Name: Il Barnacle Balanus BalanUs come modello Marine - coltura e lespressione genica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Scopri il metodo di coltura per Balanus improvisus per studi di osmoregolazione e biofouling. Questa tecnica consente la produzione continua di larve e l'analisi dell'espressione genica in biologia marina.

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Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzione 2017-04559 il Consiglio svedese per la ricerca (VR) e il progetto supportato UE lungomare a Anders Blomberg. In particolare, l'istituzione del fondo coltura è, nel corso degli anni, stata sostenuta da sovvenzioni a Per R. Jonsson dalle seguenti agenzie di finanziamento: SSF (Fondazione svedese per la ricerca strategica) attraverso il programma Marine Science and Technology e MISTRA attraverso il programma Marine Paint. Kent Berntsson è stato determinante nelle prime fasi di impostazione del culturingfacility. Ulteriori finanziamenti per stabilire la struttura di coltura è giunto dal centro per biologia evolutiva (www.cemeb.science.gu.se), che è sostenuta da una sovvenzione Linnaeus la svedese ricerca consigli FORMAS e VR.

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Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

La cultura di barnacle presso Tjärnö Marine Research Laboratory (Svezia) è stato in esecuzione più di 20 anni ed è stata utilizzata per studi in molti settori di ricerca diversi. Oltre 30 articoli scientifici sono stati pubblicati che hanno utilizzato il sistema di coltura negli ultimi anni, compreso gli studi in antivegetativa13,22, idrodinamica23, ecologia chimica24, cambiamenti climatici16 , biologia evolutiva5e biologia molecolare2.
Per evitare la selezione di alcuni individui che sono più adattate all'ambiente di laboratorio (individui che potrebbero non essere rappresentativi della popolazione selvatica), si consiglia di raccogliere un nuovo riproduttori dal campo ogni anno. Inoltre, è anche consigliabile per ringiovanire la cultura annualmente, dal momento che vi è circa 50-80% di mortalità in adulti durante un anno normale. Tuttavia, se l'obiettivo è di produrre linee inbred o impostare studi di evoluzione sperimentale, allevati in laboratorio solo le famiglie devono essere utilizzati.
Un buon momento per raccogliere BalanUs b. sui pannelli al Tjärnö Marine Research Laboratory è in giugno – agosto perché in quel momento, c'è una buona fornitura di cyprid larve nel mare. Controllare i pannelli settimanale per vedere quando inizia l'insediamento barnacle e rimuovere manualmente altri si stabilirono specie di BalanUs b. (ad es., cozze, tunicati, briozoi, idrozoi, nemerteans/qualche spirografo e altre specie di barnacle) dalla pannelli (ad esempio, con uno spazzolino da denti). Intorno Tjärnö, ci sono tre specie di acque poco profonde barnacle presenti (BalanUs b., Semibalanus balanoidese Balanus crenatus). Tuttavia, b. BalanUs è la dominante malvagie di superfici lisce dure nel mese di luglio – agosto. S. balanoides ha il suo periodo di insediamento nel corso della primavera e preferisce soprattutto i substrati naturali (ad es., pietre). B. crenatus può verificarsi ai numeri bassi sui pannelli durante l'estate.
È anche possibile avviare nuove generazioni di adulti barnacle da cyprids coltivate, che sarebbe essenziale se determinate linages con tratti specifici sono stati stabiliti, o negli studi di evoluzione sperimentale. Il modo più conveniente per iniziare nuove generazioni di adulti è da pagare cyprids in pannelli termoplastici in laboratorio. Questi pannelli con cyprids recentemente depositato potrebbero essere utilizzati anche in trattamenti sperimentali o per l'esposizione nel campo. In caso di emergenza, si possono usare anche gli adulti su massi da un sito nelle vicinanze (ad es., Idefjorden nel caso la Tjärnö Marine Research Laboratory) dove b. BalanUs è comune. Questi adulti già affermati sono trattati nello stesso modo degli adulti sui pannelli, essendo così disponendi in vassoi e alimentati tramite il flusso-attraverso il sistema. Celle di flusso consente anche di stabilire pannelli con barnacles25. Queste sono le camere di flusso continuo con plancton netto sui lati su cui il cyprids non stabiliscano con pannelli come la superficie di stabilimento solo per le larve.
Ci sono diversi passaggi che sono fondamentali per la creazione di una cultura barnacle funzionante a lungo termine, comprese tutte le fasi di vita. I metodi utilizzati per cultura b. BalanUs sono probabilmente, in grande misura, applicabile anche ad altri invertebrati marini con liberamente natante, larve di planktotrophic. Procedure di coltura per alcune specie sono già ben descritte (ad es., per mitili e diverse specie di ostriche)26, mentre per altri invertebrati marini, ci sono solo pochi esempi di colture a lungo termine che attraversa tutta la loro vita ciclo. Uno dei primi tentativi riusciti di barnacles di cultura (B. amphitrite) è stato fatto da Rittschof et al. 15. risorse finanziarie e personali a lungo termine dovrebbero essere a posto prima di considerare un cirripede coltura struttura che istituisce. La manutenzione di questo tipo di anno-nei dintorni di barnacle cultura richiede almeno una metà-orario di lavoro di persona. Ci possono essere alcune potenzialità per il futuro automazione di alcuni passi nella linea di produzione, principalmente alla coltura delle microalghe27. Inoltre, per avere successo, è essenziale avere accesso a grandi quantità di acqua di mare di alta qualità. Alla coltura delle microalghe, Artemia e barnacles non riguarda eventuali procedure particolari di sicurezza. Tuttavia, test di alcuni antivegetativa sostanze o prodotti chimici tossici potrebbe essere necessario precauzioni speciali.
I pannelli sono stati controllati più volte a settimana per le contaminazioni. L'acqua di mare utilizzata nella cultura è stato pompato da una profondità di 40 m nel fiordo Koster fuori dal laboratorio di ricerca Marine Tjärnö e passò attraverso due filtri a sabbia prima di entrare nel sistema di acqua di laboratorio. Se nessun filtro dell'acqua era stato fatto, ci sarebbe molto più contaminazione nella cultura. È essenziale per pulire regolarmente i pannelli nella cultura da detriti e altri invertebrati (ad es., stolone-edificio idroidi e animali predatori) che entrano nel sistema attraverso la fornitura di acqua di mare dal campo. Ad esempio, se non le larve sono prodotte nonostante il fatto che la cultura è stata ben nutriti e altrimenti sembra di essere in buone condizioni, il problema potrebbe essere la presenza di animali che sembrano inibire l'accoppiamento. Naturalmente, molti degli organismi contaminanti nella cultura presso il laboratorio di ricerca Tjärnö Marine erano specifici per la costa occidentale svedese, e altri tipi di contaminanti organismi saranno prevalenti ed essere più di una sfida in altre aree geografiche. Sulla costa occidentale della Svezia, è raro trovare contaminazione di altre specie di barnacle sui pannelli. Occasionalmente, l'istituzione di S. balanoides è stato trovato, ma questo è un problema molto marginale (al massimo, un s. balanoides contaminante per 10.000 campioni di BalanUs b. ). La mancanza di specie contaminanti era molto probabilmente dipenda dal regime di stabilire nuove culture durante l'estate, quando larvaefrom b. BalanUs erano altamente dominante. Inoltre, c'era anche un arricchimento chiaro di b. BalanUs sui pannelli, dal momento che questa specie è selettiva per superfici lisce13.
