultura (101 – 107) e diffonderlo su LB + Km (donatore) o LB + Gm (destinatario) (ciascuno in triplice copia) piastre per contare le unità formanti colonia (UFC). Incubare le piastre a 30 ° C per 2 d.</li>
	<li>Risospendere la miscela sul filtro in LB sterile contenente Km e Gm e diluire in serie (da 21 224– 107.2) utilizzando una piastra di coltura cellulare di 96 pozzetti (in quadruplice copia).</li>
	<li>Incubare la piastra a 96 pozzetti per la durata appropriata (2 d a 30 ° C).</li>
	<li>Contare i CFU del donatore e del ricevente sulle piastre (punto 2.4.) e contare il numero di pozzetti in cui il transconjugants crescere.</li>
	<li>Calcolare il MPN e della sua deviazione utilizzando il programma di calcolo MPN sviluppato da Jarvis et al. 22, che è disponibile presso http://www.wiwiss.fu-berlin.de/fachbereich/vwl/iso/ehemalige/professoren/wilrich/MPN_ver5.xls.<ol>
<li>Immettere il nome dell'esperimento (es., 'test'), la data dell'esperimento (es., 9/4/2018), il numero di serie di test e il max. No. delle diluizioni (immettere '24') in lamiera di ferro #7 del 'Programma' di Excel il file ('MPN_ver5.xls').</li>
		<li>Immettere ' 2-1 (= 0.5) per 2-24 (= 5.96 × 10-8)' nella colonna 'fattore di diluizione d', '0,01' nella colonna 'volume in ml o g w'e 4' in ' No. di tubi n' nelle tabelle automaticamente prodotte ' dei dati di input'.</li>
		<li>Immettere il numero di pozzetti in cui il transconjugants crescere ad ogni diluizione del campione (0 – 4).</li>
		<li>Premere il pulsante 'Calcolare risultati' e quindi ottenere risultati (in MPN/μL) e loro limiti di confidenza di 95% (inferiore e superiore).</li>
	</ol>
</li>
	<li>I numeri del donatore e cellule recettive (CFU/mL) per calcolare la frequenza di Coniugazione dei plasmidi dividendo il numero di transconjugants (MPN/mL).</li>
</ol>3. preparazione per la stima della probabilità di coniugazione avviate da donatore
<ol><li>Far crescere una cultura di O/N di p. putida SMDBS che harboring pBP136::gfp o pCAR1::gfp in 3 mL di LB sterile contenente Km e una cultura di p. putida KT2440RGD (Gmr, Rifr) in 3 mL di LB sterile contenente Gm utilizzando 300 mL Boccette (140 giri/min, 30 ° C) come precultures.</li>
	<li>Trasferire 200 μL della coltura in 200 mL di fresca LB sterile contenente Km o Gm in flaconi da 500 mL e incubare a 30 ° C con agitazione a 140 giri/min.</li>
	<li>Misurare la torbidità a 600 nm (OD600) della cultura utilizzando un spettrofotometro UV-VIS e spot la cultura, diluito in LB (101– 108-piegare diluizioni), su un vassoio LB contenente Km o piastre di GM. Incubare questi LB a 30 ° C per 1 – 2 d e determinare il CFU.</li>
	<li>Tracciare i valori di600 OD e il CFU con il tempo di crescita per generare le curve di crescita del donatore e del ricevente.</li>
	<li>Coltivare culture del ceppo donatore e ricevente alla fase di Mid-registro, basata sulla curva di crescita.</li>
	<li>Dopo la raccolta e le cellule di lavaggio, preparare 101– 103 CFU del donatore in 10 μL di LB e 105– 107 CFU del destinatario in 100 μL di LB.</li>
	<li>Miscelare 10 μL del donatore e 100 μL delle culture destinatario a quote differenziate in piastre da 96 pozzetti (in triplice copia). Per esempio, mescolare 101 CFU del donatore e 105 CFU del destinatario e aggiungere a ciascuno dei 96 pozzetti e mescolare 101 CFU del donatore e 106 CFU del destinatario in un'altra piastra a 96 pozzetti, e così via.</li>
	<li>Incubare la miscela a 30 ° C per 45 min e quindi aggiungere le alte concentrazioni di antibiotici (100 μg/mL Km e 60 μg/mL Gm) ad ogni pozzetto per inibire ulteriormente coniugazione.</li>
	<li>Incubare la piastra a 30 ° C per 2 d.</li>
	<li>Contare il numero di pozzetti in cui transconjugants crescere.</li>
	<li>Scegliere la densità destinatario appropriato per stimare la probabilità di coniugazione donatore-avviata sulla base dei dati di cui sopra (transconjugants dovrebbe essere trovato in almeno 1 bene di una piastra a 96 pozzetti). Nota: Transconjugants si svilupperà in tutti i pozzetti, quando la densità delle cellule del donatore e del ricevente sono alti e più di una coniugazione si verifica in un pozzo. Al contrario, nessun transconjugants si troverà in qualsiasi pozzi quando la densità cellulare è troppo bassa. Nella sezione seguente, una cella singolo donatore viene ordinata in un pozzo. Di conseguenza, la densità di destinatario dovrebbe essere al massimo.</li>
</ol>4. stima della probabilità di coniugazione avviate da donatore
<ol><li>Preparare 200 mL di una cultura di Mid-registro fase del donatore p. putida SMDBS che harboring pBP136::gfp o pCAR1::gfp e quello del destinatario p. putida KT2440RGD, come descritto in 3.6 – 3.7.</li>
	<li>Posto 106 CFU del destinatario in 100 μL di LB in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.</li>
	<li>Impostare il sistema FACS (selezionatore delle cellule e citometria a flusso con un braccio robotico, un laser di argon 488 nm e un foro dell'ugello di 70 μm). Impostare su forward scatter (FSC), con una soglia di 1% come il trigger di acquisizione. Regolare il guadagno di H e un guadagno di FSC e side scatter (SSC) alla massima sensibilità, che può escludere falsi segnali positivi, utilizzando PBS come controllo negativo. Impostare la porta di ordinamento basata su FSC e SSC e modalità di ordinamento di goccia 0,5 per purezza massima sorta.</li>
	<li>Ordina una cella singolo donatore di FACS su una piastra di LB (384 punti diversi), incubare la piastra a 30 ° C per 2 d e poi contare quante colonie compaiono sulla lastra dalle cellule ordinate. Nota: Questa procedura è per la convalida del cancello set. Se ci sono 384 colonie sulla piastra, vuol dire che il 100% delle cellule ordinate potrebbe formare colonie. La validità media di ordinamento è sempre 90 – 95%.</li>
	<li>Ordinare una cella singolo donatore di FACS in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con il destinatario (4.2).</li>
	<li>Incubare la piastra per 45 min a 30 ° C e quindi aggiungere le alte concentrazioni di antibiotici (100 μg/mL Km e 60 μg/mL Gm) in ogni pozzetto per impedire ulteriore coniugazione.</li>
	<li>Incubare la piastra a 30 ° C per 2 d.</li>
	<li>Contare il numero di pozzetti in cui transconjugants si è sviluppato come determinato mediante ispezione visiva con l'occhio nudo.</li>
	<li>Calcolare la probabilità di coniugazione avviate da donatore dividendo il numero di pozzetti con transconjugants per il numero totale dei pozzi in cui il donatore è stato risolto.</li>
</ol>

