Name: Il metodo Set di Replica: Un approccio High-throughput per quantitativamente misura Caenorhabditis elegans durata della vita (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Scopri il metodo Replica Set per misurare la durata della vita e lo stato di salute in Caenorhabditis elegans con screening ad alto rendimento. Questa tecnica consente analisi quantitative simultanee di oltre 100 condizioni genetiche.

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Finanziamenti per questo lavoro descritto in questo manoscritto è stato fornito da: l'ufficio università di Rochester di The Provost e la scuola di medicina e odontoiatria decanato di tramite il centro di Scienze di salute per l'innovazione computazionale (HSCCI); Ellison Medical Foundation nuovi studiosi in Aging Fellowship (AG-NS-0681-10) i finanziatori non aveva alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto.

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<li>Anderson, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+lifespan+extension+by+osmotic+stress+requires+FUdR%2C+base+excision+repair%2C+FOXO%2C+and+sirtuins%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+ageing+and+development%22%5BJournal%5D)">C. elegans lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins.</a> Mechanisms of ageing and development. , 30-42 (2016).</li>
<li>Garigan, D., Hsu, A. L., Fraser, A. G., Kamath, R. S., Abringet, J., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans%3A+A+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Entrambi i metodi tradizionali e replica set richiedono la sincronizzazione degli animali invecchiati in ordine cronologico. Includiamo un metodo che consente di sincronizzare gli animali utilizzando trattamento ipoclorito di gravid adulti, dove solo le uova fecondate con l'adulto gravid sopravvivono al trattamento. Questi embrioni schiudono in sospensione liquida e arrestano inerente allo sviluppo nella prima fase larvale (L1). Dopo la semina L1 animali sul cibo (ad esempio e. coli che esprimono dsRNA ...

Uno del maggior parte di trasformazione avanzamenti tecnologici verso la comprensione delle basi genetiche di invecchiamento è stato lo sviluppo di alimentazione-basata di RNAi nei elegans del c.1; prima l'uso sperimentale di RNAi, molti fenotipi di invecchiamento non erano geneticamente trattabili. Alimentazione-basata RNAi è raggiunto attraverso la produzione di dsRNA all'interno di e. coli che corrisponde a un endogeno mRNA di c. elegans : IPTG induce la trascrizione di bidirezionale attraverso un inserto di cDNA di c. elegans sia o una porzione di un telaio di lettura aperto all'interno di un plasmide2. Quando c. elegans nutrirsi intatto dsRNA di e. coli, prodotta dai batteri è trasportato dal lume intestinale cellule tramite la proteina transmembrana di SID-23e poi distribuito attraverso il resto dell'animale tramite SID-14. All'interno di ogni cella, dsRNA esogeno viene elaborato dalla cubettatrice complessa in siRNA, che interagiscono con un mRNA maturo tramite appaiamento complementare per creare un nuovo duplex siRNA-mRNA. Questo duplex è riconosciuto dal complesso RISC e spaccato, quindi degradare l' mRNA endogena5. Così, semplicemente cambiando l'inserto di plasmide, uno può inattivare la funzione di quasi qualsiasi gene all'interno del genoma di c. elegans . Questa scoperta ha portata alla creazione di più grande alimentazione-basata RNAi trasformato librerie-collezioni di stock di e. coli che possono essere combinati per ottenere una copertura di circa l'86% del noto di c. elegans geni6, 7.
Dall'avanzamento della RNAi basate su alimentazione, schermi completi in c. elegans hanno portato alla scoperta di più di 900 geni che alterano la durata quando inattivato (come testimoniano le associazioni di RNAi-fenotipo curate in WormBase), cui ci riferiamo a come gerogenes. Un ruolo per la maggior parte dei gerogenes nel controllo di longevità è stata scoperta attraverso alimentazione-basata di RNAi nei pochi rapporti seminale (Vedi Figura 1A e 1 File supplementare per i dettagli). In alcuni casi, questi gerogenes sono stati identificati basato su misura la redditività in un singolo o pochi punti di tempo, che non riesce a fornire una misura quantificabile del cambiamento nella durata della vita con trattamento RNAi. In altri casi, questi geni sono stati valutati quantitativamente per cambiamenti nella durata della vita, come pure altri fenotipi età-collegato. Per esempio, precedentemente abbiamo identificato 159 geni che erano necessarie per normale e una maggiore durata della vita degli animali con la segnalazione dell'insulina/IGF-1 in diminuzione e quantificate le modifiche in healthspan. Di questi, 103 inattivazioni gene comportano un fenotipo progeric, di perdita è provocato da uno o più segni di invecchiamento precoce8.
Mentre alcuni gerogenes sono stati associati con 100 o più studi (ad es. daf-16, daf-2, sir-2.1), oltre 400 gerogenes hanno citazioni 10 o meno (Figura 1Be supplementare File 2). Così, mentre completa basata su alimentazione RNAi schermi hanno scoperto e superficialmente caratterizzato centinaia di presunti gerogenes, come questi geni in funzione nel controllo di longevità e le correlazioni genetiche tra questi prodotti genici rimangono scarsamente ha studiato. Analisi completa longitudinale per età-collegata di fenotipi è un prerequisito per l'identificazione di interazioni genetiche tra gerogenes (ad es. interazioni epistatiche, interazioni asintetiche, ecc.). Guadagnando più approfondite le correlazioni genetiche tra gerogenes richiede un metodo quantitativo di alto-rendimento, che sfrutta anche i vantaggi dell'alimentazione basato su RNAi.
La più comune misura di surrogato di invecchiamento è durata della vita. L'approccio tradizionale per misurare la mortalità di c. elegans traccia le morti degli animali individuali nel tempo all'interno di un campione di popolazione piccola. Un numero relativamente piccolo di animali è seguito nel tempo e periodicamente è spronato delicatamente con un filo di platino o ciglia, con movimento come un indicatore della redditività (Figura 2A). Questo metodo è stato ampiamente utilizzato, in quanto fornisce misurazioni semplici, diretti della media e la massima durata. Tuttavia, questo metodo tradizionale è che richiede tempo e relativamente basso-velocità di trasmissione, che limita il numero di animali e condizioni che possono essere misurate simultaneamente in modo controllato. Un recente studio di simulazione trovato che molti studi di durata della vita di c. elegans non analisi di un numero sufficiente di animali per essere in grado di rilevare in modo affidabile piccole modifiche tra circostanze9. Inoltre, questo metodo tradizionale comporta la manipolazione ripetutamente la stessa coorte degli animali nel corso del tempo, che a sua volta può introdurre contaminazione e possono danneggiare o uccidere animali sempre più fragili, invecchiati.
Abbiamo sviluppato una metodologia alternativa "Replica Set" per misurare la durata della vita di c. elegans . A tal fine, una grande popolazione di età-sincronizzato, isogeniche animali sono divisi in una serie di piccole popolazioni (o repliche). Numero sufficiente di campioni replica vengono generati per coprire ogni punto del tempo nell'esperimento pianificato. In ogni punto del tempo di osservazione, una delle repliche è segnata per il numero di morti viventi e animali censurati, poi gli animali all'interno di replicati vengono scartati. Così, oltre la durata prevista della popolazione nel suo complesso, una serie di sottopopolazioni indipendenti sono periodicamente campionate (Figura 2B). Utilizzando il set di repliche non c'è nessun incitamento ripetute degli animali e senza l'esposizione ripetuta a potenziale contaminazione ambientale. L'attuabilità osservato al punto una tantum è completamente indipendente da ogni altra osservazione, che riduce al minimo la gestione e aumenta la velocità effettiva di almeno un ordine di grandezza. Questo ci ha permesso di quantificare i cambiamenti nella durata della vita per centinaia di RNAi cloni contemporaneamente8,10.
Qui presentiamo protocolli dettagliati per lo svolgimento di durata della vita di c. elegans via del Set di repliche e metodi tradizionali per la segnatura di c. elegans longevità. Dimostriamo che si ottengono risultati simili tra i metodi. Abbiamo sviluppato software per facilitare l'analisi grafica dei dati di durata della vita generati attraverso entrambi gli approcci, che forniamo liberamente sotto una licenza GPL V3 (Vedi tabella materiali). "WormLife" è scritto in R11e include un'interfaccia utente grafica (GUI) per la rappresentazione dei dati, che sono stati testati in Mac OS e Linux. Infine, confrontiamo e le limitazioni di ciascun metodo di contrasto ed evidenziare altre considerazioni quando si sceglie tra gli approcci per misurare variazioni quantitative nella durata della vita di c. elegans .