È essenziale per rimuovere barnacles morto adulto. Se i gusci vuoti vengono lasciati sui pannelli, possono diventare un rifugio per varie specie contaminanti sia naupli di Artemia . Inoltre, è stato notato che gli individui morti influenzano il benessere della vicina individui, probabilmente con il rilascio di composti tossici durante la decomposizione. Un'ulteriore conseguenza di mortalità adulti è che alcuni individui saranno lasciati da solo e troppo lontano da qualsiasi altri adulti per consentire l'accoppiamento (anche se barnacles hanno il pene più lungo del mondo animale rispetto al relativo formato)28. Questi individui sopravviveranno ma sono non-produttiva per le larve. Tuttavia, questi individui adulti solitari delicatamente possono essere rimosso senza danneggiare la piastra di base ed essere disposto orizzontalmente vicini ad altri per consentire l'accoppiamento. Barnacles può anche essere accoppiato inserendo pannelli con un adulto su ciascuno ma abbastanza vicino in modo che la fecondazione incrociata può verificarsi. In questo modo, linee genetiche possono essere prodotta14.
È fondamentale per produrre un feed di alta qualità e per nutrire le colture quasi ogni giorno. Anche un paio di giorni senza cibo può causare un rilascio decrescente delle larve. Test precedenti della composizione della dieta hanno mostrato che le diatomee sono essenziali per la crescita e la sopravvivenza dei naupli di barnacle. Diverse specie della diatomea sembrano adeguate come feed, anche se piccole o solitarie celle (meno di 10 µm di diametro) possono essere necessarie per ingestione di naupli di Artemia. La specie S. marinoi, simplex di c.e T. tricornutum tutti hanno dimostrato di essere un'adeguata alimentazione per naupli di BalanUs b. , oltre che facile da coltivare. Inoltre, la qualità del foraggio è generalmente superiore per alghe che crescono in modo esponenziale. Inoltre è stato segnalato che le diatomee sono essenziali per l'instaurazione delle colture produttive di amphitrite B.15. Una teoria dell'importanza di diatomee è che hanno un profilo unico degli acidi grassi e sono particolarmente ricchi di acidi grassi altamente polinsaturi 20:529. Esso è stato dimostrato che alcuni acidi grassi sono importanti per lo sviluppo positivo di ostrica larve30.
Nel corso degli anni, non ci sono stati nessuna incidenza di malattie dannose nella cultura barnacle. In molti commerciale acquicolture invertebrati marini, come le ostriche e cozze, malattie sono piuttosto comuni e possono essere molto dannosi. Effetti dannosi di virus sono stati segnalati anche da popolazioni selvatiche. L'ostrica nativo in Francia è stato sostituito dall'ostrica portoghese Crassostrea angulata nel 1925, ma questa specie è stata spazzata via da un iridovirus intorno 197031. Più recentemente, ci sono stati eventi di mortalità massiccia in ostrica del Pacifico Crassostrea gigas in culture in tutto il mondo, che sembra essere associato con il ostreid herpesvirus 132. Nessun rapporti su agenti patogeni, batteri o virus su barnacles sono stati pubblicati finora. Tuttavia, nel genoma-progetto in corso su b. BalanUs, sequenze del virus sono stati trovati (Alm Rosenblad et al., dati non pubblicati), ma con nessuna apparente legame ai sintomi di malattie. Miscele di antibiotici in precedenza sono state applicate alle colture per ridurre al minimo il rischio di infezioni batteriche; Tuttavia, questa procedura è attualmente abbandonata e finora, questo non ha causato alcun problema di contaminazione.
Se l'acqua di mare è riscaldata (come descritto sopra), il surriscaldamento può essere il rischio più grave nella linea di produzione di cultura. È, naturalmente, difficile da salvaguardare contro il surriscaldamento, anche se i sensori e sistemi di allarme appropriati possono essere usato (per esempio, l'invio di messaggi e-mail o SMS alle persone responsabili). Incidenza di questo tipo in passato hanno provocato l'uccisione sostanza degli adulti nella cultura. Questo può, naturalmente, essere devastante e rovinare gli investimenti a lungo termine di tempo e denaro. In particolare, questo sarebbe catastrofico se linee «inbred» genetiche sono state stabilite. Per garantire la longevità di tali linee e proteggerli da perdite accidentali, sarebbe auspicabile sviluppare una metodologia di crioconservazione per barnacles. È stato segnalato che le larve da ostrica del Pacifico possono essere congelate giù e rianimate con successo parziale33. Cryobanking è stato anche un prezioso strumento per preservare le risorse genetiche di una vasta gamma di specie34. Anche naupli da B. amphitrite sono segnalati per sopravvivere congelamento35, ed è stato trovato che il 20% degli individui congelato discesa trasformato con successo in cyprids36. Tuttavia, l'applicazione di congelamento per la sostenibilità a lungo termine delle culture finora non è stato adottato, ma questo sarebbe infatti necessario per il mantenimento delle righe selezionate; Questo sarebbe un passo essenziale per stabilire saldamente BalanUs b. in un potente modelsystem marino.
Qui, è stato presentato un protocollo per la dissezione di vari tessuti da adulti di BalanUs b. (cioè, cirri, soma e mensola del camino). Tuttavia, si deve sottolineare che altri tessuti possono anche essere estratte. Per esempio, i tessuti molli tra il mantello esterno e interno delle specie membranosa-base Tetraclita japonica formosana sono stato accuratamente isolato e utilizzato per un'estrazione del RNA e l'analisi di RNA-seq del gene espressione37. Il protocollo di estrazione ottimizzata delineato qui descritto fornisce una quantità sufficiente di RNA di alta qualità per la sequenza da una quantità minima di materiale di partenza. In primo luogo, la raccolta delle larve individuali direttamente nelle provette omogeneizzazione riduce al minimo eventuali perdite durante il trasferimento da una provetta a altra. Inoltre, tra i vari metodi testati, l'omogeneizzazione con integrità, rispetto alla omogeneizzazione di sonicazione o pestello e perle di ceramica ha dimostrati di essere resa il più efficiente in termini di RNA. Durante la pianificazione di espressione genica o esperimenti di genomica, bisogna tenere a mente la sfida l'alta variabilità genetica in barnacles, almeno per b. BalanUs. Barnacle ha una diversità genetica nel range 3 – 5%, anche in regioni (Alm Rosenblad et al., dati non pubblicati) codificanti. Questo, naturalmente, pone esigenze specifiche sulla progettazione degli iniettori per analisi qPCR, dove più conservate regioni dovrebbero essere identificate e utilizzate come modelli per gli iniettori, al fine di ottenere coerente espressione risultati betweenbatches. Regioni conservate per geni bersaglio, come acquaporine e Na + /K + atpasi, possono essere identificati attraverso lo studio della variabilità di sequenza di questi geni in RNA-seq dati ottenuti dalle popolazioni di cyprids contenente centinaia di individui. Per un'analisi del genoma, DNA sarà campionato. Tuttavia, ottenere il DNA di alta qualità da BalanUs b. può essere difficile21.
In conclusione, la cultura consolidata barnacle ha dimostrato di essere strumentale in diversi tipi di studi sperimentali. In particolare, la produzione larvale tutti-anno-intorno ci permette di condurre esperimenti senza essere limitato al periodo di deposizione delle uova naturale (per b. BalanUs, questo è durante l'estate). Larve ottenute consente di eseguire una vasta gamma di studi sperimentali, tra cui saggi di insediamento, comportamento saggi, studi di espressione su geni specifici, come pure studi genoma transcriptome.