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<li>Andersen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+unstable+variants+of+green+fluorescent+protein+for+studies+of+transient+gene+expression+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 64 (6), 2240-2246 (1998).</li>
<li>Shintani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+replication%2C+maintenance%2C+and+transfer+features+of+the+IncP-7+plasmid+pCAR1%2C+which+carries+genes+involved+in+carbazole+and+dioxin+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the replication, maintenance, and transfer features of the IncP-7 plasmid pCAR1, which carries genes involved in carbazole and dioxin degradation.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (5), 3206-3216 (2006).</li>
<li>Shintani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analyses+revealed+transfer+ranges+of+IncP-1%2C+IncP-7%2C+and+IncP-9+plasmids+in+a+soil+bacterial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Single-cell analyses revealed transfer ranges of IncP-1, IncP-7, and IncP-9 plasmids in a soil bacterial community.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 138-145 (2014).</li>
<li>Jarvis, B., Wilrich, C., Wilrich, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconsideration+of+the+derivation+of+most+probable+numbers%2C+their+standard+deviations%2C+confidence+bounds+and+rarity+values%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Reconsideration of the derivation of most probable numbers, their standard deviations, confidence bounds and rarity values.</a> Journal of Applied Microbiology. 109 (5), 1660-1667 (2010).</li>
<li>Haagensen, J. A., Hansen, S. K., Johansen, T., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+horizontal+transfer+of+mobile+genetic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Ecology%22%5BJournal%5D)">In situ detection of horizontal transfer of mobile genetic elements.</a> FEMS Microbiology Ecology. 42 (2), 261-268 (2002).</li>
<li>Herrero, M., de Lorenzo, V., Timmis, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+vectors+containing+non-antibiotic+resistance+selection+markers+for+cloning+and+stable+chromosomal+insertion+of+foreign+genes+in+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 172 (11), 6557-6567 (1990).</li>
<li>Bagdasarian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific-purpose+plasmid+cloning+vectors.+II.+Broad+host+range%2C+high+copy+number%2C+RSF1010-derived+vectors%2C+and+a+host-vector+system+for+gene+cloning+in+Pseudomonas%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas.</a> Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).</li>
<li>Maeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+nucleotide+sequence+of+carbazole%2Fdioxin-degrading+plasmid+pCAR1+in+Pseudomonas+resinovorans+strain+CA10+indicates+its+mosaicity+and+the+presence+of+large+catabolic+transposon+Tn4676%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Complete nucleotide sequence of carbazole/dioxin-degrading plasmid pCAR1 in Pseudomonas resinovorans strain CA10 indicates its mosaicity and the presence of large catabolic transposon Tn4676.</a> Journal of Molecular Biology. 326 (1), 21-33 (2003).</li>
<li>Takahashi, Y., Shintani, M., Yamane, H., Nojiri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+nucleotide+sequence+of+pCAR2%3A+pCAR2+and+pCAR1+were+structurally+identical+IncP-7+carbazole+degradative+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%2C+Biotechnology%2C+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The complete nucleotide sequence of pCAR2: pCAR2 and pCAR1 were structurally identical IncP-7 carbazole degradative plasmids.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (3), 744-746 (2009).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui, presentiamo un protocollo ad alta risoluzione per individuare differenze nella frequenza di coniugazione in condizioni diverse, utilizzando un metodo MPN per stimare il numero di transconjugants. Un passo importante nel protocollo è diluire la miscela del donatore e del ricevente dopo l'accoppiamento fino a quando non transconjugants crescere. Un altro passo è aggiunta di alte concentrazioni di antibiotici al mezzo liquido selettivo per prevenire ulteriori coniugazione. Queste procedure possono ridurre lo sfondo cau...

