Name: Espressione e purificazione dei canali ionici di mammiferi Bestrophin (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Impara l'espressione e la purificazione dei canali ionici Bestrophin di mammiferi utilizzando cellule HEK293F. Questo metodo consente studi in vitro sulla biologia dei canali ionici e sulle malattie retiniche.

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Questo progetto è stato finanziato da sovvenzioni NIH EY025290, GM127652 e Università di Rochester finanziamento di Start-up.

1. produzione BacMam espressione Baculoviridae
<ol><li>Inserire la sequenza di codificazione di una proteina desiderata bestrophin mammiferi il piolo BacMam vector18 con una sequenza di riconoscimento della proteasi Tobacco Etch Virus (TEV), seguita da un GFP-10 x His-tag al C-terminale della proteina.</li>
	<li>Transitoriamente transfect il plasmide di espressione in adesivo HEK293 cellule19,20,21,22,23. Verificare che l'espressione della proteina GFP-fusione sotto un microscopio a fluorescenza con 10 X o 20 ingrandimenti, una sorgente di eccitazione 488 nm e un filtro di emissione 510 nm (Figura 1A). Nota: A base di polimeri transfezione è effettuata ordinariamente con 1 μg di DNA del plasmide per un piatto di 35 mm di cellule HEK293.</li>
	<li>Produrre i Baculoviridae in cellule di insetto Sf9 come precedentemente descritto16,17. Nota: Il passaggio 3 (P3) virus, che verrà utilizzato per infettare le cellule HEK293-F per la produzione di proteine, può essere memorizzato a 4 ° C per 1 mese.</li>
	<li>Determinare il titolo (unità infettive) del virus P3 la placca formazione dosaggio16,17. Nota: Come la proteina di interesse è etichettata con GFP, un metodo più veloce per il controllo di unità infettive è di infettare le cellule Sf9 con diluizioni seriali del virus e contare il numero di cellule fluorescenti dopo 48 h.</li>
</ol>2. espressione della proteina
<ol><li>Mantenere le cellule HEK293-F in una cultura di sospensione con il mezzo di espressione HEK293-F in un incubatore a 37 ° C con 8% CO2. Utilizzare matracci di cultura usa e getta che sono 2 - 2,5 volte più grande rispetto al volume di cultura e ruotare la cultura su una piattaforma orbitale a 135 giri/min. Nota: Si consiglia di infettare le cellule quando essi sono tra i passaggi 5 e 30 e per eseguire queste azioni sotto una cappa di cultura cellulare.</li>
	<li>24 h prima dell'infezione virale, aggiungere 15 μL di Trypan blu ad un'aliquota di 15 μL di coltura cellulare e controllare la densità delle cellule e l'attuabilità utilizzando un emocitometro sotto un microscopio. Diluire le cellule a 0,6 x 106 cellule/mL in beute di 2 x 2 L ciascuna, con 500 mL di terreno pre-riscaldato a 37 ° C. Nota: Le cellule morte sono macchiate blu di Trypan blue. L'attuabilità delle cellule desiderata è &gt; 95%.</li>
	<li>Il giorno di infezione, controllare la densità delle cellule e l'attuabilità (punto 2.2). Nota: Un alta attuabilità delle cellule di &gt; 95% è essenziale per l'efficace espressione della proteina e di infezione. La densità di cella prevista è ~1.0 x 106 cellule/mL (adulto pernottamento da 2 x 500 mL 0,6 x coltura cellulare di 106 cellule/mL). Il numero totale previsto di celle è ~1.0 x 109.</li>
	<li>Aggiungere i Baculoviridae P3 le cellule ad una molteplicità di infezione (MOI) di 5. Per determinare la quantità di virus per inoculare, utilizzare la seguente equazione: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57832/57832eq1.jpg">
</li>
	<li>Agitare le cellule sulla piattaforma orbitale a 135 giri/min in un incubatore umidificato 37 ° C con 8% CO2 per 24 h.</li>