Cirripedi sono crostacei marini con un adulto sessile e larve planctoniche, liberamente natante. La maggior parte delle 1.200 specie di barnacles abitano acque poco profonde e molti sono spesso esposti a bassa salinità. Una specie, il barnacle bay improvvisa Balanus (Amphibalanus) (b. BalanUs), può tollerare quasi d'acqua dolce e Charles Darwin descritto questa specie da un piccolo torrente nell'estuario del Rio de la Plata in Uruguay1. La salinità tolow estrema tolleranza rende BalanUs b. un modello particolarmente rilevante per gli studi di meccanismi osmoregulatory2,3. Questo barnacle preferisce condizioni salmastre ma è capace di vivere in acque con salinità da circa 1,6 psu ad un massimo di 40 psu4. È la specie di barnacle solo trovata nel Mar Baltico salmastro. B. BalanUs si ritiene provengano dalla costa orientale del continente americano, ma oggi si trova in tutto il mondo a causa di dispersione di spedizione5. È un importante organismo incrostazione e si trova comunemente su rocce, moli e scafi ed è quindi di interesse generale per la comprensione dei meccanismi di biofouling sulle costruzioni in acque marine e salmastre6,7.
Simile alla maggior parte altri barnacles, b. BalanUs è ermafroditi con fecondazione incrociata; riproduzione si verifica attraverso l'accoppiamento tra individui vicini utilizzando un pene allungata e fecondazione interna. Il periodo riproduttivo è principalmente da maggio a settembre. B. BalanUs ha sette stadi larvali pelagici (sei naupli seguite da una fase di cyprid8). L'ovulo fecondato si schiude in una larva nauplius che è liberamente natante e si nutre nella colonna d'acqua per fino a parecchie settimane prima muta in una larva di cyprid-di alimentazione. Il cyprid utilizza più segnali per trovare un luogo adatto per stabilirsi e poi subisce metamorfosi in un sessile barnacle giovanile9. Le specie possono essere coltivate in laboratorio e ha una durata di 1 – 2 anni nel mare (2-3 anni nella cultura di laboratorio). In media, b. BalanUs cresce fino a 10 mm di diametro (con un massimo di circa 20 mm) e raggiunge un'altezza massima di circa 6 mm (anche se può crescere più alto sotto condizioni di sovraffollamento). La specie può essere identificato dal suo guscio liscio anche calcareo (bianco o grigiastro), la base calcarea radialmente con motivi della piastra shell e la forma delle piastre tergal1,10.
Il barnacle BalanUs b. ha diverse caratteristiche vantaggiose come un modello per gli studi di osmoregolazione, con un focus sui meccanismi molecolari e fisiologici, nonché interazioni ecologiche e conseguenze evolutive. È inoltre ampiamente usato come modello per le indagini di sedimentazione biologia, in particolare in relazione alla ricerca di antivegetativa e i meccanismi coinvolti7,11,12,13. Tuttavia, riproduzione stagionale naturale produce un rifornimento imprevedibile delle larve cyprid per gli studi. La capacità di cultura questo barnacle attraverso il suo intero ciclo di vita tutto l'anno è, pertanto, una risorsa importante per consentire vari tipi di studi molecolari e meccanicistici. Inoltre, la presenza nelle acque marine/salmastre italiane consente una combinazione di campo e studi sperimentali. Allevamento controllato può anche produrre le famiglie dei pedigree noti per coltura a lungo termine14e un tempo di generazione di pochi mesi potrebbe consentire l'evoluzione sperimentale a lungo termine. C'è anche un genoma di bozza e trascrittomi diversi disponibili, e queste risorse sono state utilizzate per la clonazione di diversi geni (ad esempio, i geni di importanza nell'osmoregolazione)2,3.
L'obiettivo di questo protocollo è di descrivere le modalità stabilire e mantenere una cultura di barnacle b. BalanUs durante tutto l'anno al fine di eseguire studi di espressione genica su adulti o larve di questo organismo. Rittschof et al. 15 brevemente descritto un metodo per la coltura di barnacles dal rilascio di naupli per l'insediamento di cyprids per le specie Balanus amphitrite. Il protocollo è stato adattato per la coltura di tutto l'anno di b. BalanUs presso Tjärnö Marine Research Laboratory (Svezia), e una descrizione dettagliata di tutte le fasi della linea di produzione è delineata, compresa la produzione e allevamento di barnacle le larve, come pure la somministrazione di mangimi per gli adulti e le larve. Per una panoramica della procedura completa, vedere la Figura 1. L'uso del sistema di coltura è esemplificato con alcuni comuni set-up sperimentale e illustrata in studi di genomica funzionale di Na+/k+ dell'atpasi e acquaporine, chiarire le loro funzioni possibili nell'osmoregolazione2, 3. A volte è indispensabile esaminare l'espressione genica in tessuti specifici, e alcune delle basi della dissezione barnacle saranno coperti. Con una buona fornitura di acqua di mare di alta qualità, alla coltura di barnacle BalanUs b.e potenzialmente molte altre specie, dovrebbe essere possibile in laboratori marini in tutto il mondo.

