Bioprintable alginato/gelatina idrogel 3D In Vitro sistemi modello inducono la formazione di sferoide di cella

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia del cancro, come la formazione del tumore, il monitoraggio della migrazione cellulare e la segnalazione del cancro e delle cellule sane. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ci permette di studiare la tumorigenesi in un ambiente 3D insieme alle cellule stromali, come i fibroblasti, con un basso costo e un'alta riproducibilità. È importante assicurarsi che i materiali siano sia biostampabili che biofunzionali, il che richiede uno studio quantitativo delle sue proprietà reologiche e della compatibilità cellulare.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di preparazione dell'idrogel e di miscelazione dell'idrogel cellulare sono difficili da apprendere perché la formazione delle bolle interferisce con la fedeltà del modello stampato. In una cabina di biosicurezza, mescolare tre grammi di alginato e sette grammi di gelatina in polvere in un becher da 250 millilitri. Aggiungere un agitatore magnetico e 100 millilitri di DPBS.

Sigillare il becher con pellicola di paraffina sterile e un foglio di alluminio per evitare contaminazioni. Quindi mostra al partecipante i grafici polari unici e specifici che corrispondono ai loro modelli di elettromiografia, o EMG. Dopodiché, continuare l'agitazione a temperatura ambiente per due ore.

Riscaldare la soluzione a 37 gradi Celsius fino a quando il gel subisce una transizione di fase allo stato liquido. Quindi trasferire la soluzione in provette da centrifuga coniche sterili da 50 millilitri e sigillarle. Centrifugare le provette a 834 volte g per cinque minuti per eliminare eventuali bolle di gas.

Quindi, aspirare il precursore dell'idrogel in siringhe da 10 millilitri. Sigillare le siringhe con tappi e pellicola di paraffina. Conservare a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso.

Quando sei pronto per iniziare il test, metti una siringa di precursore dell'idrogel preparato in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per un'ora. Mentre la siringa si sta riscaldando, accendere e inizializzare il reometro. Dopo un'ora, rimuovere la siringa dal bagnomaria.

Estrudere circa 0,5 millilitri del precursore sulla piattaforma del reometro. Sul pannello di controllo, fare clic sul pulsante triangolo verso il basso. Attendere che lo strumento di misurazione si sposti nella posizione di taglio.

Utilizzando una spatola, tagliare l'eventuale precursore in eccesso che è fuoriuscito dal bordo dello strumento di misura ed eliminare il materiale superfluo. Quindi pipettare l'olio minerale sul bordo dello strumento di misura. Attendere che l'olio sigilli completamente il confine.

Nel pannello di controllo, fare clic su Continua. Quindi fare clic sul pulsante Start. Al termine del test, rilasciare lo strumento di misurazione e fare clic sul pulsante triangolo verso l'alto.

Rimuovere lo strumento di misurazione. Pulire sia lo strumento di misura che la piattaforma con etanolo al 70%. Innanzitutto, completare gli sweep di ampiezza e temperatura come indicato nel protocollo di testo.

Per avviare uno sweep temporale isotermico, fare clic su App personali e quindi sul modello per Test tempo-temperatura isotermico. Fai clic sul passaggio Misurazione nel flusso di lavoro. Quindi fare clic sulla deformazione di oscillazione variabile e aprire la finestra di configurazione.

Impostare la deformazione di oscillazione su 0,1% e impostare la frequenza di oscillazione su un hertz. Nella finestra a discesa, impostare il numero di punti dati su 120. Impostare la frequenza di raccolta dei dati su un punto al minuto.

Fare clic sul pulsante Aggiungi per aggiungere la variabile di temperatura. Fare clic sulla temperatura variabile e impostarla su 25 gradi Celsius. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul passaggio Dispositivo, Sposta al punto di misurazione nel flusso di lavoro.

Fare clic su Elimina. Quindi fare clic sul passaggio Dispositivo, Imposta valore. Deseleziona la casella Attendi fino al raggiungimento del valore e imposta il valore su 25 gradi Celsius.