	<li>Aggiungere 10 mM del butirrato del sodio alla coltura delle cellule e continuare in incubazione per 48 h. Nota: Per alcune proteine, riducendo la temperatura di coltura cellulare a 30 ° C dopo l'aggiunta di sodio butirrato può migliorare espressione e stabilità.</li>
	<li>Microscopio a fluorescenza con 10x o 20x ingrandimento, una sorgente di eccitazione 488 nm e un filtro di emissione 510 nm, controllare la percentuale e la luminosità delle cellule verdi, che rappresentano direttamente la resa di proteina (bestrophin-GFP-10xHis) (Figura 1B). Nota: La percentuale di cellule verde viene calcolata da: 100 x (cellule cellule verde/totale). Livello di espressione di proteine buona è indicato forte fluorescenza verde sotto il microscopio.</li>
	<li>Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 1.000 x g a 4 ° C per 20 minuti rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare con tampone fosfato salino (PBS) ad un volume finale di ~ 80 mL. Split la sospensione cellulare in provette coniche da 2 x 50 mL e centrifugare a 1.000 x g a 4 ° C per 20 min. memorizzare il pellet di cellule a-80 ° C.</li>
</ol>3. protein Purification
<ol><li>Incubare le provette coniche contenente il pellet cellulare in un bagnomaria agitazione a temperatura ambiente per 10-15 min, in modo che si sciolga. Risospendere le cellule in volume (p/v), del buffer A (tabella 1) (ad es., 10 g di palline delle cellule in 20 mL di tampone), completati con inibitori della proteasi (fluoruro di aprotinina, leupeptina, Pepstatin A e phenylmethylsulfonyl): 2x a 0.1-1.0 mM. Dispensare su e giù estesamente per ottenere una sospensione cellulare omogenea.</li>
	<li>Lisare le cellule utilizzando un omogeneizzatore ad alta pressione. Eseguire la sospensione cellulare attraverso l'omogeneizzatore a 7-10 MPa per un totale di 3 - 4 volte per ottenere la completa omogeneizzazione. Mantenere la cella lysate sul ghiaccio per 2-3 minuti tra un round.</li>
	<li>Aggiungere detersivo [ad es., 2% w/v sol-grado n-dodecil-β-D-Maltopyranoside (DDM)] il lysate delle cellule. Incubare con agitazione per 1 h a 20 ° C a estrarre le proteine di membrana. Nota: Il tipo di detergente deve essere ottimizzato per ogni proteina bersaglio18,24.</li>
	<li>Centrifugare a 150.000 x g in un'ultracentrifuga a 4 ° C per 1 h. Nota: Tutte le seguenti operazioni vengono eseguite a 4 ° C.</li>
	<li>Raccogliere il lysate delle cellule chiare e il flusso attraverso una colonna di affinità 5ml - NTA2 +alla sua trappola Ni equilibrato con buffer A (tabella 1). Nota: Dopo la centrifugazione, il lysate delle cellule chiaro verrà essere inserita tra una pallina nella parte inferiore e uno strato nuvoloso sulla parte superiore. Utilizzare una pipetta di trasferimento di 10 mL per raccogliere con cura il chiaro lisato e quindi passare a una pipetta da 1 mL per l'ultimo pochi millilitri di lisato. Evitare il pellet, che possa ostruire la colonna2 + Ni; Tuttavia, una piccola quantità di strato superiore va bene o può essere filtrata con un filtro di 1,5 μm.</li>
	<li>Lavare la colonna con 25 mL di tampone B e poi 40 mL di tampone C (tabelle 2 e 3, rispettivamente). Nota: Questo è un buon posto per prendere una pausa, come purificazione completa può richiedere fino a 12 h e la proteina può rimanere stabile mentre è collegato alla colonna durante la notte.</li>
	<li>Fissare la colonna a un sistema di cromatografia in fase liquida (FPLC) proteine veloci ed eluire la proteina dalla colonna con 13 mL di tampone D (tabella 3) con il frazionamento. Raccogliere le frazioni proteici secondo la lettura di assorbanza UV. Nota: The FPLC condizioni sono le seguenti: un formato di frazione 1,0 mL, un allarme di pressione pre-colonna impostato su 0,3 MPa e una portata di 0,5 mL/min.</li>