Coniugazione batterica di elementi genetici mobili, plasmidi coniugativi ed elementi integranti e coniugativi (CIEM) è importante per la diffusione orizzontale delle informazioni genetiche. Può promuovere l'adattamento e la rapida evoluzione batterica e trasmettere la resistenza del multidrug geni1,2. La frequenza di coniugazione può essere influenzata da proteine codificate sugli elementi coniugativi mobilitazione dei DNA (MOB) e formazione di accoppiamento coppia (MPF), tra cui pili di sesso, che sono classificati secondo MOB e MPF tipo3,4, 5. Esso può essere influenzata anche dal donatore e ricevente coppia6 e le condizioni di crescita delle cellule7,8,9,10,11,12 ( tasso di crescita, densità cellulare, superficie del solido o liquido, temperatura, disponibilità nutriente e alla presenza di cationi). Per capire come gli elementi coniugativi diffusione tra batteri, è necessario confrontare la frequenza di coniugazione in dettaglio.
La frequenza di coniugazione tra donatore e destinatario coppie dopo l'accoppiamento di solito sono stimati con i metodi convenzionali come segue. (i) in primo luogo, il numero di colonie di donatore e ricevente è contato; (ii) quindi, sono contate le colonie destinatario, che ha ricevuto gli elementi coniugativi (= transconjugants); (iii) e infine, la frequenza di coniugazione è calcolata dividendo l'unità formanti colonia (UFC della transconjugants) per quelli del donatore e/o destinatario13. Tuttavia, quando si utilizza questo metodo, lo sfondo è alto a causa di eventi di coniugazione aggiuntivi che possono verificarsi anche sulle piastre selettive utilizzate per ottenere transconjugants quando la densità cellulare è alta10. Di conseguenza, è difficile da rilevare piccole differenze nella frequenza (sotto una differenza di 10 volte). Abbiamo recentemente introdotto un metodo (MPN) numero più probabile, utilizzando il mezzo liquido che contiene una maggiore concentrazione di antibiotici. Questo metodo ha ridotto lo sfondo inibendo ulteriormente coniugazione in terreno selettivo; quindi, potrebbe essere valutata la frequenza di coniugazione con risoluzione superiore.
Coniugazione può essere suddiviso in tre passaggi: (1) allegato del donatore-destinatario coppia (2) l'inizio del trasferimento coniugativi e (3) la dissociazione della coppia14. Durante la procedura (1) e (3), non c'è interazione fisica tra il donatore e cellule recettive; così, la densità delle cellule e delle condizioni ambientali possono influenzare questi passaggi, anche se le caratteristiche di pili il sesso sono anche importanti. Passo (2) probabilmente è regolata dall'espressione di diversi geni coinvolti nella coniugazione in risposta ai cambiamenti esterni, che potrebbe essere influenzata da varie caratteristiche del plasmide, del donatore e del ricevente. Anche se il fisico allegato o distacco di coppie donatore-ricevente può essere matematicamente simulato utilizzando una stima delle cellule come particelle, la frequenza di passaggio (2) deve essere misurata sperimentalmente. Ci sono state alcune segnalazioni su osservazioni dirette di come spesso i donatori possono avviare coniugazione [passo (2)] mediante fluorescenza microscopia15,16; Tuttavia, questi metodi non sono ad alta velocità, perché un numero elevato di celle dovrà essere monitorato. Di conseguenza, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per stimare la probabilità di occorrenza di passaggio (2) utilizzando celle attivate la fluorescenza che ordinano (FACS). Il nostro metodo può essere applicato a qualsiasi plasmide, senza identificazione dei geni essenziali per coniugazione.

