Analisi di co-immunoprecipitazione utilizzando proteine endogene nucleari da cellule coltivate in condizioni di ipossia

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ipossia, come le interazioni endogene e native tra i fattori di trascrizione e i loro coregolatori trascrizionali in condizioni di ipossia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le cellule ipossiche vengono raccolte in condizioni ipossiche e le frazioni nucleari vengono utilizzate per la co-immunoprecipitazione. Questo protocollo utilizza cellule 293A embrionali umane cresciute in quattro piastre da 10 centimetri.

Seminare da tre a cinque volte da 10 a sesta cellula per piatto in 10 millilitri del terreno Eagle's modificato di Dulbeco integrato con il 10% di FBS, L-glutammina, piruvato di sodio, penicillina e streptomicina. Coltiva le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica. Ventiquattro ore dopo la semina, quando le cellule hanno raggiunto l'80-90% di confluenza, mettere due piatti nella sottocamera dell'ipossia nella scatola a guanti dell'incubatrice con l'1% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per quattro ore.

Tenete gli altri due piatti alla normossia. Il giorno prima del prelievo delle cellule trattate con ipossia, pre-equilibrare la DPBS in condizioni ipossiche posizionando un flacone di reagente in vetro da 100 millilitri di esperimento scoperto e riempito con DPBS nella sottocamera dell'ipossia per 24 ore. Circa un'ora prima della raccolta delle cellule, posizionare una ghiacciaia contenente ghiaccio nella camera di lavorazione della glovebox, che è stata bilanciata all'1% di ossigeno e al 5% di anidride carbonica.

Trasferire il flacone contenente il DPBS ipossico pre-bilanciato dalla sottocamera di ipossia alla camera di lavorazione e posizionarlo sul ghiaccio. Quattro ore dopo il trattamento con ipossia, trasferire le cellule dalla sottocamera di ipossia alla camera di lavorazione che è stata pre-bilanciata all'1% di ossigeno e al 5% di anidride carbonica. Rimuovere il terreno di coltura mediante aspirazione e con una pipetta da 10 millilitri, sciacquare una volta le cellule con 10 millilitri di DPBS ipossico pre-bilanciato ghiacciato.

Utilizzando una pipetta da cinque millilitri, aggiungere 5 millilitri di DPBS pre-bilanciato ghiacciato e rimuovere le cellule raschiando con un raschietto cellulare. Inclinare la piastra di coltura cellulare, raccogliere le cellule staccate utilizzando una pipetta da 10 millilitri e trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 millilitri. Mantieni il tubo di cellule sul ghiaccio.

Aprire lo sportello tra la camera di lavorazione e la camera tampone nel vano portaoggetti, entrambe pre-bilanciate all'1% di ossigeno e al 5% di anidride carbonica. Trasferire le provette coniche da 15 millilitri su ghiaccio contenenti cellule trattate con ipossia dalla camera di lavorazione alla camera tampone. Aprire lo sportello della camera tampone e rimuovere completamente le celle dal vano portaoggetti.

Pellettare sia le cellule ipossiche che le cellule normossiche mediante centrifugazione a 1000 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Per questa procedura verrà utilizzato un kit di estrazione nucleare. Iniziare risospendendo delicatamente ogni pellet cellulare in 500 microlitri di tampone di lisi NL, integrato con un cocktail di inibitori della proteasi 1X in DTT molare 0,1 molare pipettando su e giù più volte.

Aggiungere 25 microlitri di soluzione detergente NP alla sospensione cellulare e agitare per 10 secondi alla massima velocità. Centrifugare a 1000 volte 10 g a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Risparmiate sia il surnatante che il pellet nucleare.

Dopo aver raccolto e conservato il surnatante come descritto nel protocollo di testo, risospendere i nuclei cellulari contenenti pellet in 500 microlitri di tampone di lisi NL, integrato con un cocktail di inibitori della proteasi 1X e DTT 0,1 molare agitando per cinque secondi alla massima velocità. Risospendere il pellet nucleare in 50 microlitri di tampone di estrazione NX1, integrato con il cocktail di inibitori della proteasi 1X pipettando il pellet su e giù più volte. Incubare con ghiaccio per 30 minuti.

Ogni cinque minuti, vorticare per 10 secondi alla massima velocità. Centrifugare a 12.000 x g a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Raccogliere il surnatante e trasferirlo in mini dispositivi di dialisi con un volume massimo di 100 microlitri per unità per la desalinizzazione.

Tappare i mini dispositivi per dialisi e metterli in un dispositivo di galleggiamento. Mettere il dispositivo di galleggiamento in un becher contenente 500 millilitri di tampone per dialisi pre-raffreddato. Fare attenzione a evitare il contatto diretto con la pelle o l'inalazione del tampone per dialisi, perché contiene PMSF.

Incubare a quattro gradi Celsius mescolando delicatamente per 30 minuti. Dopo 30 minuti, raccogliere i campioni dall'angolo dei mini dispositivi di dialisi e trasferirli in nuove provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri. Centrifugare a 12 mila volte g a quattro gradi Celsius per 10 minuti.

Aliquotare 25 microlitri di ciascun surnatante in una provetta da centrifuga da 1,5 microlitri e conservare a meno 80 gradi Celsius. Preparare le perle di sefarosio di proteina AG da utilizzare nell'immunoprezione. Pipettare 50 microlitri di perle in ciascuna delle quattro provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri e aggiungere 500 microlitri di tampone DPBS per provetta.

Pellettare le perle mediante centrifugazione. Scartare il surnatante e risospendere le perle in 100 microlitri di tampone TBS. Aggiungere due microlitri di anticorpo monoclonale anti-ARNT di topo o di immunoglobulina G di topo che è stato preparato ricostituendo 0,7 milligrammi di IgG di topo in 500 microlitri di tampone TBS.

Portare le provette da microcentrifuga contenenti le perle in una cella frigorifera. Metterli in un rotatore di provette e incubare a 10 giri/min per due ore. Dopo due ore, pellettare le perle mediante centrifugazione e scartare i surnatanti.

Diluire 200 microgrammi della proteina nucleare lisato preparata in precedenza in 800 microlitri di tampone di immunoprecipitazione. Incubare il lisato con le perle accoppiate ad anticorpi a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, pellettare le perle mediante centrifugazione a 3000 volte g per due minuti a quattro gradi Celsius.

Scartare il surnatante. Aggiungere un millilitro di TBS ghiacciato contenente lo 0,2% di NP-40 a ciascun tubo e centrifugare. In questo modo, lavare le perline tre volte con TBS ghiacciato contenente lo 0,2% di NP-40.

Far bollire le perle in 50 microlitri di tampone per campioni di Laemmli a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Centrifugare le perle a 10 mila volte g a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Raccogli il surnatante e scarta le perline.

I livelli di espressione nella localizzazione subcellulare dei componenti del complesso HIF-1 dopo il trattamento con ipossia sono stati esaminati in cellule HEK293A. Come previsto, i livelli totali di HIF-1a erano sovraregolati dall'ipossia, mentre i livelli di ARNT nei lisati cellulari totali non erano significativamente alterati. Inoltre, l'ipossia ha indotto l'accumulo nucleare sia di HIF-1a che di ARNT.

Gli esperimenti di co-immunoprecipitazione sono stati eseguiti utilizzando estratti nucleari da cellule HEK293A esposte a condizioni normossiche o ipossiche. Come mostrato qui, HIF-1a è stato co-immunoprecipitato insieme ad ARNT dagli estratti nucleari di cellule HEK293A ipossiche, indicando che HIF-1a interagisce con ARNT in condizioni di ipossia. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'ipossia per esplorare le interazioni proteiche nucleari endogene e le loro condizioni ipossiche.