Name: Bioprintable alginato/gelatina idrogel 3D In Vitro sistemi modello inducono la formazione di sferoide di cella (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 20 s
Description: Scopri la biostampa di idrogel alginato/gelatina per modelli tumorali 3D con cellule MDA-MB-231 e fibroblasti. Questo metodo economico e riproducibile facilita la formazione di sferoidi multicellulari e lo studio delle interazioni tumorali.

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Tao Jiang grazie la Cina Scholarship Council (201403170354) e McGill Engineering Award dottorato (90025) per il loro finanziamento di borse di studio. Jose G. Munguia-Lopez grazie CONACYT (250279, 290936 e 291168) e FRQNT (258421) per il loro finanziamento di borse di studio. Salvador Flores-Torres grazie CONACYT per loro borsa di studio (751540) di finanziamento. Joseph M. Kinsella grazie della National Science ed Engineering Research Council, la Fondazione canadese per l'innovazione, Townshend-Lamarre Family Foundation e McGill University per il loro finanziamento. Vorremmo ringraziare Allen Ehrlicher per averci permesso di utilizzare il suo reometro, Dan Nicolau per averci permesso di usare il suo microscopio confocale e Morag Park noi dell'accesso alle linee cellulari fluorescente contrassegnati.

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Cella-carichi strutture possono essere compromessa in caso di contaminazione (biologico o chimico) in qualsiasi punto nel processo. Di solito, contaminazione biologica è visto dopo due o tre giorni di cultura come un colore cambiare in terreni di coltura o la struttura di bioprinted. Di conseguenza, la sterilizzazione (disinfezione chimica e fisica) è un passo fondamentale per tutti i processi di cella. Degno di nota, gelatina di sterilizzazione in autoclave cambia le proprietà gelificanti, che ha reso più lento del gel ...

Anche se la coltura delle cellule 2D è ampiamente usato nella ricerca sul cancro, esistono limitazioni come le cellule sono coltivate in un formato monostrato con una concentrazione uniforme di nutrienti e ossigeno. Queste culture mancano importante cellula-cellula e delle interazioni cellula-matrice presentano nel microambiente tumorale nativo (TME). Di conseguenza, questi modelli ricapitolano mal condizioni fisiologiche, conseguente a comportamenti aberrante delle cellule, tra cui morfologie innaturale, recettore irregolare organizzazione, polarizzazione di membrana ed espressione genica anormale, tra l'altro condizioni1,2,3,4. D'altra parte, coltura cellulare 3D, dove le cellule vengono espansi in uno spazio volumetrico come aggregati, sferoidi o organoids, offre una tecnica alternativa per creare ambienti più accurati in vitro per studiare la fisiologia e biologia delle cellule fondamentali. Modelli di coltura cellulare 3D possono anche incoraggiare interazioni cellula-ECM che sono critiche caratteristiche fisiologiche del nativo TME in vitro1,4,5. L'emergente tecnologia 3D multimateriali fornisce possibilità per costruire modelli che simulano la TME eterogenei.