<table><tbody><tr><td>MoFlo XDP</td><td>Beckman-Coulter</td><td>ML99030</td><td>FACS</td></tr><tr><td>IsoFlow</td><td>Beckman-Coulter</td><td>8599600</td><td>Guaina soluzione</td></tr><tr><td>Fluorosfere (10 &mu; m)</td>Perline <td>di 6605359</td> <td>Beckman-Coulter</td><td>per l'installazione dell'incubatore FACS</td></tr><tr><td>Yamato</td><td>Scientific Co. Ltd</td><td>211197-IC802</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro UV-VIS UV-1800</td><td>SIMADZU Corporation</td><td>UV-1800</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 96 pozzetti</td><td>NIPPON Genetics Co, Ltd</td><td>TR5003</td><td></td></tr><tr><td>micropiastra tipo Piastra di Petri</td><td>AXEL</td><td>1-9668-01</td><td>per la convalida della selezione</td></tr><tr><td>filtro a membrana</td><td>ADVANTEC</td><td>C045A025A</td><td>per filtri di accoppiamento</td></tr><tr><td>pippettes</td><td>Nichiryo CO. Ltd</td><td>00-NPX2-20, 00-NPX2-200, 00-NPX2-1000</td><td>0.5-10 &mu; L, 20-200 &mu; L, 100-1000 &mu; L</td></tr><tr><td>pippetes multicanale</td><td>Nichiryo CO. Ltd</td><td>00-NPM-8VP, 00-NPM-8LP</td><td>0.5-10 &mu; L, 20-200 &mu; L</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>BD Difco</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>BD Difco</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S-5886</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Nakarai tesque</td><td>01162-15</td><td></td></tr><tr><td>rifampicina</td><td>Wako</td><td>185-01003</td><td></td></tr><tr><td>gentamicina</td><td>Wako</td><td>077-02974</td><td></td></tr><tr><td>kanamicina</td><td>Wako</td><td>115-00342</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>AXEL</td><td>3-1491-51</td><td>JPND90-15</td></tr><tr><td>microprovette</td><td>Fukaekasei</td><td>131-815C</td><td></td></tr><tr><td>500 mL pallone monouso</td><td>Corning</td><td>CLS3578</td><td></td></tr></tbody></table>