	<li>Misurare la concentrazione di prodotto proteine eluite su uno spettrofotometro di microvolume. Leggere l'assorbanza a 280 nm.</li>
	<li>(Opzionale) Per rimuovere il tag di GFP-10xHis, aggiungere la proteasi TEV in un rapporto di 1:1 massa e incubare a 4 ° C per 30 min. Nota: Il tag può o non può influenzare la funzione o la struttura del canale purificato. Calcolare la quantità TEV dal volume e la concentrazione della proteina raccolta da passaggi 3.7-3.8. Per esempio, se 10 mL di prodotto di eluizione è raccolto e misurato a 0,1 mg/mL, la proteina totale massa è 10 x 0,1 = 1 mg e 1 mg di TEV verrà utilizzato per la digestione.</li>
	<li>Concentrare la proteina con un 15 mL centrifuga (50 o 100 kDa) unità filtro di filatura a 4.000 x g a 4 ° C fino ad un volume finale di 400-500 μL (per un ciclo di caricamento del campione 2 mL su FPLC). Nota: Il tempo di centrifugazione per concentrazione varia a seconda della concentrazione e il formato della proteina. Per evitare l'eccessiva concentrazione, che può causare precipitazione della proteina, gira per 10 min in un primo momento, poi osservare il volume residuo e stimare il tempo per un giro successivo (ad es., 2-5 min), e così via, per ottenere il volume finale. Pipettare tra spin per disperdere la proteina, che è tirata verso il basso del filtro.</li>
	<li>Trasferire la proteina concentrata per un nuovo 1,5 mL tubo e rimuovere qualsiasi precipitato o bolle dal prodotto concentrato. Rotazione a &gt; 12.000 x g per 5-10 min a 4 ° C e raccogliere il surnatante in una nuova provetta da 1,5 mL.</li>
	<li>Caricare il prodotto finale con una siringa da 1 mL e un ago di turno-punta su un sistema FPLC per la cromatografia di esclusione dimensionale con una colonna di esclusione dimensionale equilibrata con buffer E (tabella 5). Nota: The FPLC condizioni sono le seguenti: un formato di frazione di 0,5 mL, un allarme di pressione pre-colonna impostata su 2,50 MPa, un volume di flusso impostato a 30 mL di tampone E (tabella 5), e una portata impostata su 0,5 mL/min.</li>
	<li>Si noti che proteine ben educati eseguire come picco singolo (Figura 2A) e raccolgono il fraction(s) della proteina corrispondente a quel picco (Figura 2A).</li>
	<li>Concentrare la proteina con un'unità di filtro centrifugo da 4 mL o 0,5 mL (della linea di demarcazione peso molecolare stesso come descritto al punto 3.10) e spin a 4.000 x g a 4 ° C per una concentrazione finale di 5-10 μg/μL. Utilizzare lo spettrofotometro per controllare la concentrazione del prodotto finale (punto 3.8). Nota: Tempo di centrifugazione varia, come il volume del prodotto finale può differire tra le prove di purificazione. Solitamente, centrifugazione prende 10-20 min. Si raccomanda di dispensare tra spin per disperdere la proteina, che è tirata verso il basso del filtro.</li>
	<li>Trasferire le proteine concentrate in una nuova provetta da 1,5 mL. Rimuovere qualsiasi precipitato mediante centrifugazione a &gt; 12.000 x g per 5-10 min a 4 ° C. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 mL. 10 aliquote del μL per la conservazione a-80 ° C e risparmia un 2-5 μL piccola aliquota per eseguire su un gel di SDS-PAGE 4-15% pendenza a 9 V/cm (Figura 2B).</li>
	<li>Confermare l'identità della proteina purificata di spettrometria di massa8. Nota: Analisi In vitro della funzione e della struttura della proteina purificata può essere eseguite attraverso il doppio strato lipidico planare e cristallografia a raggi x, rispettivamente5,8.</li>
</ol>

