Una combinatoria unicellulare approccio per la caratterizzazione molecolare e Immunophenotypic eterogeneità del tronco umano e popolazioni di cellule progenitrici
25 ottobre 2018
Alla rinfusa gene espressione misure nube singola cella differenze nelle popolazioni eterogenee delle cellule. Qui, descriviamo un protocollo per analisi di espressione genica e l'indice come unicellulare ordinano di Florescence attivato Cell Sorting (FACS) possa essere combinato per delineare eterogeneità e immunophenotypically caratterizzare popolazioni molecolarmente distinte delle cellule.
Questo metodo può rispondere a domande chiave nei campi delle cellule staminali e del cancro, come l'eterogeneità delle cellule staminali e come la terapia nelle cellule tumorali sensibili può essere isolata. Il principale vantaggio di questo studio è che combina un'analisi dell'espressione genica a una cellula tecnicamente robusta insieme alla vaccinosi per un'ulteriore caratterizzazione a valle delle sottopopolazioni bersaglio. Sebbene questo metodo possa essere usato per indagare il cancro e l'eterogeneità delle cellule staminali, può anche fornire approfondimenti sul potenziale di adescamento e lignaggio genico.
Per iniziare il protocollo, su una panchina priva di RNA/DNA, preparare abbastanza tampone di lysis per 96 pozzi con il 10% in più mescolando 390 microlitri acqua senza nucleasi, 17 microlitri del 10%NP-40, 2,8 microlitri 10 dNTP millimolare, 10 microlitri 0,1 DTT molare e 5,3 microlitri inibitore della RNAse. Vortice e spin lungo il tubo. Successivamente, distribuire quattro microlitri di tampone di lisi a ciascun pozzo di una piastra PCR da 96 po 'e sigillare le piastre con pellicola adesiva.
Girare verso il basso le piastre per raccogliere il liquido nella parte inferiore. Tenere le piastre sul ghiaccio fino allo smistamento cellulare per un massimo di 24 ore. Una volta che la macchina FACS è stata configurata correttamente, eseguire la rianalisi della popolazione target ordinando almeno 100 celle bersaglio in un nuovo tubo di microcentrifugo con 100 microlitri di tampone di macchie.
Facs analizza le celle ordinate registrando il campione ordinato e assicurati che finiscano nel gate di ordinamento. Quindi impostare lo smistamento della piastra a cella singola centrando la goccia nel pozzo A1 nella piastra da 96 poggia. Quando è centrato, ordinare particelle da 50 a 106 micrometri in tutti i pozzi intorno al bordo di una piastra vuota da 96 po 'per assicurarsi che tutti i pozzi otteniamo una cella al centro di ogni pozzo.
Rimuovere la pellicola adesiva dalle piastre. Ordinare una singola cella di Lin-CD34 più CD38 meno celle in 92 dei 96 pozzi. Attivare l'ordinamento dell'indice nel software di ordinamento FACS per salvare il profilo immunofenotipico per CD45RA, CD49F e CD90 per ogni singola cella.
Ordinare due pozzi con rispettivamente 10 e 20 celle per i controlli di linearità nell'amplificazione PCR. Di solito vengono utilizzati pozzi H1 e H2. Tenere due pozzi senza celle come nessun controllo modello, di solito pozzi H3 e H4. Sigillare le piastre con pellicola adesiva chiara e ruotare le piastre a 300 volte la gravità per un minuto.
Snap congelare le piastre sul ghiaccio secco. Quindi conservali a meno 80 gradi Celsius. Effettuare la trascrizione inversa e una specifica combinazione di amplificazione del bersaglio aggiungendo 632,5 microlitri di mix di reazioni due volte, 101,2 microlitri Taq/SuperscriptIII, 151,8 microlitri primer mix e 0,7 microlitri chiodati nell'RNA di controllo.
Vortice la soluzione e girarlo verso il basso per raccogliere il liquido nella parte inferiore del tubo. Mantenere il mix sul ghiaccio fino a quando non è pronto per essere aggiunto al campione. Quindi, scongelare le piastre di lysate sul ghiaccio.
Aggiungere 8,75 microlitri della trascrizione inversa precedentemente preparata e un mix specifico di amplificazione del bersaglio a 92 pozzi, inclusa la linearità e nessun controllo modello. Aggiungere 8,75 microlitri senza mix di controllo della trascrizione inversa ai quattro pozzi rimanenti. Quindi sigillare le piastre con pellicola adesiva trasparente e ruotare le piastre per raccogliere il liquido nella parte inferiore.
Eseguire la trascrizione inversa e l'amplificazione specifica del bersaglio eseguendo la piastra in una macchina PCR in base al programma di preamplificazione. Preparare la piastra di carico del test tubazionando tre microlitri di reagente di carico del saggio su ogni pozzo di una piastra da 96 poggia. Aggiungere tre microlitri di ogni primer ai singoli pozzi nella piastra di carico del saggio.
Sigillare la piastra con pellicola adesiva e girarla verso il basso. Dopo aver filato la piastra, preparare la piastra di diluizione pipettando otto microlitri di acqua priva di nucleasi in tutti i pozzi di una piastra da 96 porri. Aggiungere due microlitri di campione amplificato alla piastra di diluizione.
Sigillare la piastra con pellicola adesiva. Mescolare vortice la piastra per 10 secondi. Quindi gira giù per il piatto.
Successivamente, preparare la miscela di caricamento del campione mescolando con cura 352 microlitri di master mix con 35,2 microlitri di reagente di caricamento del campione. Preparare la piastra di carico del campione aliquotando 3,3 microlitri di miscela di carico ad ogni pozzo di una piastra da 96 poggia. Aggiungere 2,7 microlitri dal campione diluito in ogni pozzo della piastra di carico del campione.
Sigillare la piastra con pellicola adesiva e girarla verso il basso. Eserti un nuovo chip 96 per 96 microfluidico. Preparare le insenature frugandole con una siringa con un cappuccio per assicurarsi che possano essere spostate.
Aggiungere l'intero volume delle siringhe a ciascuna valvola inclinando il truciolo a 45 gradi e premendo la valvola. Innescare il chip con il controller IFC. Caricare ogni ingresso di dosaggio con 4,25 microlitri da ciascuno dei pozzi nella piastra di carico del saggio ed evitare bolle.
Se le bolle appaiono nel pozzo, rimuoverle con una punta di pipetta. Continuare a caricare ogni ingresso del campione con 4,25 microlitri da ciascuno dei pozzi nella piastra di caricamento del campione, evitando bolle e se appaiono bolle rimuoverli con una punta di pipetta. Caricare il chip con il controller Integrated Fluidics Circuit o IFC.
Controllare che il chip abbia un aspetto uniforme e che tutte le camere siano state caricate. Rimuovere la polvere dalla superficie del truciolo toccandolo con del nastro adesivo. Infine, eseguire il chip nella piattaforma di espressione genica microfluidica multiplex.
Una mappa termica di una corsa riuscita mostra l'espressione distribuita uniformemente tra i campioni con un segnale forte di circa sette-25 CT. Questa curva di amplificazione dell'RNA a picco nel controllo verifica che tutti i pozzi abbiano una chiara espressione di circa 10 CT con poca o nessuna variazione, convalidando che le reazioni di pre-amplificazione e qPCR avevano avuto successo per tutte le cellule. L'analisi dei componenti principali o PCA che visualizza le somiglianze tra i gruppi cellulari usando la riduzione delle dimensioni può essere utile per distinguere gruppi di cellule molecolarmente distinte l'una dall'altra identificando quattro sottogruppi.
Per identificare l'immunofenotipo di cellule provenienti da diversi ammassi molecolari, caricare il file FCS indice in FlowJo. Aprire l'editor di script e incollare lo script di indice, premere Esegui. Ogni cella sarà ora in un cancello separato.
Aggiungere ogni cella nell'editor di layout e colorarle in base al raggruppamento definito molecolarmente da SCXV disponibile nel file sample_complete_data.xls. I grafici FACS mostrano l'espressione del marcatore della superficie cellulare per i marcatori di cellule staminali ematopoietiche CD90 e CD45RA che possono essere utilizzati per discriminare tra i cluster e isolarli per l'analisi funzionale. Seguendo questa procedura, altre tecniche come il sequenziamento dell'RNA di sottopopolazioni appena scoperte o esperimenti in vitro e in vivo possono essere eseguite per rispondere a domande aggiuntive come quale meccanismo molecolare causa questa eterogeneità e come la sottopopolazione differisce funzionalmente.
Questa strategia ha spianato la strada ai ricercatori non solo per studiare l'eterogeneità nell'ematopoiesi normale e maligna, ma può anche essere utilizzata per isolare prospetticamente le sottopopolazioni scoperte per studiarle ulteriormente.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo che combina l'analisi dell'espressione genica a singola cellula con il sorting cellulare attivato da fluorescenza (FACS) per esplorare l'eterogeneità nelle popolazioni cellulari. L'obiettivo è caratterizzare tipi cellulari molecolarmente distinti, in particolare nel contesto delle cellule staminali e del cancro.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Biologia cellulare
- Neuroscienze
- Ricerca sul cancro
Background
- Le misurazioni dell'espressione genica su larga scala possono oscurare le differenze tra singole cellule.
- Comprendere l'eterogeneità delle cellule staminali è fondamentale per i progressi terapeutici.
- La FACS consente l'isolamento di popolazioni cellulari specifiche per analisi dettagliate.
- Questo metodo fornisce informazioni sul priming genico e sul potenziale di linea cellulare.
Scopo dello studio
- Per delimitare l'eterogeneità nelle popolazioni cellulari.
- Per caratterizzare immunofenotipicamente tipi cellulari distinti.
- Per studiare gli effetti delle terapie su cellule tumorali sensibili.
Metodi Utilizzati
- Preparazione del buffer di lisi per l'analisi a singola cellula.
- Utilizzo della citometria a flusso attivata da fluorescenza (FACS).
- Analisi dell'espressione genica a singola cellula.
- Caratterizzazione successiva di sottopopolazioni bersaglio.
Risultati Principali
- Il metodo rivela in modo efficace l'eterogeneità delle cellule staminali.
- Permette l'isolamento di specifiche popolazioni di cellule tumorali.
- Sono state ottenute informazioni sul priming genico e sul potenziale di linea.
- Il protocollo è tecnicamente robusto e riproducibile.
Conclusioni
- Questo approccio migliora la comprensione della diversità cellulare.
- Ha potenziali applicazioni sia nella ricerca sulle cellule staminali che in quella sui tumori.
- La combinazione di tecniche fornisce un'analisi completa delle popolazioni cellulari.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Direttiva
Questo approccio combinatorio a singola cellula affronta un collo di bottiglia fondamentale nella ricerca sulle cellule staminali e sui tumori, mantenendo la risoluzione a livello di singola cellula durante il profilo molecolare, consentendo un'identificazione precisa di sottopopolazioni rare responsabili della resistenza terapeutica o della differenziazione linfatica. Collegando marcatori immunofenotipici a profili di espressione genica con risoluzione a singola cellula, il metodo aumenta la sicurezza nella validazione degli obiettivi e supporta la riduzione del rischio meccanicistica nei primi stadi dei processi di scoperta. L'approccio fornisce un flusso di lavoro scalabile e riproducibile per generare dati quantitativi multimodali che informano le decisioni di avanzamento o interruzione nella priorizzazione degli obiettivi e nell'identificazione dei candidati promettenti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biofarmaci
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche risolvendo l'eterogeneità molecolare e immunofenotipica nelle popolazioni di cellule staminali e progenitrici.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale dei bersagli mediante la correlazione dell'espressione dei marcatori di superficie con pannelli genici preselezionati, riducendo i falsi positivi nella selezione dei bersagli.