confronto ad alta risoluzione delle frequenze di coniugazione batterica

High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies

Coniugazione batterica è un passo importante nel trasferimento orizzontale di geni di resistenza agli antibiotici mediante un elemento di DNA coniugativi. Comparazioni approfondite di frequenza di coniugazione in diverse condizioni necessari per comprendere come l'elemento coniugativi si diffonde nella natura. Tuttavia, i metodi convenzionali per il confronto di frequenza di coniugazione non sono appropriati per i confronti approfonditi a causa l'elevato background causata dal verificarsi di eventi di coniugazione aggiuntive sulla piastra selettiva. Abbiamo ridotto con successo lo sfondo con l'introduzione di un metodo numero più probabile di (MPN) e una maggiore concentrazione di antibiotici per prevenire un ulteriore coniugazione in terreno liquido selettivo. Inoltre, abbiamo sviluppato un protocollo per la stima della probabilità di come spesso donatore cellule iniziano coniugazione di ordinamento celle singolo donatore nel destinatario di pool di fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS). Utilizzando due plasmidi, pBP136 e pCAR1, le differenze nella frequenza di coniugazione in Pseudomonas putida cellule potrebbe essere rilevati in terreno liquido a diversi tassi di agitazione. Le frequenze dell'iniziazione di coniugazione erano più alti per pBP136 che per pCAR1. Utilizzando questi risultati, possiamo capire meglio le funzionalità di coniugazione di questi due plasmidi.

Confronto tra frequenza di coniugazione dal metodo MPN
Nel nostro rapporto precedente, abbiamo confrontato le frequenze di coniugazione di pBP136::gfp e pCAR1::gfp in triplice mezzo liquido diluito LB (1/3 LB) con diversi tassi di agitazione dopo 45 min accoppiamento usando 125ml spinner boccette10. Abbiamo confrontato le frequenze di coniugazione di pBP136::gfp e pCAR1::gfp</e...

Con l'obiettivo di comprendere i comportamenti dei vari elementi coniugativi batterici di DNA in condizioni diverse, descriviamo un protocollo per la rilevazione di differenze nella frequenza di coniugazione, con alta risoluzione, per stimare quanto efficientemente il batterio donatore avvia la coniugazione.

Confronto ad alta risoluzione delle frequenze di Coniugazione batterica

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della microbiologia su quanto spesso il DNA plasmide può essere diffuso tra diversi batteri. Il vantaggio principale di questa tecnica è che riducendo lo sfondo, possiamo rilevare piccole differenze nella frequenza di coniugazione con un'alta risoluzione. A dimostrare la procedura sarà Kosuke Yanagiya, uno studente laureato del mio laboratorio.Per calcolare la frequenza di coniugazione in base al numero più probabile, filtrare l'accoppiamento di un millilitro da una coltura del donatore durante la notte con un millilitro da una coltura ricevente durante la notte per 45 minuti a 30 gradi Celsius, come appena dimostrato. Mentre la co-coltura sta incubando, diluire serialmente le colture originali del donatore e del ricevente per placcare in triplice copia sul brodo di Luria donatore, o LB, più kanamicina, o lB ricevente più piastre di gentamicina per una coltura di due giorni a 30 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, resuspendare la coltura sul filtro in LB sterile contenente kanamicina e gentamicina per la diluizione seriale in una piastra di coltura cellulare a 96 po 'in quadruplicata.Dopo due giorni a 30 grad

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Un metodo rapido ed efficace per integrare DNA estraneo di interesse in pre-fatti ceppi accettori, chiamati ceppi pista di atterraggio, è descritta. Il metodo permette integrazione sito-specifica di una cassetta DNA nel locus ingegnerizzato atterraggio di un dato ceppo, tramite coniugazione e l'espressione del ΦC31 integrasi.