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<li>Sun, W., Zheng, W., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+discovery+and+development+for+rare+genetic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Genetics+Part+A%22%5BJournal%5D)">Drug discovery and development for rare genetic disorders.</a> American Journal of Medical Genetics Part A. 173 (9), 2307-2322 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo descrive una pipeline utile per espressione e purificazione dei canali ionici bestrophin mammiferi da utilizzare per le analisi future in vitro . Mentre il dispositivo FPLC è richiesto per la cromatografia di esclusione dimensionale, una pompa a siringa è sufficiente per tutti i passaggi di cromatografia di affinità tra cui associazione, lavaggio e medicati. Quando si utilizza una pompa a siringa a soluzioni di push (in una siringa) attraverso una colonna, è essenziale per sottofondo il lato de...

Bestrophins sono una famiglia di canali ionici conservata attraverso specie variano da batteri a esseri umani1. In esseri umani, del gene BEST1 , localizzato sul cromosoma 11q12.3, codifica per la proteina di membrana Bestrophin-1 (BEST1) che si esprime principalmente nella membrana basolaterale delle cellule epitelio retinico del pigmento del occhi2,3 ,4. Composto da 585 aminoacidi, il primo ~ 350 di cui sono altamente conservati tra specie e contenere la sua regione transmembrana, BEST1 agisce come un CaCC in esseri umani1,5,6. Inoltre, gli omologhi BEST1 nei polli e Klebsiella pneumoniae entrambi funzionano come homopentamers7,8, suggerendo un alto livello di conservazione nel corso dell'evoluzione.
In esseri umani, oltre 200 mutazioni del gene BEST1 sono stati clinicamente collegate ad un gruppo di malattie di degenerazione retinica denominato bestrophinopathies1,9. Cinque bestrophinopathies specifici sono stati segnalati, compreso la malattia di Best, distrofia vitelliforme di adulto-inizio, Vitreoretinocoroidopatia autosomica dominante, autosomica recessiva Bestrofinopatia e retinite pigmentosa3,4 ,10,11,12,13,14. Queste malattie, che conducono ad una riduzione della vista e persino cecità, sono attualmente incurabili. Al fine di sviluppare trattamenti terapeutici e medicina potenzialmente personalizzata, è fondamentale per capire come queste mutazioni malattia-causanti BEST1 influenzano la funzione e la struttura del BEST1 canale15. Per questi scopi, i ricercatori devono ottenere canali purificata bestrophin (wild-type e/o mutante) e condotta in vitro analisi5,8.
Il primo passo fondamentale è l'espressione di canali bestrophin da specie superiori in cellule di mammifero. Come baculovirus trasduzione di cellule HEK293-F (sistema BacMam) è un metodo potente per esprimere heterologously membrana proteine16,17, questo protocollo utilizza un vettore di BacMam ottimizzato (pEG BacMam) per robusta espressione della destinazione della proteina18, che in questo caso è un omologo mammifero bestrophin. Questo vettore è stato utilizzato per l'espressione di varie proteine di membrana, tra cui i recettori accoppiati a proteine G, recettori nucleari e altri canali ion18. C'è inoltre la prova che le proteine prodotte sono adatte per cristallografia18. Con alti livelli di espressione in cellule HEK293-F, le proteine possono essere purificate poi mediante cromatografia; in particolare, nel caso di bestrophins, affinità e la cromatografia di esclusione dimensionale può essere utilizzati.
Una volta che questo protocollo è messa a punto per un canale di bestrophin, la proteina purificata possa poi essere analizzata per la sua funzione e la struttura attraverso il doppio strato lipidico planare e cristallografia a raggi x, rispettivamente5,8. Complessivamente, queste tecniche forniscono una potente pipeline per indagini strutturali e funzionali di bestrophins e altri canali ionici.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC327265000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC446212500</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-500</td><td></td></tr><tr><td>Imidazolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC301870010</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC197530010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA4058704&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ63039MA</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ61188MB&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ20037MB</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetilsulfonilfluoruro</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC215740050</td><td></td></tr><tr><td>DDM sol-grade</td><td>Anatrace</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>DDM anagrade</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM ThermoFisher</td><td></td><td>10902179</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle medium</td><td>Spettrofotometro ThermoFisher</td><td>12338018</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Omogeneizzatore</td> ad alta pressione <td>ThermoFisher ND-2000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Avestin</td><td>Emulsiflex-C5</td><td></td></tr><tr><td>Colonna HisTrap</td><td>GE</td><td>17-5248-01</td><td></td></tr><tr><td>Colonna Superdex-200</td><td>GE</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>AKTA Pure</td><td>GE</td><td>29018224</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-15 unità filtranti centrifughe</td><td>Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>unità filtranti centrifughe Ultra-4 Unità filtranti centrifughe</td><td>Millipore</td><td>UFC810024</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-0.5</td><td>Millipore</td><td>UFC505024</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>Gel prefabbricato Mini-PROTEAN</td><td>Bio-Rad</td><td>4561084</td><td></td></tr><tr><td>T100 Termociclatore</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione PolyJet</td><td>Vettore SignaGen</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>pEG BacMam</td><td></td><td></td><td>Ottenuto dal laboratorio di Gouaux dell'Istituto Vollum</td></tr></tbody></table>

