Multimodale Imaging retinico volumetrica da Oblique scansione Laser oftalmoscopia (oSLO) e tomografia a coerenza ottica (OCT)

Qui, presentiamo un protocollo per ottenere un ampio campo visivo (FOV) tridimensionale (3D) fluorescenza e immagine retinica OCT utilizzando una nuova piattaforma di imaging multimodale. Introdurremo l'installazione del sistema, il metodo di allineamento e i protocolli operativi. In vivo imaging sarà dimostrato, e saranno forniti risultati rappresentativi.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'oftalmologia e dell'imaging retinico. Come l'imaging e la quantificazione della rottura della barriera emato-retinica e delle funzioni capillari retiniche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può ottenere un ampio campo visivo, un imaging retinico tridimensionale e multi-contrasto utilizzando un laser a scansione obliqua in un'unica scansione raster.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi della retinopatia diabetica e di altre malattie pre-retiniche. Perché oSLO è in grado di ottenere immagini ad alto contrasto della microvascolarizzazione retinica, fino ai singoli capillari in 3D. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'imaging retinico, può essere applicato anche ad altri sistemi di imaging che utilizzano obiettivi convenzionali.

Come l'imaging in vivo della corteccia del topo. Una sorgente laser super-continuum viene utilizzata come sorgente laser di sistema per l'oftalmoscopia laser a scansione obliqua o configurazione oSLO. La gamma della luce visibile è separata dalla gamma delle lunghezze d'onda più elevate dal primo specchio dicroico.

Lo spettro luminoso viene espanso con una coppia di prismi dispersivi, dopo che il raggio passa attraverso un divisore di fascio di polarizzazione. Una fessura viene utilizzata per selezionare l'intervallo di lunghezze d'onda di eccitazione. E uno specchio riflettente riflette il raggio filtrato verso la coppia di prismi per accoppiare la luce in una fibra monomodale.

Uno spettrometro viene utilizzato per confermare la selezione della lunghezza d'onda all'uscita della fibra monomodale. La fibra monomodale è collegata a due accoppiatori in fibra ottica in cascata. Una delle porte di uscita in fibra del secondo accoppiatore in fibra fornisce la luce al sistema oSLO.

Per collimare il laser nel sistema oSLO, il laser viene deviato da uno specchio galvanometrico. Un sistema di telescopi uno-a-uno trasmette il laser a un secondo specchio galvanometrico, mentre un sistema di telescopi tre a uno trasmette ulteriormente il laser alla pupilla dell'occhio. Uno specchio dicroico all'interno del sistema di telescopi tre a uno riflette i segnali fluorescenti.

Il sistema telescopico tre a uno e lo specchio dicroico sono montati su un cursore a coda di rondine personalizzato per sfalsare l'asse ottico e creare l'illuminazione a scansione obliqua. L'illuminazione obliqua consente l'imaging a fluorescenza volumetrica senza la necessità di effettuare il sezionamento. Spostando il laser, un raggio obliquo viene focalizzato sulla retina e quindi il rilevamento obliquo può catturare un'immagine tomografica a fluorescenza lungo il percorso del raggio obliquo.

Per creare il percorso ottico di imaging a fluorescenza, la fluorescenza viene riflessa dallo specchio dicroico e trasmessa al terzo specchio galvanometrico. La luce fluorescente viene quindi trasmessa a un obiettivo di imaging da un altro sistema telescopico uno-a-uno. Due ulteriori stadi di traslazione sono installati sotto il terzo specchio galvanometrico per fornire ridondanza nei gradi di libertà per l'ottimizzazione dell'immagine.

Il sistema di imaging finale è montato su un tavolino con tre gradi di libertà. Rotazione e due assi di traslazione. Una fotocamera planare viene utilizzata per acquisire le immagini di fluorescenza in sezione trasversale.

Un altro specchio dicroico separa la gamma dell'infrarosso posteriore dalla luce rimanente. Un filtro passa-lungo viene utilizzato per limitare ulteriormente la larghezza di banda da 800 a 900 nanometri. Accoppiare il raggio in una fibra monomodale.

La fibra monomodale è collegata all'altra porta di ingresso dei due accoppiatori in fibra ottica in cascata per combinarsi con l'eccitazione oSLO blu. La luce proveniente dalla seconda porta di uscita del secondo accoppiatore in fibra viene diretta al braccio di riferimento OCT. Che ha piastre di compensazione della dispersione, filtro a densità neutra variabile e uno specchio riflettente.

Il ritorno di luce dal braccio di riferimento e dall'occhio si ricombina al secondo accoppiatore in fibra ottica e viene inviato allo spettrometro OCT per raccogliere il segnale. Utilizza un software per il sistema di acquisizione dati scritto in Labview e modificato dal protocollo di scansione OCTA. Per ogni b-scan, un ciclo di lavoro dell'80% a dente di sega con 500 passi viene emesso da una scheda di uscita analogica per controllare lo specchio a scansione rapida x-prime.