Site-specific Ingegneria batterica Cromosoma: ΦC31 integrasi Mediated Cassette Exchange (IMCE)

Fonte: Erdogan, F., et al., Saggi di accoppiamento coniugativo per l'analisi sequenziale specifica delle proteine di trasferimento coinvolte nella coniugazione batterica. J. Vis. Exp. (2017)Questo video mostra la procedura per il trasferimento di un plasmide F da cellule di E. coli donatore a cellule ricevente utilizzando un plasmide di salvataggio e selezionando i transconiuganti attraverso la doppia resistenza agli antibiotici. Il processo include la miscelazione di colture batteriche,...

Trasferimento di plasmidi F e doppia selezione antibiotica in E. coli

Fonte: Chetrit, D., et al. Applicazione di imaging a cellule vive e tomografia crioelettronica per risolvere le caratteristiche spaziotemporali del sistema di secrezione dot/ icm di Legionella pneumophila . J. Vis. Esp. (2020).Questo video mostra la preparazione e l'imaging di batteri patogeni marcati con fluorescenza. I cuscinetti di agarosio vengono prima preparati e posizionati all'interno di una cornice adesiva. Una sospensione di batteri geneticamente modificati che esprimono una proteina...

Preparazione del campione e imaging di batteri marcati con fluorescenza

Qui, presentiamo un protocollo per eliminare un gene di interesse coinvolto nella coniugazione dei plasmidi e successivamente analizzare l'impatto della sua assenza utilizzando saggi di accoppiamento. La funzione del gene viene ulteriormente esplorata in una regione specifica della sua sequenza utilizzando mutazioni di delezione o puntiformi.

Coniugazione saggi di accoppiamento per l&#39;analisi specifica per sequenza di proteine ​​di trasferimento relativi coniugazione batterica

Descriviamo qui tre protocolli diversi per la ricerca in vitro di coniugazione, trasduzione e trasformazione naturale in Staphylococcus aureus.

Metodologia per lo studio del orizzontale Gene Transfer in<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Presentato qui è un metodo semplice per la creazione di una libreria di inserimento ad alta densità trasposone in Escherichia coli o Shigella flexneri mediante coniugazione batterica. Questo protocollo permette la creazione di una collezione di centinaia di migliaia di mutanti unici nei batteri mediante l'inserimento casuale di genomica di un trasposone.

Creazione di una densa trasposone inserimento Biblioteca mediante coniugazione batterica Enterobacterial ceppi come Escherichia Coli e Shigella flexneri

Qui, presentiamo un protocollo che descrive come i) assemblare un vettore auto-replicante utilizzando il toolkit di clonazione modulare CyanoGate, ii) introdurre il vettore in un ospite cianobatterico per coniugazione, e iii) caratterizzano ceppi di cianobatteri transgenici utilizzando un lettore di lamele o citometria di flusso.

Modificazione genetica dei cianobatteri mediante congiugazione utilizzando il toolkit di clonazione modulare CyanoGate

Questo lavoro presenta un metodo di microscopia che consente l'imaging vivo di una singola cellula di Escherichia coli per l'analisi e la quantificazione del comportamento stocastico dei circuiti genetici sintetici.

Misurazione continua del rumore biologico in Escherichia Coli utilizzando la microscopia time-lapse

Questo manoscritto descrive un metodo per utilizzare la microscopia a fluorescenza a singola cellula per visualizzare e quantificare la competizione batterica in cocoltura.

Quantificazione della competizione interbatterica utilizzando l'imaging a fluorescenza a singola cellula

La coniugazione media il trasferimento genico orizzontale mobilitando il DNA plasmidico attraverso due cellule diverse, facilitando la diffusione di geni benefici. Questo lavoro descrive un metodo ampiamente utilizzato per la rilevazione efficiente del trasferimento plasmidico coniugativo, basato sull'uso di marcatori differenziali nel plasmide coniugativo, nel donatore e nel ricevente per rilevare la transconiugazione.

Rilevazione del trasferimento genico orizzontale mediato da plasmidi coniugativi naturali in E. coli

Scopri un metodo ad alta risoluzione per rilevare le differenze nella frequenza di coniugazione batterica. Questa tecnica consente di misurare con precisione l'efficienza dei batteri donatori nell'iniziare il trasferimento di plasmidi.

Confronto ad alta risoluzione delle frequenze di Coniugazione batterica

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