3D multimateriali deriva dalla prototipazione rapida e consente la fabbricazione di microstrutture 3D che sono in grado di alcune delle complessità della vita che imita tessuto campioni6,7. Gli attuali metodi di multimateriali includono estrusione, inkjet e laser-assistita stampa8. Fra loro, il metodo di estrusione consente l'eterogeneità essere controllata all'interno delle matrici stampate posizionando precisamente distinti tipi di materiali in diverse posizioni iniziali. Pertanto, è l'approccio migliore per fabbricare modelli eterogenei in vitro che coinvolgono più tipi di cellule o matrici. Multimateriali di estrusione sono stato utilizzato con successo per costruire auricolari sagomati ponteggi9, strutture vascolari10,11,12e della pelle tessuti13, risultante nella cella e stampa ad alta fedeltà vitalità. La tecnologia dispone anche di selezioni di materiali versatili, la possibilità di depositare materiali con cellule incorporate con una densità nota e alta riproducibilità14,15,16,17 . Idrogeli naturali e sintetici vengono spesso utilizzati come bioinks per 3D multimateriali dovuto la loro biocompatibilità, bioattività e loro reti idrofili che possono essere progettati per assomigliare strutturalmente l'ECM7,18 ,19,20,21,22,23. Idrogeli sono inoltre vantaggiosi poiché possono includere siti adesivi per cellule, elementi strutturali, permeabilità per le sostanze nutrienti e gas, e le proprietà meccaniche appropriate per incoraggiare lo sviluppo24di cella. Per esempio, collagene idrogel offrono integrina siti di ancoraggio che le cellule possono utilizzare per collegare alla matrice. Gelatina, collagene denaturato, mantiene simili siti di adesione cellulare. Al contrario, alginato è bioinerte ma fornisce integrità meccanica formando legami incrociati con gli ioni bivalenti25,26,27,28.
In questo lavoro, abbiamo sviluppato un composito idrogel come un bioink, composto di alginato e gelatina, con analogie con l'architettura microscopica di stroma del tumore nativo. Fibroblasti e cellule di cancro al seno sono stati incorporati nel caso degli idrogeli e stampato tramite un bioprinter basato su estrusione per creare un modello 3D che imita il microambiente in vivo . L'ambiente 3D derivati dal permette alle cellule tumorali di formare sferoidi multicellulari tumore (MCTS) con un alta attuabilità per lunghi periodi di coltura delle cellule (> 30 giorni). Questo protocollo viene illustrato le metodologie di sintesi di idrogeli compositi, che caratterizzano la microstruttura dei materiali e la stampabilità, modelli eterogenei cellulari multimateriali e osservare la formazione di MCTS. Queste metodologie possono essere applicate ad altri bioinks in estrusione multimateriali pure per quanto riguarda diversi disegni di modelli di tessuto eterogeneo con potenziali applicazioni in screening di farmaci, analisi di migrazione delle cellule e gli studi che si concentrano sulla cellula fondamentale funzioni fisiologiche.