Attivare la telecamera a scansione lineare ad ogni passaggio per acquisire i dati per l'OCT, solo quando lo specchio si trova nella direzione di scansione in avanti. Impostare il tempo di esposizione per la fotocamera a scansione lineare su 17 microsecondi. Per acquisire il segnale OCTA, ripetere la misurazione cinque volte nella stessa posizione b-scan.

Impostare la velocità di uscita AO a 100 kHz e la velocità della linea A OCT a 50 kHz. Controlla lo specchio a scansione lenta y-prime, GM1, con una forma d'onda in rampa. Sincronizzare lo specchio di descansione, GM3, con GM1 per eseguire la scansione lenta.

Attiva la telecamera planare tramite un'altra scheda di uscita analogica per acquisire un'immagine fluorescente in ogni posizione y-prime. Ritagliare le dimensioni dell'immagine o eliminare i pixel adiacenti per aumentare la velocità e la sensibilità come desiderato. Iniziare confermando un livello appropriato di anestesia nel ratto dalla mancanza di un riflesso di ritiro durante un pizzico intradigitale.

Dopo l'induzione dell'anestesia, posizionare il ratto su un supporto. Montare un cono nasale per mantenere l'anestesia durante il resto dell'esperimento. Applicare 5 soluzioni oftalmiche di tetracaina cloridrato sull'occhio del ratto per l'anestesia locale.

Quindi dilatare la pupilla con una soluzione oftalmica di tropicamide all'1%. Dopo due minuti di dilatazione, utilizzare una siringa da un millilitro e un ago calibro 29 per iniettare il 10% di fluoresceina o il 10% di FITC diluito in soluzione fisiologica attraverso la vena caudale. Quindi accendere la sorgente laser e posizionare un filtro a densità neutra per attenuare l'eccitazione della luce blu durante l'allineamento.

Misurare la potenza della luce blu, assicurandosi che sia inferiore a 10 microwatt. Quindi passare alla luce per tomografia a coerenza ottica, assicurandosi che sia vicina a 8 milliwatt. Accendere l'alimentazione allo specchio galvanometrico, che viene utilizzato per controllare la direzione del laser.

Regola l'altezza del bulbo oculare per creare uno spot laser fisso sulla cornea. Regolare la posizione dell'occhio per rendere il bordo della pupilla approssimativamente perpendicolare al laser. E scostare il laser a circa 1,5 millimetri dal centro apicale dell'occhio.

Regolare ulteriormente il supporto per animali fino a quando le immagini della tomografia a coerenza ottica non raggiungono una qualità ottimale. Nella direzione di scansione rapida x-prime, assicurarsi che l'immagine b-scan della sezione trasversale appaia piatta. Quando si passa alla direzione di scansione lenta y-prime, assicurarsi che l'immagine b-scan della sezione trasversale appaia inclinata a causa della scansione obliqua.

Rimuovere il filtro a densità neutra per l'eccitazione della luce blu. E monitora il feed in tempo reale dalla telecamera. Dovrebbe apparire un'immagine fluorescente in sezione trasversale che mostra i vasi sanguigni a diverse profondità.

Regolare la messa a fuoco del sistema di imaging a fluorescenza finale per raggiungere la messa a fuoco ottimale. Ed eseguire regolazioni fini della posizione dell'occhio sul piano laterale per ottenere una qualità ottimale dell'immagine dell'oftalmoscopia laser a scansione obliqua. Dopo l'allineamento, iniziare ad acquisire simultaneamente l'angiografia con tomografia a coerenza ottica e l'angiografia volumetrica con fluoresceina.

Questa immagine mostra un'immagine di tomografia a coerenza ottica in sezione trasversale di una retina di ratto. Si tratta di un'angiografia con tomografia a coerenza ottica, o immagine OCTA, della stessa regione. E un'oftalmoscopia laser a scansione obliqua e un'angiografia con fluoresceina volumetrica con immagini in sezione trasversale o oSLO-VFA.

Analogo alla tomografia a coerenza ottica b-scan. Rispetto all'OCTA, l'oftalmoscopia laser a scansione obliqua e l'immagine in sezione trasversale dell'angiografia volumetrica con fluoresceina identificano chiaramente i capillari nello strato plessiforme esterno. Lo strato superficiale della retina è mostrato qui in un'immagine OCTA.

Nell'immagine sono visibili artefatti sotto forma di strisce verticali. oSLO-VFA evita gli artefatti di movimento utilizzando il contrasto di emissione di fluorescenza. All'interno dello strato intermedio retinico, i vasi che si immergono verticalmente sono chiaramente mostrati nell'immagine oSLO FA.

Ma non è evidente in OCTA. Durante il tentativo di questa procedura, è importante evitare l'esposizione continua del laser all'occhio per più di due minuti. Evitare l'essiccazione della cornea e lasciare che l'occhio riposi almeno 30 secondi tra le sezioni di imaging bloccando la luce.

Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'imaging di topi geneticamente modificati per esprimere proteine di fluorescenza per rispondere a ulteriori domande. Come il modo in cui specifici tipi di cellule retiniche possono cambiare e le variabili osservate nel passato con malattie note.