Name: Analisi di co-immunoprecipitazione utilizzando proteine endogene nucleari da cellule coltivate in condizioni di ipossia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Scopri la co-immunoprecipitazione per studiare interazioni tra fattori di trascrizione nucleari endogeni in condizioni di ipossia utilizzando cellule HEK293A. Questo metodo consente di analizzare meccanismi cellulari in risposta a bassi livelli di ossigeno.

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Ringraziamo Assoc. Prof. ssa Sin Tiong Ong per l'utilizzo della workstation ipossia. Questo lavoro è stato supportato dal testo seguente: Singapore Ministry of Education, MOE 1T1-02/04 e MOE2015-T2-2-087 (a Y.A.), Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University avviamento sovvenzione M4230003 (p.o.b.), il Consiglio svedese della ricerca, il Famiglia Erling Persson Foundation, la Fondazione di Novo Nordisk, l'af di Stichting Jochnick Foundation, l'associazione svedese di diabete, la compagnia di assicurazione di Scandia, la ricerca sul diabete e Wellness Foundation, Fondazione di ormeggio von Kantzow, il Programma di ricerca strategico nel diabete al Karolinska Institutet, l'ERC ERC-2013-AdG 338936-Betalmage e Knut e Alice Wallenberg Foundation.

In questa sezione del protocollo, che utilizza 293A embrionali umane del rene (HEK293A) cella, s segue le linee guida del comitato etico di ricerca umana a Nanyang Technological University, Singapore.
1. induzione di ipossia in cellule di HEK293A
<ol><li>Preparare quattro piatti di 10cm e semi di 3 – 5 x 106 HEK293A cellule per piatto in 10 mL Dulbecco per volta medium dell'Aquila (DMEM, glucosio di 4,5 g/L) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-Glutammina, 110 mg/L sodio piruvato, 100 U/mL di penicillina e 100 mg / mL di streptomicina. Coltura le cellule in un 37 ° C, 5% CO2 incubator. Nota: Cella semina deve essere effettuata in una cappa di sicurezza biologica (BSC). Le superfici di tutti i materiali ad essere messi in BSC dovrebbero essere cancellate con etanolo al 70%.</li>
	<li>24 h dopo la semina, quando le cellule hanno raggiunto l'80 – 90% confluency, mettere due piatti nel subchamber di ipossia nel vano portaoggetti incubatore (Vedi Tabella materiali) con 1% O2 e 5% CO2 a 37 ° C e tenere gli altri due piatti al normoxia (21% O 2, 5% CO2 a 37 ° C) per 4 h. utilizzare un insieme di condizioni di normossia e cellule ipossiche per valutare il trattamento di ipossia mediante western blot e utilizzare l'altro set di celle per gli esperimenti di co-immunoprecipitazione. Nota: I livelli di ossigeno possono essere impostati a 0 – 5% e la durata del trattamento ipossia può essere variata a seconda del tipo di cella e obiettivo di studio.</li>
</ol>2. intera cellula ed estrazione nucleare
Nota: Vedi tabella 1 per informazioni sui buffer utilizzata nel presente protocollo.
<ol><li>
Raccogliere le cellule di controllo normoxia.
	<ol>
<li>Rimuovere il supporto di cultura dall'aspirazione e lavare le cellule con 10 mL di DPBS (PH 7.0-7.2) usando una pipetta da 10 mL. Nota: Evitare di toccare il monostrato cellulare con la pipetta. Durante il lavaggio, pipettare delicatamente DPBS abbattendo il muro della piastra di coltura cellulare per evitare la perdita delle cellule.</li>
		<li>Pipettare 5 mL DPBS ghiacciata nella piastra e raschiare le cellule sulla superficie della piastra in PBS ghiacciata con un raschietto di cella.</li>
		<li>Trasferire la sospensione cellulare in provette coniche da 15 mL e tenere sul ghiaccio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Raccogliere le cellule coltivate in condizioni di ipossia.
	<ol>
<li>Pre-equilibrare il DPBS a condizioni ipossiche inserendo un flacone di reagente di vetro dall'esperimento di 00ml scoperti 1riempito con DPBS nel subchamber di ipossia (1% O2 e 5% CO2 a 37 ° C) per 24 ore in anticipo.</li>
		<li>Circa 1 h prima della raccolta delle cellule di ipossia trattato, posizionare una scatola di ghiaccio contenente ghiaccio nella camera di lavorazione del vano portaoggetti, che è stato equilibrato al 1% O2 e 5% CO2. Trasferire il flacone contenente il pre-equilibrato DPBS ipossica dalla subchamber di ipossia a camera di lavorazione e posizionarlo sul ghiaccio.</li>
		<li>4 h dopo il trattamento di ipossia, trasferire le cellule dalla subchamber di ipossia nella camera di trattamento che è stato pre-equilibrato al 1% O2 e 5% CO2.</li>
		<li>Rimuovere il supporto di cultura dall'aspirazione e sciacquare le cellule una volta con 10 mL Pipettare ghiacciata DPBS hypoxic pre-equilibrato con un 10 mL.</li>
		<li>Aggiungere 5 mL DPBS ghiacciata pre-equilibrato con un 5 mL Pipettare e sloggiare le cellule da raschiare con un raschietto di cella.</li>
		<li>Inclinare la piastra di coltura delle cellule e raccogliere le cellule indipendente utilizzando una pipetta da 10 mL. Trasferire la sospensione cellulare in DPBS in provette coniche da 15 mL e tenere sul ghiaccio.</li>
		<li>Aprire la porta tra le camere elaborazione e buffer del vano portaoggetti, entrambi i quali sono stati pre-equilibrati per 1% O2 e 5% CO2. Trasferire le provette coniche da 15 mL sul ghiaccio che contengono le cellule di ipossia trattato dalla camera di elaborazione per l'alloggiamento di buffer. Aprire la porta della camera del tampone e rimuovere completamente le cellule dal vano portaoggetti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pellet sia le cellule normossiche da 2.1 e le cellule ipossiche da 2.2 mediante centrifugazione a 1.000 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>
Preparare l'intera cellula estratti.
	<ol>
<li>Risospendere il pellet cellulare in 500 µ l di tampone di lisi di gelida radio immunoprecipitazione assay (RIPA) contenente 50 mM pH Trisaminomethane cloridrato (Tris-HCl) 8.0, 150 mM di cloruro di sodio (NaCl), 1% tergitol-tipo NP-40 (NP-40), 0,5% sodio desossicolato, e 0.1% sodio dodecil solfato (SDS), completato con 1 x cocktail di inibitore della proteasi (Vedi Tabella materiali) pipettando il pellet cellulare su e giù più volte.</li>
		<li>Trasferire i lisati cellulari in nuove provette per microcentrifuga da 1,5 mL e tenere il ghiaccio per 30 min con occasionali Vortex.</li>
		<li>Centrifugare i lisati cellulari a 13.000 x g per 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Raccogliere il surnatante, aliquotare 50 µ l del surnatante in provette per microcentrifuga da 1,5 mL e conservare a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparare gli estratti nucleari utilizzando un'estrazione nucleare kit (Vedi tabella materiali).
	<ol>
<li>Risospendere delicatamente il pellet cellulare in 500 µ l di NL di buffer di lisi completati con 1 x cocktail di inibitore della proteasi e 0,1 M ditiotreitolo (DTT) pipettando il pellet cellulare su e giù più volte.</li>
		<li>Aggiungere 25 µ l di soluzione detergente NP alla sospensione cellulare e vortexare per 10 s a velocità massima.</li>
		<li>Centrifuga a 10.000 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
		<li>Raccogliere il surnatante (estratti citoplasmatici), aliquotare 50 µ l del surnatante in provette microcentrifuga da 1,5 mL e conservare a-80 ° C.</li>
		<li>Risospendere il pellet contenente nuclei delle cellule in 500 µ l di tampone di lisi NL completati con 1 x cocktail di inibitore della proteasi e 0,1 M DTT nel Vortex per 5 s alla velocità massima.</li>
		<li>Centrifugare a 10.000 x g per 5 min a 4 ° C e salvare la pallina nucleare.</li>
		<li>Risospendere il pellet nucleare in 50 µ l di estrazione Buffer NX1 completati con 1 x cocktail di inibitore della proteasi pipettando il pellet su e giù più volte.</li>
		<li>Incubare per 30 min su ghiaccio, su vortex per 10 s ogni 5 min alla massima velocità.</li>
		<li>Centrifugare a 12.000 x g per 10 min a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Desalificare estratti nucleari.
	<ol>
<li>Raccogliere il surnatante da passo 2.5.9 e trasferire nelle periferiche mini dialisi con un volume massimo di 100 µ l per unità.</li>
		<li>I dispositivi mini dialisi di Cap e metterli in un dispositivo di galleggiamento.</li>
		<li>Mettere il dispositivo di galleggiamento in un becher contenente 500 mL di tampone di dialisi pre-refrigerati (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 20% glicerolo, 100 mM di cloruro di potassio (KCl), 0,2 mM acido etilendiamminotetracetico (EDTA), 0,2 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF) e 0,5 mM DTT) ed incubare per 30 min a 4 ° C con agitazione delicata. Attenzione: PMSF è pericoloso. Evitare il contatto diretto con la pelle o per inalazione.</li>
		<li>Raccogliere i campioni dall'angolo dei dispositivi mini dialisi e trasferire nella nuova per microcentrifuga da 1,5 mL.</li>
		<li>Centrifugare a 12.000 x g per 10 min a 4 ° C, aliquota 25 µ l di ogni surnatante in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e conservare a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. valutazione del trattamento ipossia tramite rilevazione dell'espressione della proteina e localizzazione subcellulare di HIF-1 α
<ol><li>Determinare la concentrazione nella proteina della cellula intera o nucleare/citoplasmico estratti facendo uso dell'analisi di un kit di dosaggio acido (BCA) proteina bicinconinico secondo istruzioni18 del produttoremicropiastre.</li>
	<li>Diluire i lisati cellulari in 1 x Laemmli tampone contenente 5% 2-mercaptoetanolo e bollire a 95 ° C per 5 min. Attenzione: Non toccare la superficie del blocco riscaldante, poiché può provocare ustioni.</li>
	<li>
Separare le proteine elettroforesi del gel di poliacrilammide del sodio dodecil solfato (SDS-PAGE).
	<ol>
<li>Caricare uguali quantità di proteina (25 µ g) in ciascun pozzetto di un gel di SDS-PAGE prefabbricati di gradiente (4 – 20%), insieme a 3 µ l di marcatore di peso molecolare.</li>
		<li>Esegua il gel in tampone contenente 2,5 mM Tris, glicina 19,2 mM, 0,01% SDS, PH8.3 per 30 min a 200 V di corsa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Trasferire le proteine dal gel alla membrana di nitrocellulosa.
	<ol>
<li>Montare il panino di trasferimento (carta da filtro-gel-membrana-filtro di carta) con il gel sul lato anodo e la membrana sul lato catodo della cassetta.</li>
		<li>Inserire la cassetta nel trasferimento serbatoio riempito con tampone di trasferimento contenente 2,5 mM trisaminomethane (Tris), glicina 19,2 mM e 20% metanolo. Attenzione: Metanolo è infiammabile e deve essere conservato all'interno l'armadietto di immagazzinaggio liquido infiammabile.</li>
		<li>Effettuare il trasferimento per 1 h a 100 V in camera fredda.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bloccare la macchia nel tampone di bloccaggio da 10 mL contenente 50 mM Tris-Cl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.1 Tween 20 e 5% senza grassi del latte per 1 h a temperatura ambiente in un agitatore.</li>
	<li>Incubare la macchia con l'anticorpo anti-HIF-1 α (diluizione 1/500) nello stesso tampone bloccante durante la notte a 4 ° C.</li>
	<li>Lavare la macchia 3 volte per 5 min ogni volta con 50 mL di TBS-T.</li>
	<li>Incubare la macchia con perossidasi di rafano (HRP)-anticorpo secondario coniugato (diluizione 1/1.000) in 10 mL TBS-T contenente 5% non-grasso di latte secco per 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare la macchia 3 volte per 5 min ogni volta con 50 mL di TBS-T.</li>
	<li>Mix 500 µ l ciascuna di chemilumescent avanzata (ECL) Reagente A e B in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e agitare brevemente.</li>
	<li>Applicare il substrato di ECL il blot e incubare per 1 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>
Catturare i segnali a chemiluminescenza utilizzando un charge coupled device (CCD) sistema di imaging basata su videocamera.
	<ol>
<li>Scolare in eccesso substrato ECL toccando il bordo della membrana con una velina e posizionare la membrana in un foglio di protezione.</li>
		<li>Posizionare la membrana sul vassoio campione del CCD sistema di imaging basata su videocamera.</li>
		<li>Lanciare il software di elaborazione immagine (Vedi Tabella materiali) e catturare le immagini con le seguenti impostazioni: File → nuovo protocollo → monocanale → Protocol Setup → Gel imaging (applicazione: Chemi; Area Imaging: Gel pronto Bio-Rad; Imaging dell'esposizione: Il software automaticamente consente di ottimizzare il tempo di esposizione per bande intensi) protocollo di esecuzione → Nota: E ' possibile impostare manualmente il tempo di esposizione, per ottenere immagini ottimali.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. immunoprecipitazione e rilevamento delle proteine immunoprecipitati
<ol><li>Lavare 50 µ l di perle di proteina A/G sepharose in 500 µ l di tampone TBS in provette per microcentrifuga da 1,5 mL e pellet le perline mediante centrifugazione a 3.000 x g per 2 min a 4 ° C.</li>
	<li>Eliminare il supernatante e risospendere le sfere in 100 µ l di tampone TBS.</li>
	<li>Aggiungere 2 µ l di anticorpo monoclonale anti-ARNT (1,4 mg/mL) o il mouse dell'immunoglobulina G (IgG) (1,4 mg/mL) che è stato preparato mediante ricostituzione IgG di topo di 0,7 mg in 500 µ l di tampone TBS.</li>
	<li>Collocare la microcentrifuga da 1,5 mL contenente microsfere in un rotatore del tubo ed incubare per 2 ore a 10 giri/min in camera fredda. Nota: Maneggiare i tubi delicatamente e tenere la sospensione contenente le perline nella parte inferiore del tubo.</li>
	<li>A pellet le perline mediante centrifugazione a 3.000 x g per 2 min a 4 ° C ed eliminare i sovranatante.</li>
	<li>Diluire 200 µ g della proteina nucleare lisato ottenuto nel passaggio 2.6.5 in 800 µ l di buffer IP composto da 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 180 mM NaCl, 20% glicerolo, inibitore di proteasi di 0,2% NP-40 e 1 x cocktail. Incubare il lisato con i branelli accoppiati anticorpi ottenuti nel passaggio 4.5 durante la notte a 4 ° C.</li>
	<li>A pellet le perline mediante centrifugazione a 3.000 x g per 2 min a 4 ° C, eliminare i sovranatante e lavare le perle 3 volte con 1 mL ghiacciata TBS contenente 0,2% NP-40.</li>
	<li>Cuocere le perline in 50 µ l tampone di Laemmli campione a 95 ° C per 5 min.</li>
	<li>Centrifugare le perline a 10.000 x g per 5 min a 4 ° C, raccogliere il surnatante e scartare le perline. Nota: Il surnatante possa essere memorizzato a 4 ° C per breve periodo o a-20 ° C per il lungo termine.</li>
	<li>Rilevare la presenza di HIF-1 α dai complessi proteina immunoprecipitata con western blot come precedentemente descritto nel passaggio 3.3 in poi. Nota: Quantificazione della proteina non è necessaria per questo passaggio. Caricare tutto volume (50 µ l) del surnatante di ogni campione in ciascun pozzetto di un gel di SDS-PAGE prefabbricati di gradiente (4 – 20%)</li>
</ol>

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<li>Koh, M. Y., Powis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passing+the+baton%3A+The+HIF+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Passing the baton: The HIF switch.</a> Trends Biochem Sci. 37 (9), 364-372 (2012).</li>
<li>Dumetz, A. C., Snellinger-O'brien, A. M., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+protein+protein+interactions+in+salt+solutions+and+implications+for+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Patterns of protein protein interactions in salt solutions and implications for protein crystallization.</a> Protein Sci. 16 (9), 1867-1877 (2007).</li>
<li>Graven, K. K., Troxler, R. F., Kornfeld, H., Panchenko, M. V., Farber, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+endothelial+cell+glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase+expression+by+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of endothelial cell glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression by hypoxia.</a> J Biol Chem. 269 (39), 24446-24453 (1994).</li>
<li>Caradec, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desperate+house+genes%27%3A+The+dramatic+example+of+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Desperate house genes': The dramatic example of hypoxia.</a> Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Il complesso di HIF-1 è un regolatore dell'omeostasi dell'ossigeno cellulare e regola una pletora di geni coinvolti in diverse risposte adattative cellulari all'ipossia. Identificazione di nuove proteine interagenti di HIF-1 è importante per la comprensione della trasduzione del segnale ipossico. Esperimenti di co-immunoprecipitazione comunemente utilizzati per studi di PPIs per delineare vie di trasduzione del segnale cellulare. Tuttavia, la sovraespressione di proteina è ancora ampiamente usata e questo può portare ad ...

L'ipossia si verifica quando viene fornito ossigeno insufficiente di cellule e tessuti del corpo. Esso svolge un ruolo critico in vari processi fisiologici e patologici, quali il differenziamento di cellule staminali, infiammazione e cancro1,2. Fattori inducibili dall'ipossia (HIFs) fungono da eterodimeri composto di una subunità α ossigeno-regolato e una subunità β costitutivamente espressa anche conosciuto come ARNT3. Tre isoforme della subunità HIF-α (HIF-1 α, HIF-2α e HIF-3 α) e tre subunità HIF-β (ARNT/HIF-1 β, ARNT2 e ARNT3) sono state identificate fino ad oggi. HIF-1 α e ARNT sono espresso ubiquitariamente, considerando che HIF-2α, HIF-3 α, ARNT2 e ARNT3 hanno limitato più espressione modelli4. Il complesso della proteina HIF-1 è il regolatore chiave della risposta ipossia. In condizioni di ipossia HIF-1 α diventa stabilizzato, poi trasloca nel nucleo e dimerizza con ARNT5. Successivamente, questo complesso si lega a specifici nucleotidi conosciuti come elementi reattivi di ipossia (HREs) e regola l'espressione di geni bersaglio coinvolti in diversi processi tra cui l'angiogenesi, eritropoiesi e glicolisi6. Oltre a questa risposta "canonica", la via di segnalazione di ipossia è noto anche per diafonia con risposta cellulare più vie come tacca e nucleare della fattore-kappa B (NF-κB) di segnalazione7,8,9.
L'identificazione delle proteine interagenti romanzo HIF-1 è importante per una migliore comprensione dell'ipossia via di segnalazione. In contrasto con ARNT, che è insensibile ai livelli di ossigeno e costitutivamente espressa, i livelli della proteina HIF-1 α sono strettamente regolati dai livelli di ossigeno cellulare. Al normoxia (21% di ossigeno), proteine di HIF-1 α sono rapidamente degradata10,11. La breve emivita di HIF-1 α al normoxia presenta sfide tecniche specifiche per la rilevazione della proteina da estratti cellulari, così come per l'identificazione di proteine che interagiscono HIF-1 α. Inoltre, diversi fattori di trascrizione, compresi quelli del complesso HIF-1 traslocano nel nucleo sotto condizioni di ipossia12,13,14. La maggior parte dei metodi attualmente utilizzati per studi di PPI sono eseguita usando non-fisiologica iperespressione delle proteine. Tale sovraespressione della proteina è stata segnalata per causare difetti cellulari differenti attraverso i meccanismi multipli compreso sovraccarico delle risorse, squilibrio stechiometrico, interazioni promiscue e via modulazione15,16. In termini di studi PPI, sovraespressione della proteina può portare a falsi negativi positivi, o addirittura falsi, risultati a seconda delle proprietà della proteina e le funzioni delle proteine overexpressed. Pertanto, i metodi attuali per gli studi di PPI necessario essere modificato al fine di rivelare la PPIs fisiologicamente rilevanti in condizioni ipossiche. Precedentemente abbiamo dimostrato l'interazione tra HIF-1 e il fattore di trascrizione famiglia Ets GA-legante della proteina (GABP) in cellule P19 hypoxic, che contribuisce alla risposta del promotore Hes1 a ipossia17. Qui, descriviamo un protocollo di co-immunoprecipitazione per studiare PPIs tra proteine endogene nucleari in condizioni di ipossia. L'interazione tra HIF-1 α e ARNT è mostrato come un proof of concept. Questo protocollo è adatto per la dimostrazione delle interazioni tra fattori di trascrizione e co-regolatori trascrizionali in condizioni di ipossia, compresi ma non limitati all'identificazione di proteine interagenti HIF-1.

<table><tbody><tr><td><forte>Materiale</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,0 M Tris-HCl tampone, pH 7,4&nbsp;</td><td>1st BASE</td><td>1415</td><td></td></tr><tr><td>Proteina A/G Perle di Sefarosio</td><td>Abcam</td><td>ab193262</td><td></td></tr><tr><td>Proteina IgG naturale di topo</td><td>Abcam</td><td>ab198772</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio-Rad</td><td>1610729</td><td></td></tr><tr><td>2x tampone campione Laemmli</td><td>Bio-Rad</td><td>1610737</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulosa Membrana &nbsp; &nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>Blotting-Grade Blocker</td><td>Bio-Rad</td><td>1706404</td><td>Latte scremato in polvere per applicazioni di western blotting</td></tr><tr><td>10x Tris Buffered Saline (TBS)</td><td>Bio-Rad</td><td>1706435</td><td></td></tr><tr><td>10% Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>1610781</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine Buffer&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610771</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standards</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-coniglio, segnalazione cellulare anticorpo legata a HRP</td><td></td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-topo, anticorpo legato a HRP&nbsp;</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>7076</td><td></td></tr><tr><td>Reagente ECL SignalFire</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>6883</td><td></td></tr> Soluzione <tr><td>salina tamponata con fosfato di Dulbecco</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF)</td><td>Anticorpo beta Merck Millipore</td><td>52332</td><td></td></tr><tr><td>ARNT/HIF-1</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-124&nbsp;</td><td>Concentrazione: 1,4 mg/mL</td></tr><tr><td>Anticorpo HIF-1 alfa</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-479</td><td>Concentrazione: 1,0 mg/mL</td></tr><tr><td>YY1 Anticorpo</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-46218</td><td>Concentrazione: 0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>Kit di proteine nucleari Qproteome</td><td>Qiagen</td><td>37582</td><td>Il tampone di lisi NL e il tampone di estrazione NX1 sono forniti nel kit</td></tr><tr><td>Anticorpo GAPDH</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-47724</td><td>Concentrazione: 0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>Glicerolo (&ge; 99%)</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>tampone RIPA</td><td>Sigma</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>127087-87-0</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle modificato' s medium (DMEM, 4,5 g/L glucosio)</td><td>Thermo Fisher Scientific 11995065</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0861</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>HEK293A linea cellulare</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R70507</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Compresse di inibitori della proteasi&nbsp;</td>Kit per il dosaggio delle proteine <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88660</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Punta di caricamento del gel QSP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>QSP#010-R204-Q-PK</td><td>1-200 uL</td></tr><tr><td>Equipment/Instrument</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thick Blot Filter Paper, Pretagliato, 7,5 x 10 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&nbsp; Cella di elettroforesi verticale Tetra per mini gel prefabbricati, con Mini Trans-Blot Modulo e alimentatore di base PowerPac</td><td>Bio-Rad</td><td>1658034</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; 15% Mini-PROTEAN TGX Gel proteici prefabbricati</td><td>Bio-Rad</td><td>4561083</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc XRS+ Sistema</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>Guanto</td><td>BioSpherix</td><td>I-Glove</td><td></td></tr><tr><td>Synergy HTX Lettore di micropiastre multimodale&nbsp;</td><td>Pipette</td> sierologiche BioTek <td>BTS1LFTA</td><td></td></tr><tr><td>Costar 5mL Stripette</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche Costar 10mL Stripette</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Pepette sierologiche Costar 25mL Stripette</td><td>Corning</td><td>4251</td><td></td></tr><tr><td>Corning Micropiastre in polistirene nero a fondo trasparente a 96 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3631</td><td></td></tr><tr><td>15mL High Clarity PP conici provette da centrifuga</td><td>Corning</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Raschietto per piccole celle</td><td>Corning</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Gilson&nbsp; Kit 4 pipette Pipetman L</td><td>Gilson</td><td>F167370</td><td>P2, P20, P200, P1000 e accessori</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga in polipropilene da 1,5 ml</td><td>Greiner Bio-One&nbsp;</td><td></td><td></td>616201</tr><tr><td>PIPETBOY acu 2 Pipettatore</td><td>INTEGRA Biosciences</td><td>155 000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Armadi per la conservazione di liquidi infiammabili Justrite</td><td>Justrite Manufacturing Co.</td><td>896000</td><td></td></tr><tr><td>Miscelatore a vortice</td><td>Labnet</td><td>S0200</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore a CO2</td><td>NuAire</td><td>NU-5820</td><td></td></tr><tr><td>Agitatori orbitali</td><td>Stuart</td><td>SSL1</td><td></td></tr><tr><td>Rotatore a tubo SB3</td><td>Stuart</td><td>SB3</td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 21R Microcentrifuga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002470</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 16 Centrifuga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004240</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture tissutali (100 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer MINI Dispositivo per dialisi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69580</td><td>10K MWCO, 0,1 mL</td></tr><tr><td>Boe galleggianti per 0,1 mL Slide-A-Lyzer MINI Dispositivi per dialisi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69588</td><td></td></tr><tr><td>LSE Riscaldatori digitali per bagno secco</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>1168H25</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp; Armadi di sicurezza biologica serie 1300 A2 Classe II, tipo A2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-261-308</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Lab Software</td><td>Bio-Rad</td><td>1709691</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi di co-immunoprecipitazione utilizzando proteine endogene nucleari da cellule coltivate in condizioni di ipossia

Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions

Bassi livelli di ossigeno (ipossia) innescano una serie di risposte adattative con il Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) che agisce come un regolatore matrice complessa. HIF-1 è costituito da una subunità α ossigeno-regolato di heterodimeric (HIF-1 α) e costitutivamente espresso subunità β (HIF-1 β) noto anche come arilico dell'idrocarburo del recettore nucleare translocator (ARNT), regolazione di geni coinvolti in diversi processi tra cui l'angiogenesi , eritropoiesi e glicolisi. L'identificazione di proteine interagenti HIF-1 è la chiave per la comprensione dell'ipossia via di segnalazione. Oltre alla regolazione della stabilità di HIF-1 α, ipossia attiva inoltre la traslocazione nucleare di molti fattori di trascrizione tra cui HIF-1 α e ARNT. In particolare, la maggior parte dei metodi attualmente utilizzati per lo studio di tali interazioni proteina-proteina (PPIs) sono basata su sistemi dove i livelli della proteina sono aumentati artificialmente attraverso la sovraespressione della proteina. Sovraespressione di proteine spesso porta a risultati non-fisiologica derivanti dagli elementi spaziali e temporali. Qui descriviamo una co-immunoprecipitazione modificata a seguito del trattamento di ipossia utilizzando proteine nucleari endogene e come un proof of concept, per mostrare l'interazione tra HIF-1 α e ARNT di protocollo. In questo protocollo, le cellule ipossiche sono state raccolte in condizioni ipossiche e tampone di lavaggio di Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (DPBS) era anche pre-equilibrato a condizioni di ipossia prima dell'uso per mitigare la degradazione della proteina o proteina complessa dissociazione durante la riossigenazione. Inoltre, le frazioni nucleari sono stati successivamente estratti per concentrare e stabilizzare le proteine nucleari endogene ed evitare possibili risultati spuri spesso visto durante la sovraespressione della proteina. Questo protocollo consente di dimostrare endogeni e nativi di interazioni tra fattori di trascrizione e co-regolatori trascrizionali in condizioni di ipossia.

Per valutare la risposta cellulare all'ipossia, l'espressione sono stati esaminati i livelli e localizzazione subcellulare delle componenti del trattamento seguente complesso di ipossia HIF-1. HEK293A cellule sono state coltivate in condizioni di ipossia per 4 h o tenuti a normoxia come controlli. Livelli della proteina HIF-1 α e ARNT sono stati esaminati in cellule intere o nucleare/citoplasmico estratti mediante western blot. Come previsti, totali livelli di HIF-1 α sono stati aumentati...

Qui descriviamo un protocollo di co-immunoprecipitazione per studiare le interazioni proteina-proteina tra proteine endogene nucleari in condizioni di ipossia. Questo metodo è adatto per la dimostrazione delle interazioni tra fattori di trascrizione e co-regolatori trascrizionali all'ipossia.

Analisi di co-immunoprecipitazione utilizzando proteine endogene nucleari da cellule coltivate in condizioni di ipossia

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ipossia, come le interazioni endogene e native tra i fattori di trascrizione e i loro coregolatori trascrizionali in condizioni di ipossia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le cellule ipossiche vengono raccolte in condizioni ipossiche e le frazioni nucleari vengono utilizzate per la co-immunoprecipitazione. Questo protocollo utilizza cellule 293A embrionali umane cresciute in quattro piastre da 10 centimetri.Seminare da tre a cinque volte da 10 a sesta cellula per piatto in 10 millilitri del terreno Eagle's modificato di Dulbeco integrato con il 10% di FBS, L-glutammina, piruvato di sodio, penicillina e streptomicina. Coltiva le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica. Ventiquattro ore dopo la semina, quando le cellule hanno raggiunto l'80-90% di confluenza, mettere due piatti nella sottocamera dell'ipossia nella scatola a guanti dell'incubatrice con l'1% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per quattro ore.Tenete gli altri due piatti alla normossia. Il giorno prima del prelievo delle cellule trattate con ipossia, pre-equilibrare la DPBS in condizioni ipossiche posizionando un flacone di reagente in vetro da 100 millilitri di esperimento scoperto e riempito con DPBS nella sottocamera dell'ipossia per 24 ore. Circa un'ora prima della raccolta delle cellule, posizionare una ghiacciaia contenente ghiaccio nella camera di lavorazione della glovebox, che è stata bilanciata all'1% di ossigeno e al 5% di anidride carbonica.Trasferire il flacone contenente il DPBS ipossico pre-bilanciato dalla sottocamera di ipossia alla camera di lavorazione e posizionarlo sul ghiaccio. Quattro ore dopo il trattamento con ipossia, trasferire le cellule dalla sottocamera di ipossia alla camera di lavorazione che è stata pre-bilanciata all'1% di ossigeno e al 5% di anidride carbonica. Rimuovere il terreno di coltura mediante aspirazione e con una pipetta da 10 millilitri, sciacquare una volta le cellule con 10 millilitri di DPBS ipossico pre-bilanciato ghiacciato.Utilizzando una pipetta da cinque millilitri, aggiungere 5 millilitri di DPBS pre-bilanciato ghiacciato e rimuovere le cellule raschiando con un raschietto cellulare. Inclinare la piastra di coltura cellulare, raccogliere le cellule staccate utilizzando una pipetta da 10 millilitri e trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 millilitri. Mantieni il tubo di cellule sul ghiaccio.Aprire lo sportello tra la camera di lavorazione e la camera tampone nel vano portaoggetti, entrambe pre-bilanciate all'1% di ossigeno e al 5% di anidride carbonica. Trasferire le provette coniche da 15 millilitri su ghiaccio contenenti cellule trattate con ipossia dalla camera di lavorazione alla camera tampone. Aprire lo sportello della camera tampone e rimuovere completamente le celle dal vano portaoggetti.Pellettare sia le cellule ipossiche che le cellule normossiche mediante centrifugazione a 1000 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Per questa procedura verrà utilizzato un kit di estrazione nucleare. Iniziare risospendendo delicatamente ogni pellet cellulare in 500 microlitri di tampone di lisi NL, integrato con un cocktail di inibitori della proteasi 1X in DTT molare 0,1 molare pipettando su e giù più volte.Aggiungere 25 microlitri di soluzione detergente NP alla sospensione cellulare e agitare per 10 secondi alla massima velocità. Centrifugare a 1000 volte 10 g a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Risparmiate sia il surnatante che il pellet nucleare.Dopo aver raccolto e conservato