espressione e purificazione dei canali ionici di mammiferi bestrophin

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Il genoma umano codifica quattro bestrophin paralogs, vale a dire BEST1, BEST2, BEST3 e BEST4. BEST1, codificata dal gene BEST1 , è Ca2 +-attivato Cl– canale (CaCC) espressi principalmente nell'epitelio retinico del pigmento (RPE). Il significato fisiologico e patologico del BEST1 è evidenziato dal fatto che oltre 200 mutazioni distinte del gene BEST1 sono state collegate geneticamente a uno spettro di almeno cinque disturbi degenerativi della retina, come migliori vitelliforme distrofia maculare (malattia di Best). Pertanto, comprendere la biofisica dei canali di bestrophin a livello di singola molecola contiene un enorme significato. Tuttavia, ottenere canali ionici dei mammiferi purificata è spesso un compito impegnativo. Qui, segnaliamo un protocollo per l'espressione delle proteine di mammiferi bestrophin con il sistema di trasferimento del gene baculovirus BacMam e loro purificazione di affinità e la cromatografia di esclusione dimensionale. Le proteine purificate hanno il potenziale per essere utilizzato nelle successive analisi funzionali e strutturali, quali registrazioni elettrofisiologiche in lipidici e cristallografia. D'importanza, questa pipeline può essere adattata per studiare le funzioni e le strutture di altri canali ionici.

L'intensità di fluorescenza transfected transitoriamente di cellule HEK293 adesiva (Figura 1A) è un buon indicatore per il livello di espressione della proteina proiettata in cellule HEK293-F in sospensione (Figura 1B). Se la proteina dell'obiettivo non è ben espressa o mis-è localizzata nelle cellule HEK293 dopo trasfezione transiente, è consigliabile, è consigliabile modificare il costrutto di espressione (ad es., camb...

La purificazione dei canali ionici è spesso provocatorio, ma una volta raggiunto, potenzialmente può permettere le indagini in vitro delle funzioni e delle strutture dei canali. Qui, descriviamo le procedure graduale per l'espressione e purificazione delle proteine di mammiferi bestrophin, una famiglia di Ca2 +-attivato canali Cl– .

Espressione e purificazione dei canali ionici di mammiferi Bestrophin

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave relative alla biofisica dei canali ionici dei mammiferi, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, la famiglia dei canali ionici delle bestrofine. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere applicata ad altri tipi di canali ionici e genera prodotti chiave per vari saggi in vitro a valle. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle bestrofilinopatie perché i saggi che utilizzano la proteina purificata contribuiscono alla nostra conoscenza di come funzionano i canali della bestrofina nella retina e di come le mutazioni nel gene BEST1 causano la degenerazione maculare.Ventiquattro ore prima dell'infezione virale, aggiungere un volume uguale di blu di tripano a un'aliquota di 15 microlitri di HEK293F coltura cellulare e controllare la densità e la vitalità cellulare utilizzando un emocitometro al microscopio. Dopo aver eseguito la conta cellulare, lastra 0,6 volte 10 al sesto di cellule per millilitro in un volume di 500 millilitri in ciascuno dei due palloni monouso da due litri. Posizionare i palloni in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con l'8% di anidride carbonica.Ruo

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimica

Transfection strategia ottimizzata per espressione e registrazione elettrofisiologica di ricombinante tensione canali ionici in cellule HEK-293T

I tentativi di esprimere la fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana (CFTR)...

Espressione e purificazione della proteina transmembrana cistica regolatore fibrosi conduttanza in Saccharomyces cerevisiae

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Descritto qui è una procedura rapida ed efficace per la ricostituzione funzionale di purificato wild-type e proteina CFTR mutata che preserva l'attività per questo canale del cloro, che è difettoso in fibrosi cistica. Efflusso ioduro da proteoliposomi ricostituiti mediati da CFTR permette studi di attività di canale e gli effetti di piccole molecole.

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Questo è un protocollo rapido ed economico per la produzione di proteine di mammifero glicosilate secrete e la successiva purificazione in un solo passaggio con rese sufficienti di proteine omogenee per la cristallografia a raggi X e altri studi biofisici.

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Impara l'espressione e la purificazione dei canali ionici Bestrophin di mammiferi utilizzando cellule HEK293F. Questo metodo consente studi in vitro sulla biologia dei canali ionici e sulle malattie retiniche.

Espressione e purificazione dei canali ionici di mammiferi Bestrophin

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