<table><tbody><tr><td>Pannelli in plexiglas (polimetilmetacrilato)</td><td>Produttore di plastica, Bromma, Svezia</td><td></td><td>vetro trasparente</td></tr><tr><td>1,5 L bottiglia</td><td></td><td></td><td></td>in PET</tr><tr><td>Artemia</td><td>INVE Acquacoltura, Belgio</td><td></td><td>Abbiamo testato diverse aziende; questo è davvero il migliore</td></tr><tr><td>Skeletonema marinoi (CCAP ceppo 1077/5)</td><td>CCAP (Collezione di colture di alghe e protozoi); Scozia&nbsp;</td><td>ceppo 1077/5</td><td></td></tr><tr><td>Chaetoceros simplex var. gracilis (CCAP ceppo 1085/3)</td><td>CCAP (Collezione di colture di alghe e protozoi); Scozia&nbsp;</td><td>strain 1085/3</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di filtraggio a cartuccia</td><td>Millipore Millipore&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cartuccia con una dimensione nominale dei pori di 0,2 & micro; m</td><td>Millipore&nbsp;</td><td>cartuccia CWSS01S03</td><td>Alta capacità per grandi volumi</td></tr><tr><td>flacone in policarbonato</td><td>Nalgene</td><td></td><td>autoclavabile</td></tr><tr><td>RNA successivamente</td><td>Qiagen</td><td>76106</td><td>&nbsp; Soluzione di fissaggio per preservare l'RNA</td></tr><tr><td>TURBO Kit senza DNA</td><td>Invitrogen/Thermofisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>AM1907</td><td>Kit DNAsi per rimuovere il DNA dall'RNA preparato</td></tr><tr><td>Kit di sintesi iScript cDNA Kit di sintesi</td><td>1708890</td><td>Biorad</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green supermix</td><td>Biorad</td><td>1708880</td><td>Dye per QPCR</td></tr><tr><td>RNeasy minikit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Estrazione di RNA di adulti o molti cipridi Omogeneizzazione</td></tr><tr><td>dei tessuti molli CK 14, provette da 2 ml</td><td>Precellys</td><td>KT03961-1-003.2</td><td>Perle in ceramica per omogeneizzazione</td></tr><tr><td>RNeasy micro kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>Estrazione di RNA di pochi cipridi</td></tr></tbody></table>

