Il metodo Set di Replica: Un approccio High-throughput per quantitativamente misura Caenorhabditis elegans durata della vita

Sono stati identificati centinaia di geni la cui funzione influenza l'invecchiamento di un organismo. Ma molte delle loro relazioni sono poco comprese. Questo metodo può aiutare a rispondere a una domanda chiave nel campo dell'invecchiamento.

Vale a dire, quali sono le interrelazioni genetiche tra i geni gerA? Il vantaggio principale di questa tecnica è un aumento della produttività, il numero di predibattiti genetici che possono essere misurati quantitativamente contemporaneamente è aumentato di almeno un ordine di grandezza. I dati sulla durata della vita, raccolti con questa procedura, possono essere tracciati e analizzati utilizzando il software fornito con questa pubblicazione.

Oltre a fornire informazioni sulla durata della vita, questo metodo può essere applicato anche ad altri fenotipi legati all'età, come la resistenza allo stress e i cambiamenti nel piano sanitario. Per questa procedura, creare un nuovo timbro della sottolibreria RNAi. Innanzitutto, aliquotare ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, con 200 microlitri di LB con ampicillina, utilizzando un pipettatore a 12 canali.

Sterilizzare un replicatore di piastre a 96 pin immergendo in sequenza i pin in candeggina al 50% seguita da acqua ultra pura. Quindi immergere le punte nell'etanolo e fiammeggiare con cura le punte. Quindi, rimuovere con cautela il coperchio della pellicola adesiva di una piastra da libreria congelata a 96 pozzetti di glicerolo e macinare delicatamente ma con decisione le punte del replicatore di piastre sterilizzate nei pozzetti delle scorte di glicerolo ancora congelate.

Quindi inoculare le colture e sigillare la piastra inoculata con la membrana permeabile. Lasciare che le colture crescano durante la notte sul piano di lavoro. Il giorno successivo, sterilizzare il replicatore di piastre, rimuovere con cura il sigillo dalla coltura notturna e immergere le punte dei perni del replicatore.

Quindi, inoculare una piastra rettangolare di ampicillina LB e tetraciclina agar con i perni. Applicare una pressione uniforme e utilizzare un piccolo movimento circolare per trasferire i batteri senza lasciare che le macchie diventino troppo affollate. Quindi, incubare le piastre per una notte a 37 gradi Celsius.

Il giorno successivo, per ogni 10 piastre di replica necessarie, caricare ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con pozzetti profondi con 1,5 millilitri di LB con ampicillina. Quindi, inoculare i pozzetti con i batteri coltivati. Quindi, sigillare la piastra con una membrana traspirante, coltivarla per 20 ore agitandola.

I pozzetti di controllo dovrebbero essere sparsi nei 96 pozzetti, in modo tale che quando la piastra della sottolibreria da 96 pozzetti è divisa in gruppi di 24, ogni divisione di 24 pozzetti ha uno di ciascuno dei controlli. Il giorno seguente, caricare 120 aliquote da microlitro della coltura sulle piastre da 24 pozzetti, utilizzando una pipetta multicanale a sei pozzetti, con spaziatura dei puntali regolabile. Quindi, asciugare le piastre scoperte in una cappa a flusso laminare fino a quando tutto il liquido non è stato assorbito.

Non lasciarli asciugare eccessivamente. Assicurati di mantenere la concentrazione quando aliquoti le colture liquide, per assicurarti che la coltura batterica corretta venga inserita nel pozzetto appropriato nella piastra a 24 pozzetti. Gli esperimenti del set di repliche iniziano con il set di piastre replicate indipendenti a 24 pozzetti, ciascuna seminata con gli stessi cloni RNAi di batteri.

Per gli esperimenti sulla durata della vita, da 15 a 20 animali L1 vengono aggiunti a ciascun pozzetto della piastra e lasciati crescere fino allo stadio L4. A L4, FUdR viene aggiunto a tutti i pozzetti attraverso le repliche. Più tardi nello stesso giorno, una replica della targa può essere presa dal set e segnata come primo punto di tempo.

Per segnare la durata della vita, il liquido viene aggiunto ai pozzetti della piastra per indurre il movimento dell'animale. Gli animali che non iniziano a muoversi vengono pungolati delicatamente con un piccone di vermi. Viene quindi registrato il numero totale di animali e il numero di animali morti.

La lastra della prima osservazione viene quindi scartata. Al successivo punto temporale di osservazione, un'altra piastra replicata viene prelevata dal set e valutata in modo simile. Questa operazione viene ripetuta all'intervallo di punteggio determinato.

Ogni volta con una nuova piastra dal set di replica. Continua a segnare una serie di piastre fino a quando non rimangono più animali in vita. In primo luogo, sincronizzare una popolazione di animali con lo stesso metodo di preparazione a base di candeggina utilizzato per il tradizionale saggio della durata della vita.

Quindi, utilizzando una pipetta a spaziatura regolabile a sei pozzetti e un serbatoio di reagenti, seminare da 15 a 20 animali L1 in ciascun pozzetto delle piastre da 24 pozzetti preparate. Durante la semina delle piastre, mescolare periodicamente gli animali L1 in soluzione per mantenere una distribuzione uniforme. Ora, lascia che gli animali si sviluppino fino a L4. Per questo protocollo è necessario conoscere i tempi di sviluppo di L4.

Monitorare periodicamente lo sviluppo dei vermi. Quando gli animali raggiungono L4, aggiungere 24 microlitri di FUdR 50x a ciascun pozzetto e rimettere le piastre nell'incubatrice. L'uso di animali L4 è fondamentale.