<table><tbody><tr><td>IPTG (isopropil beta-D-1-tigalattopiranoside)</td><td>Gold Bio</td><td>12481C100</td><td></td></tr><tr><td>FuDR (5-Fluoro-2'-deossiuridina)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L16497</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di coltura a 24 pozzetti</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#662102</td><td></td></tr><tr><td>Piastra retangulare a pozzetto singolo non trattata, 128x86mm</td><td>Thermo-Fisher</td><td>242811</td><td></td></tr><tr><td>600 &; Piastre L a 96 pozzetti</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#786261</td><td></td></tr><tr><td>2mL Piastre a 96 pozzetti</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#780286</td><td></td></tr><tr><td>Guarnizione per piastre permeabile all'aria</td><td>VWR</td><td>60941-086</td><td></td></tr><tr><td>Replicatore di piastre a 96 pin</td><td>Nunc</td><td>250520</td><td></td></tr><tr><td>bacto-peptone</td><td>VWR</td><td>90000-368</td><td></td></tr><tr><td>agar batteriologico</td><td>Affymetrix/USB</td><td>10906</td><td></td></tr><tr><td>Libreria di cloni RNAi di C. elegans nei batteri HT115- Ahringer</td><td>Source Bioscience Collezione</td><td>di RNAi di C. elegans (Ahringer)</td><td>Vedi anche Kamath et. al, Nature 2003.</td></tr><tr><td>Libreria di cloni RNAi di C. elegans nei batteri HT115- Vidal</td><td>Source Bioscience C</td><td>. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)</td><td>Vedi anche Rual et. al, Genome Research 2004. Questa libreria è disponibile anche da Dharmacon.</td></tr><tr><td>WormLife- Software per l'analisi della sopravvivenza del set di repliche</td><td>Samuelson Lab</td><td>N/A</td><td>https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife</td></tr><tr><td>L4440 Plasmide vettoriale vuoto</td><td>Addgene</td><td>1654</td><td>https://www.addgene.org/1654/</td></tr> <tr><td>Wormbase</td><td></td><td></td><td>http://www.wormbase.org/&nbsp;</td></tr><tr><td>OASIS</td><td></td><td></td><td>https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/&nbsp;</td></tr><tr><td>Graphpad Prisma</td><td></td><td></td><td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/&nbsp;</td></tr></tbody></table>

il metodo set di replica: un approccio high-throughput per quantitativamente misura caenorhabditis elegans durata della vita

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Il metodo del Set di repliche è un approccio per misurare quantitativamente la durata della vita o la sopravvivenza di Caenorhabditis elegans nematodi in un modo ad alta velocità, permettendo così un singolo investigatore per ulteriori trattamenti o condizioni schermo sopra la stessa quantità di tempo senza perdita di qualità dei dati. Il metodo richiede attrezzature comuni che si trovano nella maggior parte dei laboratori che lavorano con c. elegans , è così semplice da adottare. L'approccio incentrato su analizzando campioni indipendenti di una popolazione in ogni punto di osservazione, piuttosto che un singolo campione nel corso del tempo come con i metodi tradizionali longitudinali. Segnando comporta l'aggiunta di liquido nei pozzetti di una piastra multi-pozzetto, che stimola la c. elegans per spostare e facilita quantificare cambiamenti in healthspan. Altri vantaggi principali del metodo del Set di repliche includono ridotta esposizione delle superfici di agar da contaminanti trasportati dall'aria (ad es. muffe o funghi), minima manipolazione degli animali e robustezza al sporadici mis-gol (come chiamare un animale morto, quando è ancora vivo). Per adeguatamente analizzare e visualizzare i dati da un esperimento di stile del Set di repliche, uno strumento software personalizzato è stato anche sviluppato. Capacità attuale del software includono tracciare delle curve di sopravvivenza per sia del Set di repliche e tradizionale (Kaplan-Meier) esperimenti, nonché analisi statistiche per Set di repliche. I protocolli forniti qui descrivono il tradizionale approccio sperimentale e il metodo del Set di repliche, come pure una panoramica dell'analisi di dati corrispondente.

Nello sviluppo di qualsiasi nuova metodologia, è imperativo che il nuovo metodo ricapitola i risultati accettati da precedenti approcci e soddisfa lo standard all'interno di un campo. Abbiamo precedentemente dimostrato empiricamente che il Set di repliche e metodi tradizionali per diluire la durata della vita di c. elegans producano simili risultati20. Selvaggio-tipo di c. elegans (N2) mantenuta a 20 ° C in genere vivono tra 20 e 25 giorni, che ab...

Qui descriviamo il metodo del Set di repliche, un approccio misurare quantitativamente elegans del c. durata della vita/sopravvivenza e healthspan in un modo ad alta velocità e robusto, permettendo così lo screening di molte condizioni senza sacrificare la qualità dei dati. Questo protocollo dettagli la strategia e fornisce uno strumento software per l'analisi dei dati del Set di repliche.

Il metodo Set di Replica: Un approccio High-throughput per quantitativamente misura Caenorhabditis elegans durata della vita

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

Sono stati identificati centinaia di geni la cui funzione influenza l'invecchiamento di un organismo. Ma molte delle loro relazioni sono poco comprese. Questo metodo può aiutare a rispondere a una domanda chiave nel campo dell'invecchiamento.Vale a dire, quali sono le interrelazioni genetiche tra i geni gerA? Il vantaggio principale di questa tecnica è un aumento della produttività, il numero di predibattiti genetici che possono essere misurati quantitativamente contemporaneamente è aumentato di almeno un ordine di grandezza. I dati sulla durata della vita, raccolti con questa procedura, possono essere tracciati e analizzati utilizzando il software fornito con questa pubblicazione.Oltre a fornire informazioni sulla durata della vita, questo metodo può essere applicato anche ad altri fenotipi legati all'età, come la resistenza allo stress e i cambiamenti nel piano sanitario. Per questa procedura, creare un nuovo timbro della sottolibreria RNAi. Innanzitutto, aliquotare ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, con 200 microlitri di LB con ampicillina, utilizzando un pipettatore a 12 canali.Sterilizzare un replicatore di piastre a 96 pin immergendo in sequenza i pin in candeggina a

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Qui, presentiamo un quadro per correlare la restrizione dietetica di ampio spettro di espressione genica e la durata della vita. Descriviamo i protocolli per la restrizione dietetica di ampio spettro e imaging quantitativo di espressione genica in questo paradigma. Abbiamo ulteriormente delineare analisi computazionali per rivelare alla base di funzionalità di elaborazione di informazioni dei circuiti genetici coinvolti nel rilevamento di cibo.

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Un metodo semplice per High Throughput Screening chimico in Caenorhabditis Elegans

Il declino proteostatico è un segno distintivo dell'invecchiamento, facilitando l'insorgenza di malattie neurodegenerative. Delineiamo un protocollo per misurare in modo quantificabile la proteostasi in due diversi tessuti di Caenorhabditis elegans attraverso l'espressione eterologa di ripetizioni di poliglutamina fuse a un reporter fluorescente. Questo modello consente una rapida analisi genetica in vivo della proteostasi.

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Caenorhabditis elegans funge da eccellente sistema modello con metodi robusti e a basso costo per il rilevamento della durata della salute, della durata della vita e della resilienza allo stress.

Rilevamento di metodi a basso costo per misurare la durata della vita e la durata della salute in Caenorhabditis elegans

La piattaforma di imaging "The Lifespan Machine" automatizza l'osservazione permanente di grandi popolazioni. Mostriamo i passaggi necessari per eseguire saggi sulla durata della vita, sulla resistenza allo stress, sulla patogenesi e sull'invecchiamento comportamentale. La qualità e la portata dei dati consentono ai ricercatori di studiare gli interventi sull'invecchiamento nonostante la presenza di variazioni biologiche e ambientali.

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Questo protocollo descrive un test per quantificare la velocità di alimentazione di Caenorhabditis elegans basato sulla misurazione della clearance dei batteri in coltura liquida.

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Questo protocollo fornisce una procedura semplice e a basso costo per quantificare il tasso di letalità embrionale in Caenorhabditis elegans. Consente una semplice rilevazione di anomalie embrionali tra le popolazioni senza attrezzature specializzate o competenze nel picking di vermi. Il protocollo può essere utilizzato per quantificare gli effetti delle mutazioni genetiche, delle eliminazioni genetiche mediate dall'interferenza dell'RNA e della dieta.

Quantificazione del tasso di letalità embrionale in Caenorhabditis elegans

Scopri il metodo Replica Set per misurare la durata della vita e lo stato di salute in Caenorhabditis elegans con screening ad alto rendimento. Questa tecnica consente analisi quantitative simultanee di oltre 100 condizioni genetiche.

Il metodo Set di Replica: Un approccio High-throughput per quantitativamente misura Caenorhabditis elegans durata della vita

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