il barnacle balanus balanus come modello marine - coltura e l'espressione genica

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Cirripedi sono crostacei marini con un adulto sessile e larve planctoniche, liberamente natante. Il barnacle BalanUs Balanus (Amphibalanus) è particolarmente rilevante come un modello per gli studi di osmoregulatory meccanismi a causa della sua estrema tolleranza alla salinità bassa. È inoltre ampiamente usato come un modello di sedimentazione biologia, in particolare in relazione alla ricerca di antivegetativa. Tuttavia, riproduzione stagionale naturale produce un rifornimento imprevedibile delle larve cyprid per gli studi. Un protocollo per la coltura di tutto l'anno di BalanUs b. è stata sviluppata e una descrizione dettagliata di tutti i passaggi nella linea di produzione è descritto (cioè, la creazione di culture adulte sui pannelli, raccolta e allevamento di larve di Barnacle e la somministrazione di mangimi per gli adulti e larve). La descrizione anche fornisce indicazioni sulla risoluzione dei problemi e vengono illustrati i parametri critici (ad esempio, la rimozione della contaminazione, la produzione di mangimi di alta qualità, la manodopera necessaria e l'importanza della qualità dell'acqua di mare). Ogni lotto dal sistema di coltura al massimo produce all'incirca 12.000 naupli e in una settimana, quindi fino a quasi 50.000 larve alla settimana possono essere prodotti in grado di fornire quattro batch. Il metodo utilizzato per cultura b. BalanUs è, probabilmente, in larga misura applicabile anche ad altri invertebrati marini con free-swimminglarvae. Protocolli sono presentati per la dissezione di vari tessuti da adulti, nonché la produzione di RNA di alta qualità per gli studi sull'espressione genica. È anche descritti come coltivati adulti e allevati cyprids può essere utilizzato in una vasta gamma di disegni sperimentali per l'esame di espressione genica in relazione a fattori esterni. L'utilizzo di barnacles coltivate nell'espressione genica è illustrato con studi di ruoli possibili osmoregulatory di Na+/k+ dell'atpasi e acquaporine.