<table><tbody><tr><td>Alginato di sodio</td><td>FMC Biopolimero</td><td>CAS-No: 9005-38-3</td><td>Protanal LF 10/60 FT</td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td>Gelatina di tipo B da pelle bovina</td></tr> Soluzione <tr><td>salina tamponata con fosfato di Dubelcco (DPBS 1X)</td><td>Gibco</td><td>LS14190136</td><td>1&times;, senza calcio, senza magnesio</td></tr><tr><td>Piastra riscaldante magnetica</td><td>Corning&nbsp;</td><td>N/A</td><td>Agitatore/piastra riscaldante modello PC-420</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga da 50 mL</td><td>Corning</td><td></td><td>352098 Falcon&reg; 50mL Provetta da centrifuga in PP ad alta chiarezza, fondo conico,</td></tr><tr><td>centrifuga</td> sterile <td>GMI</td><td>N/A</td><td>Sorvall RT6000D, GMI, USA</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio anidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ acqua</td><td>Millipore</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Millipore 0,22 &micro; m filters</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SB</td> Unità <td>filtro siringa Millex-GS, 0,22&nbsp; &micro; m, esteri misti di cellulosa, 33&nbsp; mm, sterilizzato con ossido di etilene</td></tr><tr><td>Reometro oscillante MCR 302</td><td>Anton Paar</td><td>N/A Strumento</td><td></td></tr><tr><td>di misura reometrico CP25</td><td>Anton Paar</td><td>79038</td><td>Geometria della piastra conica per reometro</td></tr><tr><td>RheoCompass</td><td>Anton Paar</td><td>N/A Software</td><td>di controllo del reometro MCR 302</td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a scansione</td><td>Hitachi</td><td>N/A</td><td>SEM, Hitachi SU-3500 Pressione variabile</td></tr><tr><td>Paraformaldeide, 96%, purissimo</td><td>Acros Organics</td><td>416785000</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco modified eagle medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione antibiotica/antimicotica (100X) stabilizzata</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>Fiasche per colture cellulari T-75</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430641</td><td>75 cm2 Trattamento superficiale TC-Trattato</td></tr><tr><td>Bioprinter 3D BioScaffolder 3.1</td><td>GeSiM</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Software GeSim</td><td>GeSiM</td><td>N/A</td><td>Software di controllo BioScaffolder 3.1</td></tr><tr><td>cartuccia da 10 cc resistente ai raggi UV</td><td>EFD Nordson</td><td>7012126</td><td></td></tr><tr><td>Tappo terminale</td><td>EFD Nordson</td><td>7014472</td><td></td></tr><tr><td>Tappo punta</td><td>EFD Nordson</td><td></td><td></td>7014469</tr><tr><td>Pistone&nbsp;</td><td>EFD Nordson</td><td>7012182</td><td></td></tr><tr><td>Ugello in acciaio inox G25</td><td>EFD Nordson</td><td>7018345</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>VWR</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>Bioreagente, per biologia molecolare</td></tr><tr><td>Costar Piastre a 6 pozzetti&nbsp;</td>Piastre a pozzetti multipli <td>trattate con TC Corning</td><td>3516</td><td>, confezionate singolarmente, sterili</td></tr><tr><td>Microscopio invertito a disco rotante confocale</td><td>Olympus Life Science</td><td>N/A</td> Kit di test <td>Olympus IX83</td></tr><tr><td>MTS</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td>CellTiter 96&reg; AQueous&nbsp; Saggio di proliferazione cellulare in una soluzione&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit di citotossicità di vitalità viva/morta</td><td>Sonde molecolari, ThermoFisher Scientific</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 0,25/EDTA 1X</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Piastra Corning a 96 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3595</td><td>Micropiastra in polistirene trasparente a fondo piatto trattato con TC, confezionata singolarmente, con coperchio a bassa evaporazione,</td></tr><tr><td>autoclave sterile Tuttnauer</td><td>Heidolph Brinkmann</td><td>N/A</td><td>Heidolph Tuttnauer 2540E Autoclave Sterilizzatore Modello Elettronico con 4 Vassoi in Acciaio Inox, Capacità 23L</td></tr><tr><td>Trypan blu</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>T10282</td><td>Soluzione allo 0,4%</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Alcoli commerciali</td><td>P016EA95</td><td>Alcoli speciali Greenfield</td></tr> CO<tr><td>2 Incubatore</td><td>Panasonic</td><td>N/A</td><td>MCO 19AIC-PA</td></tr><tr><td>Liofilizzatore&nbsp;</td><td>SP Scientific</td><td>N/A</td><td>Virtis Sentry 2.0</td></tr><tr><td>SolidWorks</td><td>Dassault Systems</td><td>N/A</td><td>Software CAD utilizzato per costruire un modello dimostrativo simile a un'elica</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Il software di programmazione MathWorks</td><td>N/A</td><td>utilizzato per generare il codice G per BioScaffolder 3.1</td></tr></tbody></table>