Fai clic su Immagine, Titolo, Pulsanti nella parte inferiore dello schermo. Deseleziona la casella Continua. Quindi fare clic sul passaggio Inizia, assegnare un nome al progetto e salvarlo.

Ora caricare il campione sulla piattaforma del reometro e iniziare il test seguendo il protocollo generale di test precedentemente descritto. Successivamente, osserva il primo G e il doppio primo G rispetto al tempo. Trova il punto di incrocio di G primo e G doppio primo e determina l'ora nel punto di incrocio.

Quindi fai clic su Tabella, copia tutti i dati e incollali in un file di testo. Per misurare la resistenza allo snervamento in vari momenti di gelificazione, fare clic su Le mie app. Fare clic sul modello per Sforzo di snervamento e flusso, simile al gel.

Assegna un nome a questo progetto. Quindi, fai clic sul passaggio Avvia nel flusso di lavoro. Nel menu in alto, fai clic su Inserisci.

Quindi, nel menu a discesa, seleziona Attendi. Apri la finestra di configurazione e imposta il tempo di attesa su 50 minuti. Fare clic su Start, quindi fare nuovamente clic su Inserisci.

Seleziona Dispositivo dal menu a discesa. Apri la finestra di configurazione, seleziona Temperatura e impostala su 25 gradi Celsius. Deseleziona la casella Attendi fino al raggiungimento del valore.

Nel flusso di lavoro, seleziona il passaggio Misurazione. Selezionare la variabile Sforzo di taglio e aprire la finestra di configurazione. Impostare la sollecitazione di taglio iniziale e finale rispettivamente a zero e 10.000 pascal.

Quindi fare clic su Calcolatrice, impostare la densità dei punti su 0,2 punti per pascal. Nella scheda Punti dati a sinistra, imposta un punto al secondo. Nella parte inferiore della finestra a discesa, selezionare la scheda Controllo eventi, impostare il criterio Interrompere la misurazione se la velocità di taglio è maggiore di 100 al secondo.

Caricare il campione sulla piattaforma del reometro e iniziare il test seguendo il protocollo generale di test precedentemente descritto. Al termine del test, fare clic su Diagramma per osservare la curva deformazione-sollecitazione. Ripetere questo test per tempi di attesa di 30, 40 e 50 minuti.

I seguenti passaggi devono essere eseguiti in condizioni sterili. Per iniziare, sterilizzare la biostampante spruzzandola accuratamente con etanolo al 70% e poi esponendola ai raggi UV durante la notte. Rimuovere una siringa di precursore dell'idrogel dalla conservazione e riscaldarla in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per un'ora.

Trasferire un pallone a T di cellule precedentemente coltivate da un incubatore a CO2 alla cappa di biosicurezza. Scartare il terreno di coltura, quindi sciacquare le cellule due volte con DPBS. Aggiungere una soluzione riscaldata di tripsina-EDTA alle cellule.

Incubare a 37 gradi Celsius per sei minuti. Successivamente, inattiva la tripsina aggiungendo lo stesso volume di FBS. Rimuovere la siringa del precursore dell'idrogel dal bagnomaria e pulirla.

Sterilizzare la siringa con etanolo al 70% prima di trasferirla nella cabina di biosicurezza. Estrudere circa tre millilitri di precursore dell'idrogel in una cartuccia di stampa da 10 millilitri. Miscelare il precursore con le cellule MDA-MB-231-GFP a una concentrazione di un milione di cellule per millilitro pipettandolo lentamente per evitare la produzione di bolle.

Coprire la cartuccia con i tappi terminali e superiori e sigillarla con un film di paraffina. Quindi centrifugare a 834 volte g per un minuto per eliminare eventuali bolle di gas. Ripeti l'intero processo per gli altri precursori.

Successivamente, sterilizzare tutte e tre le cartucce con etanolo al 70%. Caricare le cartucce sterilizzate nelle camere della biostampante. Nel software di controllo della stampante, fare clic su manuale.