Se gli ermafroditi raggiungono la maturità riproduttiva prima di aggiungere FUdR, la loro progenie sopravviverà e mangerà il cibo. Al contrario, l'aggiunta di FUdR troppo presto porta a animali rotti. Nei punti temporali desiderati, usa una piastra replicata per segnare la vitalità.

Per fare ciò, allagare il pozzo con la soluzione M9. Prima di valutare la vitalità ogni giorno, rilevare tutti i pozzetti che non hanno cibo, sembrano contaminati o hanno animali con difetti morfologici o di sviluppo. Per ogni pozzo, registrare il totale degli animali per pozzetto e controllare lo stato dei vermi fermi, toccandoli delicatamente sulla testa con un piccone.

Dopo aver contato tutti i morti fermi in una piastra, scartare la piastra. Per questa procedura, crescere trasformato e. Coli durante la notte in LB con ampicillina.

Il giorno successivo, concentrare i batteri mediante centrifugazione a 3.000 g per 15-20 minuti. Risospendere i batteri in 1/10 del volume iniziale. Quindi, aliquotare 200 microlitri dei 10 batteri su piastre di sei centimetri.

Preparare tre o quattro piastre per ogni condizione di prova e includere due piastre extra in caso di contaminazione. Asciugare le piastre in un lotto a flusso laminare, fino a quando tutto il liquido è stato assorbito o evaporato. Una volta essiccate, conservare le piastre in una scatola di plastica per una notte a temperatura ambiente per indurre la produzione di RNA a doppio filamento.

Quindi, conservare le piastre per un massimo di due settimane a quattro gradi Celsius. Per gli animali, raccogli animali adulti gravidi in M9. Lavateli due volte con M9. Ripetere la rotazione all'aspirazione. Quindi, risospendere C.elegans in quattro millilitri di M9 e aggiungere due millilitri di soluzione di ipoclorito.

Ora, agitare immediatamente i vermi per tre minuti, agitando periodicamente e vigorosamente. Quindi, al microscopio da dissezione, cerca una nuvola di uova. Se la nuvola non viene vista, fai vorticare i vermi per altri 10-20 secondi.

Quindi, lava rapidamente le uova con M9, due volte, come prima. E risospendere le uova lavate in tre millilitri M9. Quindi, trasferisci le uova in una nuova provetta da 15 millilitri e incuba la provetta a 20 gradi Celsius con una rotazione delicata e lascia che gli embrioni si schiudano durante la notte. Il giorno successivo, determinare la densità della soluzione di L1 preparata calcolando il numero medio di L1 per microlitro in tre gocce da 10 microlitri.

Caricare le piastre preparate con semi di batteri con 50 animali L1, ciascuna. Posizionare le piastre in un'incubatrice a 20 gradi Celsuis, fino a quando gli embrioni non si sviluppano fino allo stadio L4. Il normale sviluppo da L1 a L4 dura circa 40 ore.

Quindi, per prevenire la produzione di progenie, aggiungere 160 microlitri di FUdR 50x a ciascuna piastra. Quindi rimuovi i maschi, poiché la durata della vita è tipicamente misurata solo con gli ermafroditi. Una volta completate, reimballare le piastre nell'incubatore a 20 gradi Celsuis.

Fino a quando tutti i vermi non saranno morti, segna la loro vitalità su base giornaliera. Per fare ciò, tocca delicatamente ogni nematode non in movimento sulla testa con un filo di platino o un ciglio. Gli animali non reattivi sono morti e devono essere rimossi dalla targa.

Prendi nota di eventuali anomalie durante questa routine. Il set di repliche e i metodi tradizionali per valutare la durata della vita di C. elegans producono risultati simili con animali N2 wild-type. Ad esempio, il knockdown dell'RNAi basato sull'alimentazione di mml-1 o mxl-2 ha ridotto significativamente la durata della vita normale.

Questo è stato misurato sia con un test tradizionale della durata della vita, sia con il test del set di repliche. È possibile rilevare anche una maggiore longevità. Visto qui, l'RNAi per mdl-1 o mxl-1 ha aumentato significativamente la durata della vita di C.Elegans quando misurato con entrambe le metodologie.

Utilizzando il metodo del replica set, è possibile quantificare simultaneamente i cambiamenti nella durata della vita in più di 100 condizioni, cosa che non sarebbe ragionevole con un approccio più tradizionale. Ad esempio, uno screening RNAi basato sull'alimentazione dell'intero genoma ha identificato 159 geni necessari per l'aumento della durata della vita conferito dalla diminuzione della segnalazione insulino-simile al daf-2. La relazione tra la segnalazione insulino-simile e questi geni è stata ulteriormente descritta misurando la durata della salute degli animali.

La salute è stata indicata dal dimenarsi di c. Elegans quando sospeso in soluzione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare l'RNAi basato sull'alimentazione per misurare la durata della vita di C.Elegans.

Ma l'RNAi è versatile e può essere applicato per molti fenotipi diversi. Una volta padroneggiato, il metodo del set di repliche consente di valutare la durata di oltre 100 cloni di RNAi al giorno, se eseguito correttamente. I punti di tempo anticipato e tardivo possono essere segnati rapidamente.

Tutti gli animali in un pozzo saranno vivi e in movimento, o morti. Il punteggio richiede più tempo quando gli animali iniziano a morire. Scaglionare l'organizzazione di studi indipendenti con questo in mente.