bioprintable alginato/gelatina idrogel 3d in vitro sistemi modello inducono la formazione di sferoide di cella

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

L'eterogeneità di cellulare, biochimico e biofisico del microambiente tumorale nativo non è ricapitolata dalla crescente linee cellulari di cancro immortalizzate mediante coltura convenzionale cellulare bidimensionale (2D). Queste sfide possono essere superate utilizzando tecniche multimateriali per costruire modelli eterogenei tridimensionale (3D) del tumore per cui sono incorporati diversi tipi di cellule. Alginato e gelatina sono due dei più comuni biomateriali impiegati in multimateriali dovuto la loro biocompatibilità, biomimicry e proprietà meccaniche. Combinando i due polimeri, abbiamo raggiunto un idrogel composito bioprintable con analogie con l'architettura microscopica di stroma del tumore nativo. Abbiamo studiato la stampabilità di idrogel composito tramite reologia ed abbiamo ottenuto la finestra di stampa ottima. Fibroblasti e cellule di cancro al seno sono stati incorporati nel caso degli idrogeli e stampati per formare un modello 3D che imita il microambiente in vivo . Il modello eterogeneo di bioprinted raggiunge un'alta redditività per colture cellulari a lungo termine (> 30 giorni) e promuove l'auto-assemblaggio delle cellule di cancro al seno in sferoidi multicellulari tumore (MCTS). Abbiamo osservato la migrazione e l'interazione delle cellule del cancro-collegata del fibroblasto (CAFs) con il MCTS in questo modello. Utilizzando piattaforme di cultura cellulare bioprinted come sistemi di co-coltura, offre uno strumento unico per studiare la dipendenza della tumorigenesi sulla composizione dello stroma. Questa tecnica presenta un alto-rendimento, basso costo e alta riproducibilità, e può anche fornire un modello alternativo per colture monostrato cellulare convenzionale e modelli animali del tumore per lo studio di biologia del cancro.

Lo sweep di temperatura Mostra una netta differenza del precursore A3G7 a 25 ° C e 37 ° C. Il precursore è liquido a 37 ° C ed ha una viscosità complessa di 1938.1 ± 84,0 mPa x s, che viene convalidato da un G maggiore "sopra G'. Come la temperatura diminuisce, il precursore subisce gelificazione fisica dall'impigliamento fisica spontanea delle molecole gelatina in un tri-elica formazione29,30. Entrambi i G' e G "aumentare e conve...

Abbiamo sviluppato un modello di cancro al seno eterogeneo costituito da cellule del tumore e del fibroblasto immortalate incorporate in un bioink di alginato/gelatina bioprintable. Il modello ricapitola il microambiente tumorale in vivo e facilita la formazione di sferoidi multicellulari tumore, producendo la comprensione dei meccanismi di tumorigenesi di guida.

Bioprintable alginato/gelatina idrogel 3D In Vitro sistemi modello inducono la formazione di sferoide di cella

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia del cancro, come la formazione del tumore, il monitoraggio della migrazione cellulare e la segnalazione del cancro e delle cellule sane. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ci permette di studiare la tumorigenesi in un ambiente 3D insieme alle cellule stromali, come i fibroblasti, con un basso costo e un'alta riproducibilità. È importante assicurarsi che i materiali siano sia biostampabili che biofunzionali, il che richiede uno studio quantitativo delle sue proprietà reologiche e della compatibilità cellulare.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di preparazione dell'idrogel e di miscelazione dell'idrogel cellulare sono difficili da apprendere perché la formazione delle bolle interferisce con la fedeltà del modello stampato. In una cabina di biosicurezza, mescolare tre grammi di alginato e sette grammi di gelatina in polvere in un becher da 250 millilitri. Aggiungere un agitatore magnetico e 100 millilitri di DPBS.Sigillare il becher con pellicola di paraffina sterile e un foglio di alluminio per evitare contaminazioni. Quindi mostra al partecipante i gra

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Il seguente protocollo fornisce tecniche per l'incapsulamento pancreatiche β-cellule in fase di crescita PEG-peptide idrogel formati da tiolo-ene foto-click reazioni. Questa piattaforma materiale non solo offre un microambiente cytocompatible per l'incapsulamento delle cellule, ma anche controllato dall'utente consente un rapido recupero delle strutture cellulari formano all'interno dei idrogel.

Generazione e recupero dei β-cellule Spheroids dal passaggio di crescita PEG-peptide idrogel

Un bioprinter stato usato per creare idrogel patterned basato su uno stampo sacrificale. Lo stampo poloxamer stata riempita con un secondo idrogel e quindi eluita, lasciare vuoti che sono stati riempiti con una terza idrogel. Questo metodo utilizza eluizione veloce e buona stampabilità di polossalene di generare architetture complesse di biopolimeri.