- Valore predittivo: Facilita l'identificazione di sottopopolazioni molecolarmente distinte per l'isolamento successivo, migliorando l'affidabilità delle valutazioni sul potenziale di linea e sul priming genico.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera dati quantitativi standardizzati di espressione genica associati al sorting FACS con indice, consentendo uno screening riproducibile degli stati molecolari attraverso popolazioni cellulari.
- Scalabilità: Compatibile con formati a 96 pozzetti e piattaforme microfluidiche, supporta lo screening di media capacità di pannelli genici predefiniti in campioni umani primari.
- Riproducibilità: Riduce al minimo la variabilità tecnica mediante la lisi cellulare singola in tampone e i passaggi di pre-amplificazione, garantendo un rilevamento costante di trascritti a bassa abbondanza.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Consente l'isolamento prospettico di sottopopolazioni definite a livello molecolare per la validazione funzionale in vitro e in vivo, collegando la scoperta allo sviluppo preclinico.
- Allineamento del biomarcatore: Permette l'identificazione di firme di marcatori di superficie correlate a cluster molecolari, facilitando lo sviluppo di biomarcatori traslazionali per la stratificazione dei pazienti.
- Progressione aggiustata per il rischio: Fornisce informazioni meccanicistiche sulla eterogeneità che orientano la selezione dei modelli preclinici e riducono il rischio biologico in fase avanzata dello sviluppo terapeutico.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta consentendo un'analisi ad alta risoluzione di popolazioni eterogenee prima dell'identificazione del capostazione, in particolare nei tumori derivati da cellule staminali e nei programmi di medicina rigenerativa. Esso configura la caratterizzazione molecolare e fenotipica come una capacità continua e riutilizzabile piuttosto che come un saggio unico, sostenendo un affinamento iterativo del bersaglio.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi biologici collegando l'espressione genica a livello di singola cellula ai profili immunofenotipici, consentendo una riduzione del rischio biologico dei bersagli nei contesti ematopoietici e oncogenici.
- Screening: Fornisce output quantitativi pronti per il saggio a partire da cDNA preamplificato, facilitando il confronto affidabile degli stati molecolari tra singole cellule ordinate.
- Analisi: Permette l'analisi delle componenti principali (PCA) e la visualizzazione tramite mappa termica per identificare cluster molecolari e correlarli con l'espressione dei marcatori di superficie al fine di discriminare le sottopopolazioni.
- Ricerca traslazionale: Collega il raggruppamento molecolare alla validazione funzionale mediante l'isolamento mirato di sottopopolazioni per successivi sequenziamenti dell'RNA o saggi in vivo.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un protocollo standardizzato per l'analisi multiplex a livello di singola cellula, adattabile a diversi sistemi modello e aree terapeutiche, riducendo lo sviluppo metodologico ridondante.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi risolvendo l'eterogeneità molecolare mascherata nelle analisi di massa.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso protocolli standardizzati di lisi, preamplificazione e qPCR, compatibili con le infrastrutture esistenti di FACS e microfluidica.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo l'identificazione precoce di sottopopolazioni funzionalmente rilevanti, riducendo gli investimenti su obiettivi non sostenibili.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione adeguata al rischio fornendo una giustificazione meccanicistica per far progredire popolazioni molecolarmente definite verso la validazione preclinica.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'ordinamento FACS con indice, nella manipolazione di singole cellule e nelle piattaforme di qPCR microfluidiche.
- Dipende dall'accesso a ordinatori cellulari attivati da fluorescenza dotati di capacità di ordinamento con indice e a sistemi microfluidici per l'espressione genica.
- Necessita di standardizzazione tra i gruppi di lavoro per la preparazione del buffer di lisi, le strategie di gating nell'ordinamento e i flussi di analisi dati.
- L'adattamento a sistemi non ematopoietici potrebbe richiedere l'ottimizzazione dei pannelli di marcatori di superficie e delle condizioni di lisi.
- I limiti pratici includono vincoli di produttività legati alla velocità di ordinamento e al caricamento delle chip microfluidiche, rendendo questo approccio più adatto per pannelli mirati piuttosto che per lo screening dell'intero trascrittoma.