Con la procedura descritta per la coltura delle adulto barnacles di BalanUs b., fino a quattro lotti di nauplius larve possono essere prodotto a settimana. Sarebbe possibile raccogliere larve nauplius quasi ogni notte, ma questo richiede sempre più persone e infrastrutture (con molti barnacles nei riproduttori, una cultura rilascerà larve continuamente). Un ulteriore fattore limitante per la produzione di larve sembra essere la disponibilità di mangimi di alta qualità, in particolare per quanto riguarda la diatomea neritiche. Al massimo, ogni batch dal sistema di coltura è costituito da circa 12.000 naupli di Artemia, quindi possono essere coltivate fino a 50.000 naupli a settimana. Tuttavia, alcune settimane ci possono essere fino a dieci volte meno larve prodotte. Un adulto può produrre fino a 7.000 larve per giorno14, che significa che 1 – 2 adulti stanno rilasciando larve per ogni batch. Entro una settimana, circa il 70-90% dei raccolti naupli si svilupperà in cyprids (producendo circa 30.000 cyprids alla settimana, al massimo) che può essere utilizzato per insediamento le analisi e gli studi molecolari.
Va sottolineato che ci sono variazioni nelle caratteristiche cyprid tra lotti, e in generale, ci sono grandi variazioni tra lotti di lotti all'interno . Ad esempio, il successo di sedimentazione in saggi di insediamento varia tra 30 e 70% per lotti diversi. Molto probabilmente, questo è causato dalla variazione genetica individuale tra le specifiche coppie di adulti rilasciando larve durante i periodi di campionamento diverso. Naturalmente, si consiglia che esperimenti ripetuti (replica biologico) devono includere cyprids da un numero di batch se più generale dichiarazioni circa i risultati devono essere effettuati. La variazione lotto mette richieste sul disegno sperimentale, dove devono essere applicate controlli adeguati e normalizzazioni in studi di espressione genica. Tuttavia, anche dopo che sono state implementate diverse procedure di normalizzazione statistica che riducono notevolmente la variazione tra lotti, alcuni effetti del batch sono solitamente ancora apparenti (dati non pubblicati).
Seguendo il protocollo fornito, è possibile ottenere, in media, 500 ng di RNA di alta qualità da cyprids appena 20, indipendentemente dalla fase di insediamento barnacle (tabella 1). La qualità del RNA viene solitamente misurata come rapporto tra i picchi 18S e 28S (posizione prevista dei due picchi sono indicate nella Figura 4). Tuttavia, nel caso di barnacles e molti altri artropodi, il rRNA 28S si rompe quando riscaldato (come parte del metodo di analisi) e migra insieme con il picco di 18S20. Ecco perché c'è, in linea di principio, un singolo picco di rRNA in questo tipo di analisi per barnacles. È chiaro da questo test (Figura 4) che un'omogeneizzazione di perle in ceramica fornisce il RNA con la massima integrità ed è, pertanto, il metodo di scelta. il RNA è sufficiente in quantità e qualità per generare le librerie di sequenziamento di alta qualità per il sequenziamento, conseguente a una media di 70 milioni di letture per campione (il numero di letture, naturalmente, dipende dal livello di multiplazione durante la sequenziazione). La quantità di RNA è anche sufficiente per l'analisi di espressione di sintesi e qPCR cDNA di un gran numero di geni.
La figura 5 Mostra il risultato dalle analisi qPCR delle acquaporine e di Na+/k+ ATPasi (NAK1) della giuntura varianti, dove i cambiamenti di espressione sono stati studiati in risposta ai cambiamenti di stimoli ambientali2,3. Un confronto tra l'espressione relativa di lungo e breve di giuntura varianti di spettacoli NAK1 un duplice aumento per il mRNA di NAK1 lunga bassa salinità in relazione breve NAK (Figura 5A). Quindi, i dati indicano che lo splicing alternativo rende la forma lunga predominante in condizioni di bassa salinità. Nel caso di acquaporine, è evidente che i due-il trasporto di acqua paralogs AQP1 e AQP2 visualizzare l'espressione differenziale (Figura 5B). In particolare, nel tessuto del mantello, è evidente che l'AQP1 è sostanzialmente down-regolato a bassa salinità, che non si vede per AQP2. AQP2 Mostra invece un'espressione leggermente aumentata a bassa salinità, ma nel soma. Questi risultati forniscono una base per le indagini dei ruoli funzionali dei diversi trasportatori dello ione b. BalanUs e acquaporine nell'osmoregolazione barnacle.
<img alt="Diagramma del ciclo di vita marino: campionamento di DNA/RNA, coltivazione di naupli e cipridi, processo di insediamento degli adulti." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1 : Panoramica di tutta la procedura e l'estrazione di RNA per studi di espressione genica negli adulti la coltura. Per avviare una nuova cultura, i pannelli sono fissate ad un telaio e distribuiti nel mare a 1-3 m di profondità. Dopo diverse settimane, i pannelli con adulti/giovani sono disposti verticalmente in rack in vassoi in laboratorio. Ogni vassoio contiene circa 40 pannelli con gli adulti. Con circa 100 adulti per pannello, in totale ≈ 4.000 individui adulti sono coltivati per vassoio. I cirripedi adulti sono nutriti con Artemia e può essere mantenuti anno-intorno. Le larve Nauplius sono raccolte più volte a settimana dalla vassoi tramite un filtraggio attraverso un setaccio. I naupli raccolti vengono trasferiti ai bucket mantenuto a 26 ° C in un bagno d'acqua e nutriti con microalghe. Naupli di Artemia sono allevati fino a quando non si muta in cyprids-di alimentazione, che sono raccolti dal filtro. Nuovi pannelli possono essere ottenute in laboratorio la sedimentazione del cyprids su pannelli, sia per fornire nuovi pannelli per l'anno-nei dintorni di cultura o da utilizzare per specifiche configurazioni sperimentali con alterate condizioni esterne. RNA viene poi Estratto da giovani/adulti alla fine dell'esperimento o a intervalli di tempo specifici. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Esperimento di filtrazione acquatica; attrezzature e fasi di processo; configurazione della separazione dei sedimenti; ricerca." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2 : Immagini di alcuni passi importanti nella coltura procedura. (A) questa immagine mostra i fotogrammi con pannelli per la raccolta di nuove popolazioni dal campo. (B) questa immagine mostra i pannelli con adulto barnacles di b. BalanUs in rack che vengono inseriti nei vassoi. I pannelli sono posizionati circa 2 cm tra loro. (C) questa immagine mostra i vassoi con il barnacle pannelli e il serbatoio di alimentazione a sinistra. Da ogni cassetto, c'è una presa di corrente dove sono collocati i setacci per la raccolta delle larve nauplius. (D) questa immagine mostra che la produzione di artemie mangime per i cirripedi adulti. (E) questa immagine mostra l'allevamento di naupli di Artemia in secchi messi in un bagnetto ad acqua settato a 26 ° C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Diagramma anatomico dei cirripedi; placche opercolari, guscio, dettagli del corpo; studio biologico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3 : Descrizione dei passi iniziali dissezione di balani adulti: rimozione del corpo dal suo guscio. (A) afferrare una delle piastre opercular inserendo forcipe delicatamente attraverso l'apertura. Tirare delicatamente per rimuovere la piastra ed esporre l'animale. (B) tirare fuori l'animale afferrando la parte di soma appena sotto i cirri. (C), questo pannello mostra l'anatomia generale di barnacles di ghianda. Il mantello e potenzialmente fecondati (nell'ovaia) rimanere nella cavità shell quando il corpo è tirato fuori. Una nota sull'anatomia di barnacle (per un resoconto più approfondito, Vedi Anderson)9: placche a muro di un cirripede pendenza verso l'interno, e insieme formano un cono di vulcano-come. Un'apertura, l'apertura, è coperto da due placche opercolare, che formano una porta, o un opercolo, a chiudere il diaframma. Barnacles di ghianda in genere hanno una piastra basale calcarea che è incollata saldamente al substrato; Tuttavia, alcune specie di balani mancanza questo piatto calcareo (ad es., S. balanoides). Barnacles secernono l'esoscheletro dal mantello scuro pigmentato (carapace). La superficie esterna del mantello a doppio strato è calcificata per diventare rigidi, mentre la superficie interna del mantello non è calcificata ed è quindi flessibile. All'interno l'apertura, i cirri sono presenti in una posizione retratta. Queste sono le appendici toraciche che barnacles utilizzare per l'alimentazione di sospensione. Le ovaie si trovano vicino alla base del barnacle, mentre i testicoli si trovano nel soma. Questa figura è stata adottata da Panova et al. 21 ed è stata pubblicata con il permesso di Springer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Grafico del tempo di fluorescenza in funzione dell'intensità, analisi dei dati dei picchi di emissione, studio spettroscopico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4 : Determinazione della integrità di rRNA mediante elettroforesi capillare. RNA è stato preparato da due metodi diversi di omogeneizzazione: sonicazione (A) e (B) perle in ceramica. L'unità sull'asse y, FU, acronimo di unità di fluorescenza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Grafici a barre che confrontano gli effetti della salinità e della pCO₂ sull'espressione di NKA-L1/NAK-S; Espressione dell'acquaporina nei tessuti." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5 : Espressione genica deriva da due diversi studi di geni importanti per osmoregolazione in b. BalanUs. (A), questo pannello mostra l'espressione differenziale come misurato da qPCR di varianti di splicing del Na+/k+ dell'atpasi NAK1 in risposta a varie salinità e pCO2 livelli3. Nel trattamento bassa salinità, l'espressione dell'isoforma lunga (NAK1-L) è aumentato relativamente breve (ANOVA, P &lt; 0,001). (B), questo pannello mostra l'espressione delle acquaporine in adulti di BalanUs b. durante la loro esposizione a varie salinità2. qPCR è stato utilizzato per determinare i livelli di espressione di aquaporin rispetto l'actina. Gli individui adulti sono stati incubati a 3 diverse salinità (3, 20 e 33 PSU) per 14 giorni. Per la preparazione di RNA, il soma, cirri e mantello degli adulti sono stati separati. In entrambe le figure, le barre di errore indicano la deviazione standard. Il * * e * * * indicare il livello di significatività (ANOVA), 0,01 e 0,001, rispettivamente. Queste cifre sono state modificate da Lind et al. 2 , 3. entrambe le figure sono pubblicate con l'autorizzazione di PLoS ONE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Fase di stabilimento</td>
			<td>Quantità totale di RNA (ng)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Libero per il nuoto</td>
			<td>512</td>
		</tr>
<tr>
<td>Esplorazione: Chiudi ricerca</td>
			<td>518</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cyprid allegata</td>
			<td>550</td>
		</tr>
<tr>
<td>Appena metamorfosato giovanile</td>
			<td>832</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: rendimenti di RNA. Questa tabella mostra la quantità di RNA estratta con un kit di preparazione di RNA da piscine di 20 individui cyprid raccolti in diverse fasi durante il processo di liquidazione.