La stampa termosensibile Stampi inversa per la Creazione di Patterned idrogeli a due componenti per coltura cellulare 3D

Qui, descriviamo un protocollo rapido e flessibile per la formazione di sferoidi cellulari 3D attraverso l'aggregazione cellulare. Questo è facilmente adattabile a più tipi di cellule ed è adatto per l'uso in una varietà di applicazioni, tra cui la migrazione cellulare, l'invasione o i saggi anoikis e per l'imaging e la quantificazione delle interazioni cellula-matrice.

Un metodo delle celle di aggregazione efficiente e flessibile per il 3D Spheroid Produzione

Questo protocollo descrive la fabbricazione di microcryogels elastico 3D macroporosa integrando microfabbricazione con tecnologia cryogelation. Durante il caricamento con cellule, microtissues 3D vengono generati, che possono essere facilmente iniettate in vivo per facilitare la terapia rigenerativa o assemblati in matrici per in vitro screening di farmaci di alto-rendimento.

Microtissues 3D per la terapia rigenerativa iniettabile e droga di High-throughput Screening

Presentato qui è un metodo per la biostampa 3D di gelatina methacryloyl.

Protocolli di biostampa 3D di Gelatin Abasecryloyl Hydrogel Based Bioinks

L'obiettivo di questo protocollo è quello di biostampare direttamente le cellule epiteliali del seno come sferoidi multicellulari su reti endoteliali pre-formate per creare rapidamente modelli di co-coltura endoteliale del seno 3D che possono essere utilizzati per studi di screening farmacologico.

Biostampa diretta di Sferoidi mammari multicellulari 3D su reti endoteliali

Il presente protocollo descrive una tecnica per produrre sferoidi tissutali su larga scala in modo economico utilizzando un dispositivo simile a un timbro stampato in 3D.

Generazione di sferoidi tissutali tramite un dispositivo simile a un timbro stampato in 3D

La lavorazione a taglio durante la formazione di idrogel provoca la produzione di sospensioni di microgel che si tagliano sottili ma si ristrutturano rapidamente dopo la rimozione delle forze di taglio. Tali materiali sono stati utilizzati come matrice di supporto per la bioprinting di strutture complesse e cariche di cellule. Qui vengono descritti i metodi utilizzati per produrre il letto di supporto e i bioink compatibili.

Gel fluidi di agarosio formati dalla lavorazione a taglio durante la gelificazione per la bioprinting 3D sospesa

Qui, presentiamo un protocollo che consente la fabbricazione rapida, robusta ed economica di sferoidi tumorali seguita dall'incapsulamento dell'idrogel. È ampiamente applicabile in quanto non richiede attrezzature specializzate. Sarebbe particolarmente utile per esplorare le interazioni sferoide-matrice e costruire modelli di fisiologia o patologia tissutale in vitro .

Fabbricazione e incapsulamento di sferoidi tumorali in idrogel di polietilenglicole per lo studio delle interazioni sferoide-matrice

Questo studio presenta una metodologia economica ed efficiente per generare strutture cellulari 3D utilizzando un sistema basato su timbri per creare micropozzetti in stampi di agarosio. Il sistema promuove la formazione di sferoidi/organoidi uniformi, migliorando così le interazioni cellulari. Questo approccio riduce la variabilità sperimentale e supporta le applicazioni nei test sui farmaci e nell'ingegneria tissutale.

Generazione di sferoidi/organoidi tridimensionali da colture cellulari bidimensionali utilizzando un nuovo dispositivo di timbro

Scopri la biostampa di idrogel alginato/gelatina per modelli tumorali 3D con cellule MDA-MB-231 e fibroblasti. Questo metodo economico e riproducibile facilita la formazione di sferoidi multicellulari e lo studio delle interazioni tumorali.

Bioprintable alginato/gelatina idrogel 3D In Vitro sistemi modello inducono la formazione di sferoide di cella

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