Quindi espandere la scheda Testa utensile nel software di controllo della stampante. Fare clic su una cartuccia nell'interfaccia grafica sul lato sinistro, impostare la temperatura della cartuccia a 25 gradi Celsius e attendere 35 minuti per consentire al precursore di raggiungere le condizioni di stampa. Ripetere l'operazione per le altre due cartucce.

Nel software di controllo della stampante, espandere la scheda Testa utensile. Fare clic su una cartuccia nell'interfaccia grafica, quindi fare clic sul pulsante di misurazione breve per misurare la posizione della punta dell'ugello. Ripetere l'operazione per le altre due cartucce.

Quindi, posizionare una micropiastra in polistirene trasparente sul tavolino della stampante. Apri il file G-code e modifica la pressione a 200 kilopascal per tutte le cartucce. Torna al software di controllo e fai clic sulla scheda Generatore di scaffolder.

Selezionare un punto per avviare la stampa, quindi fare clic sul pulsante Esegui. Ripetere questo processo per ottenere tre repliche. Successivamente, aggiungere una soluzione di cloruro di calcio da 100 millimolari per un minuto per reticolare i modelli.

Risciacquare due volte con DPBS. Quindi utilizzare una spatola per trasferire con cura i modelli su una piastra a sei pozzetti rivestita di agarosio. Aggiungere cinque millilitri di DMEM a ciascun pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, sostituendo il terreno di coltura cellulare ogni tre giorni.

In questo studio, vengono fabbricati sistemi tridimensionali di idrogel per ricapitolare i microambienti tumorali in vivo e facilitare la formazione di sferoidi tumorali multicellulari. Uno sweep di temperatura del precursore A3G7 mostra che G doppio primo è maggiore di G primo a 37 gradi Celsius, il che convalida le proprietà note del precursore. Quando la temperatura diminuisce, il precursore subisce una gelificazione fisica a causa dell'aggrovigliamento fisico spontaneo delle molecole di gelatina in una formazione a tre eliche.

Sia il primo G che il doppio primo G aumentano la temperatura diminuisce e convergono a 30,6 gradi Celsius, indicando una transizione sol-gel. La microscopia confocale del modello ad elica stampato mostra che le cellule MDA-MB-231-GFP iniziano a sviluppare sferoidi 15 giorni dopo il periodo di coltura e gli sferoidi continuano ad aumentare di dimensioni e numero fino al giorno 30. Si vede anche che alcune delle celle IMR-90-mCherry formano agglomerati.

Dopo 30 giorni di coltura, le cellule IMR-90-mCherry potevano essere osservate nella regione inizialmente occupata dalle cellule MDA-MB-231-GFP, mentre le cellule MDA-MB-231-GFP potevano essere osservate nella regione dominata da IMR-90-mCherry. Ciò implica possibili eventi di migrazione nel modello. La microscopia confocale del modello a disco rivela che le cellule MDA-MB-231-GFP si comportano in modo simile a come si comportavano nel modello a elica, risultando in un idrogel carico di sferoidi dopo 21 giorni di coltura.

Una volta padroneggiata, questa tecnica per stampare i modelli può essere eseguita in due ore, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere l'idrogel e le cellule il più freschi possibile, di non mescolare vecchi lotti di idrogel con quelli nuovi e di lavorare in condizioni sterili per evitare risultati fuorvianti. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la microscopia elettronica a scansione e la microscopia time-lapse per rispondere a ulteriori domande, come la porosità del materiale, la velocità di migrazione cellulare e il rimodellamento della matrice.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia del cancro perché questo modello in vitro consente studi sistematicamente controllati sulla formazione e sul comportamento del tumore in sistemi di co-coltura. Oltre alle cellule del cancro al seno, il modello può essere facilmente applicato anche a sistemi che utilizzano altri tipi di cellule in varie posizioni iniziali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare modelli 3D di malattie eterogenee preparando correttamente gli idrogel, incorporando le cellule e stampando il materiale all'interno della finestra di stampa ottimale.

Non dimenticare che lavorare con campioni biologici può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura sono necessarie precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale, come guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza.