Il Barnacle Balanus BalanUs come modello Marine - coltura e l'espressione genica

La struttura di coltura può aiutare a rispondere a domande chiave nell'ambito dell'ecologia larvale, del biofouling e della biologia evolutiva. Più specificamente, può essere utilizzato in studi sulle interazioni recettore-ligando durante l'insediamento larvale, sullo sviluppo di nuove tecnologie antivegetative e sull'evoluzione e la funzione di geni coinvolti nell'osmoregolazione. Il vantaggio principale di questo organismo modello è che il cirripedi Balanus improvisus è robusto, si riproduce tutto l'anno e ha un tempo di generazione relativamente breve.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla coltura dei cirripedi, può essere applicato anche alla coltura di altri organismi marini. Generalmente le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa del gran numero di dettagli che sono importanti per il successo, come la fornitura di buona acqua di mare, la robusta produzione di mangimi di alta qualità e una costante attenzione alla pulizia e all'alimentazione delle colture. A dimostrare la procedura saranno Martin Ogemark e Anna-Lisa Wrange, tecnico e ricercatore che lavora con i cirripedi.

Per iniziare, installa telai che possono contenere diversi pannelli termoplastici trasparenti. Praticare due fori negli angoli superiori di ciascun pannello e utilizzare fascette per fissare i pannelli ai telai. Per raccogliere i cirripedi adulti, dispiega i pannelli verticalmente a una profondità da uno a tre metri in acque calme.

Dopo aver lasciato che i cirripedi si depositassero e crescessero fino a cinque millimetri di diametro, portare i pannelli in laboratorio. Quindi posizionare i pannelli verticalmente in un supporto con scanalature fresate in una teglia in polietilene. Innanzitutto, utilizzando del nastro adesivo atossico e resistente all'acqua, fissa cinque pannelli insieme per creare un cubo aperto nella parte superiore.

Mettere il cubetto in un vassoio e riempirlo con acqua di mare. Quindi, aggiungi circa 200 cipridi nella parte superiore del cubo. A giorni alterni, nutri i giovani cirripedi con 100 millilitri di Skeletonema marinoi.

Dopo due o tre settimane, i pannelli del cubo dovrebbero contenere giovani consolidati di almeno cinque millimetri di diametro. Smonta il cubo e sposta i pannelli in vassoi con acqua di mare che scorre attraverso il flusso. Per raccogliere i naupli di Artemia, spegnere prima la pompa di aerazione e scurire la bottiglia, quindi illuminare la parte inferiore della bottiglia per 10 minuti.

I naupli di Artemia nati nuoteranno verso la luce. Le cisti non schiuse affonderanno sul fondo, mentre i gusci delle cisti galleggeranno verso l'alto. Aprire la pinza sul fondo e raccogliere la frazione intermedia come una densa popolazione di naupli di Artemia che nuotano.

Per pulire i pannelli con cirripedi adulti, spruzzarli delicatamente con acqua dolce e rimuovere eventuali incrostazioni con uno spazzolino morbido. Pulire le vaschette senza cirripedi e i tubi con acqua dolce calda. Quindi, posizionare un setaccio nella vaschetta in polietilene con una porta di troppo pieno.

Raccogli le larve di cirripedi che si depositano nel setaccio durante la notte. Quindi riempi un secchio con 20 litri di acqua di mare filtrata e un litro di una miscela di microalghe di diatomee per creare una densità di 50.000 diatomee per millilitro. Trasferisci i naupli di cirripedi precedentemente raccolti in un piatto di cristallizzazione e illumina il piatto lateralmente.

Raccogliete quindi con una pipetta i naupli che nuotano verso la luce e trasferiteli in un altro piatto. Trasferire i naupli in un becher contenente un litro di acqua di mare filtrata per il conteggio. Quindi, aggiungi un litro di naupli al secchio precedentemente preparato.

Dopo tre giorni, usa un setaccio da 90 micrometri per raccogliere i naupli di cirripedi, quindi pulisci il secchio, riempilo con acqua di mare filtrata e aggiungi nuovo mangime di diatomee e i naupli di cirripedi. Dopo altri due o tre giorni di incubazione, utilizzare un setaccio da 320 micrometri sopra un setaccio da 160 micrometri per separare i naupli di cirripedi non mutati dai cipridi. Dopo aver allestito quattro bottiglie da quattro litri per la coltura di microalghe, posizionare le bottiglie nella luce a un'intensità compresa tra 50 e 100 micromoli per metro quadrato.

Raccogli le colture quando sono sufficientemente dense da essere utilizzate per l'alimentazione. Innanzitutto, seleziona individui di grandi dimensioni e trattieni il cibo per due giorni prima della dissezione. Quindi, pulisci il guscio del cirripede con uno spazzolino da denti e risciacqua con acqua per ridurre al minimo la contaminazione da altre specie presenti nell'ambiente.

Posizionare un singolo cirripedi su una superficie piana per la dissezione, quindi inserire la punta di un paio di pinze tra la piastra tergale e quella scutale. Afferrare un piatto e tirarlo delicatamente per rimuoverlo. Quindi, usa una pinza per afferrare il cirri ed estrarre il cirripede.

Infine, posizionare i cirripedi sezionati direttamente in etanolo al 96% o in una soluzione stabilizzante dell'RNA per la fissazione. Con il protocollo qui descritto, è possibile produrre fino a quattro lotti di larve di nauplio di cirripedi in una settimana. Al massimo, ogni lotto del sistema di coltura è composto da circa 12.000 naupli, il che significa che è possibile coltivare fino a 50.000 naupli a settimana.

Entro una settimana, dal 70 al 90% dei naupli raccolti si svilupperà in cipridi, producendo circa 30.000 cipridi a settimana. Una media di 500 nanogrammi di RNA di alta qualità è stata ottenuta da un minimo di 20 singoli cipridi, indipendentemente dallo stadio di insediamento. Nei cirripedi, l'rRNA 28S si rompe quando viene riscaldato.

L'omogeneizzazione mediante perle di ceramica fornisce all'RNA la massima integrità, rendendolo così il metodo preferito per la manipolazione del tessuto di cirripedi e artropodi. Utilizzando l'analisi qPCR, è stato osservato un aumento di due volte per le varianti lunghe dell'mRNA NAK1 e bassa salinità rispetto al NAK corto. Ciò indica che la forma lunga è predominante in condizioni di bassa salinità.

Sono necessarie alcune settimane di formazione per padroneggiare i diversi passaggi coinvolti nella cultura dei cirripedi. Durante il tentativo di questa procedura, è particolarmente importante ridurre al minimo la contaminazione in tutte le fasi del flusso di lavoro della coltura. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica di coltura è stata determinante per darci una migliore comprensione dell'ecologia, della fisiologia e della biologia molecolare dei cirripedi.

È anche un'importante pietra miliare nel trasformare il cirripedi Balanus improvvisus in un potente sistema di modelli marini.