Il barnacle BalanUs Balanus (Amphibalanus) è un modello per lo studio di osmoregolazione e antivegetativa. Tuttavia, riproduzione stagionale naturale produce un imprevedibile approvvigionamento di cyprid larve. Qui, un protocollo per la coltura di tutto l'anno di b. BalanUs è descritto, compresa la produzione di larve. L'uso di balani coltivate in studi di espressione genica è illustrato.

Il Barnacle Balanus BalanUs come modello Marine - coltura e l'espressione genica

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

La struttura di coltura può aiutare a rispondere a domande chiave nell'ambito dell'ecologia larvale, del biofouling e della biologia evolutiva. Più specificamente, può essere utilizzato in studi sulle interazioni recettore-ligando durante l'insediamento larvale, sullo sviluppo di nuove tecnologie antivegetative e sull'evoluzione e la funzione di geni coinvolti nell'osmoregolazione. Il vantaggio principale di questo organismo modello è che il cirripedi Balanus improvisus è robusto, si riproduce tutto l'anno e ha un tempo di generazione relativamente breve.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla coltura dei cirripedi, può essere applicato anche alla coltura di altri organismi marini. Generalmente le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa del gran numero di dettagli che sono importanti per il successo, come la fornitura di buona acqua di mare, la robusta produzione di mangimi di alta qualità e una costante attenzione alla pulizia e all'alimentazione delle colture. A dimostrare la procedura saranno Martin Ogemark e Anna-Lisa Wrange, tecnico e ricercatore che lavora con i cirripedi.Per iniziare, installa telai che possono contenere diversi pannelli termoplastici trasparenti. Praticare due fori negli angoli superiori di ciascun pannello e utilizzare fascette per fissare i pannelli ai telai. Per raccogliere i cirripedi adulti, dispiega i pannelli verticalmente a una profondità da uno a tre metri in acque calme.Dopo aver lasciato che i cirripedi si depositassero e crescessero fino a cinque millimetri di diametro, portare i pannelli in laboratorio. Quindi posizionare i pannelli verticalmente in un supporto con scanalature fresate in una teglia in polietilene. Innanzitutto, utilizzando del nastro adesivo atossico e resistente all'acqua, fissa cinque pannelli insieme per creare un cubo aperto nella parte superiore.Mettere il cubetto in un vassoio e riempirlo con acqua di mare. Quindi, aggiungi circa 200 cipridi nella parte superiore del cubo. A giorni alterni, nutri i giovani cirripedi con 100 millilitri di Skeletonema marinoi.Dopo due o tre settimane, i pannelli del cubo dovrebbero contenere giovani consolidati di almeno cinque millimetri di diametro. Smonta il cubo e sposta i pannelli in vassoi con acqua di mare che scorre attraverso il flusso. Per raccogliere i naupli di Artemia, spegnere prima la pompa di aerazione e scurire la bottiglia, quindi illuminare la parte inferiore della bottiglia per 10 minuti.I naupli di Artemia nati nuoteranno verso la luce. Le cisti non schiuse affonderanno sul fondo, mentre i gusci delle cisti galleggeranno verso l'alto. Aprire la pinza sul fondo e raccogliere la frazione intermedia come una densa popolazione di naupli di Artemia che nuotano.Per pulire i pannelli con cirripedi adulti, spruzzarli delicatamente con acqua dolce e rimuovere eventuali incrostazioni con uno spazzolino morbido. Pulire le vaschette senza cirripedi e i tubi con acqua dolce calda. Quindi, posizionare un setaccio nella vaschetta in polietilene con una porta di troppo pieno.Raccogli le larve di cirripedi che si depositano nel setaccio durante la notte. Quindi riempi un secchio con 20 litri di acqua di mare filtrata e un litro di una miscela di microalghe di diatomee per creare una densità di 50.000 diatomee per millilitro. Trasferisci i naupli di cirripedi precedentemente raccolti in un piatto di cristallizzazione e illumina il piatto lateralmente.Raccogliete quindi con una pipetta i naupli che nuotano verso la luce e trasferiteli in un altro piatto. Trasferire i naupli in un becher contenente un litro di acqua di mare filtrata per il conteggio. Quindi, aggiungi un litro di naupli al secchio precedentemente preparato.Dopo tre giorni, usa un setaccio da 90 micrometri per raccogliere i naupli di cirripedi, quindi pulisci il secchio, riempilo con acqua di mare filtrata e aggiungi nuovo mangime di diatomee e i naupli di cirripedi. Dopo altri due o tre giorni di incubazione, utilizzare un setaccio da 320 micrometri sopra un setaccio da 160 micrometri per separare i naupli di cirripedi non mutati dai cipridi. Dopo aver allestito quattro bottiglie da quattro litri per la coltura di microalghe, posizionare le bottiglie nella luce a un'intensità compresa tra 50 e 100 micromoli per metro quadrato.Raccogli le colture quando sono sufficientemente dense da essere utilizzate per l'alimentazione. Innanzitutto, seleziona individui di grandi dimensioni e trattieni il cibo per due giorni prima della dissezione. Quindi, pulisci il guscio del cirripede con uno spazzolino da denti e risciacqua con acqua per ridurre al minimo la contaminazione da altre specie presenti nell'ambiente.Posizionare un singolo cirripedi su una superficie piana per la dissezione, quindi inserire la punta di un paio di pinze tra la piastra tergale e quella scutale. Afferrare un piatto e tirarlo delicatamente per rimuoverlo. Quindi, usa una pinza per afferrare il cirri ed estrarre il cirripede.Infine, posizionare i cirripedi sezionati direttamente in etanolo al 96% o in una soluzione stabilizzante dell'RNA per la fissazione. Con il protocollo qui descritto, è possibile produrre fino a quattro lotti di larve di nauplio di cirripedi in una settimana. Al massimo, ogni lotto del sistema di coltura è composto da circa 12.000 naupli, il che significa che è possibile coltivare fino a 50.000 naupli a settimana.Entro una settimana, dal 70 al 90% dei naupli raccolti si svilupperà in cipridi, producendo circa 30.000 cipridi a settimana. Una media di 500 nanogrammi di RNA di alta qualità è stata ottenuta da un minimo di 20 singoli cipridi, indipendentemente dallo stadio di insediamento. Nei cirripedi, l'rRNA 28S si rompe quando viene riscaldato.L'omogeneizzazione mediante perle di ceramica fornisce all'RNA la massima integrità, rendendolo così il metodo preferito per la manipolazione del tessuto di cirripedi e artropodi. Utilizzando l'analisi qPCR, è stato osservato un aumento di due volte per le varianti lunghe dell'mRNA NAK1 e bassa salinità rispetto al NAK corto. Ciò indica che la forma lunga è predominante in condizioni di bassa salinità.Sono necessarie alcune settimane di formazione per padroneggiare i diversi passaggi coinvolti nella cultura dei cirripedi. Durante il tentativo di questa procedura, è particolarmente importante ridurre al minimo la contaminazione in tutte le fasi del flusso di lavoro della coltura. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica di coltura è stata determinante per darci una migliore comprensione dell'ecologia, della fisiologia e della biologia molecolare dei cirripedi.È anche un'importante pietra miliare nel trasformare il cirripedi Balanus improvvisus in un potente sistema di modelli marini.

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Il hawaiensis anfipode Parhyale è un organismo modello promettente per studi di embriologia crostacei e sviluppo artropodi comparativa e l'evoluzione. Questo protocollo descrive un metodo per la rimozione manuale dei singoli blastomeri da embrioni precoci stadio di clivaggio Parhyale.

Ablazione di una singola cella da otto cellule embrioni dei crostacei anfipodi<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

I metodi che producono embrioni morphant sono essenziali per studiare i meccanismi di sviluppo e reti di regolazione genica. La stella di mare Patiria miniata è un sistema modello emergente per questi studi. Qui vi presentiamo un protocollo per l'ottenimento di gameti, la produzione di colture di embrioni, e la rapida microiniezione di zigoti di questa specie.

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Riportiamo qui l'espressione robusto ed efficiente di proteine ​​fluorescenti dopo l'iniezione di mRNA in oociti fecondati di Branchiostoma lanceolatum. Lo sviluppo della tecnica microiniezione in questo chordate basale aprirà la strada di una profonda innovazioni tecniche in questo sistema modello emergente, tra cui imaging in vivo e manipolazioni gene-specifici.

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A monte intero<em&gt; In Situ</em&gt; Metodo ibridazione per la molluschi gasteropodi<em&gt; stagnalis Lymnaea</em

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