il surnatante come descritto nel protocollo di testo, risospendere i nuclei cellulari contenenti pellet in 500 microlitri di tampone di lisi NL, integrato con un cocktail di inibitori della proteasi 1X e DTT 0,1 molare agitando per cinque secondi alla massima velocità. Risospendere il pellet nucleare in 50 microlitri di tampone di estrazione NX1, integrato con il cocktail di inibitori della proteasi 1X pipettando il pellet su e giù più volte. Incubare con ghiaccio per 30 minuti.Ogni cinque minuti, vorticare per 10 secondi alla massima velocità. Centrifugare a 12.000 x g a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Raccogliere il surnatante e trasferirlo in mini dispositivi di dialisi con un volume massimo di 100 microlitri per unità per la desalinizzazione.Tappare i mini dispositivi per dialisi e metterli in un dispositivo di galleggiamento. Mettere il dispositivo di galleggiamento in un becher contenente 500 millilitri di tampone per dialisi pre-raffreddato. Fare attenzione a evitare il contatto diretto con la pelle o l'inalazione del tampone per dialisi, perché contiene PMSF.Incubare a quattro gradi Celsius mescolando delicatamente per 30 minuti. Dopo 30 minuti, raccogliere i campioni dall'angolo dei mini dispositivi di dialisi e trasferirli in nuove provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri. Centrifugare a 12 mila volte g a quattro gradi Celsius per 10 minuti.Aliquotare 25 microlitri di ciascun surnatante in una provetta da centrifuga da 1,5 microlitri e conservare a meno 80 gradi Celsius. Preparare le perle di sefarosio di proteina AG da utilizzare nell'immunoprezione. Pipettare 50 microlitri di perle in ciascuna delle quattro provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri e aggiungere 500 microlitri di tampone DPBS per provetta.Pellettare le perle mediante centrifugazione. Scartare il surnatante e risospendere le perle in 100 microlitri di tampone TBS. Aggiungere due microlitri di anticorpo monoclonale anti-ARNT di topo o di immunoglobulina G di topo che è stato preparato ricostituendo 0,7 milligrammi di IgG di topo in 500 microlitri di tampone TBS.Portare le provette da microcentrifuga contenenti le perle in una cella frigorifera. Metterli in un rotatore di provette e incubare a 10 giri/min per due ore. Dopo due ore, pellettare le perle mediante centrifugazione e scartare i surnatanti.Diluire 200 microgrammi della proteina nucleare lisato preparata in precedenza in 800 microlitri di tampone di immunoprecipitazione. Incubare il lisato con le perle accoppiate ad anticorpi a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, pellettare le perle mediante centrifugazione a 3000 volte g per due minuti a quattro gradi Celsius.Scartare il surnatante. Aggiungere un millilitro di TBS ghiacciato contenente lo 0,2% di NP-40 a ciascun tubo e centrifugare. In questo modo, lavare le perline tre volte con TBS ghiacciato contenente lo 0,2% di NP-40.Far bollire le perle in 50 microlitri di tampone per campioni di Laemmli a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Centrifugare le perle a 10 mila volte g a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Raccogli il surnatante e scarta le perline.I livelli di espressione nella localizzazione subcellulare dei componenti del complesso HIF-1 dopo il trattamento con ipossia sono stati esaminati in cellule HEK293A. Come previsto, i livelli totali di HIF-1a erano sovraregolati dall'ipossia, mentre i livelli di ARNT nei lisati cellulari totali non erano significativamente alterati. Inoltre, l'ipossia ha indotto l'accumulo nucleare sia di HIF-1a che di ARNT.Gli esperimenti di co-immunoprecipitazione sono stati eseguiti utilizzando estratti nucleari da cellule HEK293A esposte a condizioni normossiche o ipossiche. Come mostrato qui, HIF-1a è stato co-immunoprecipitato insieme ad ARNT dagli estratti nucleari di cellule HEK293A ipossiche, indicando che HIF-1a interagisce con ARNT in condizioni di ipossia. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'ipossia per esplorare le interazioni proteiche nucleari endogene e le loro condizioni ipossiche.

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Qui vi proponiamo semplici metodi per indurre ipossia in colture cellulari e semplici test per valutare lo stato di ipossia delle culture.

Induzione e test di ipossia in coltura cellulare

Questo video descrive il protocollo per il test di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), che è una tecnica classica per dimostrare le interazioni proteina-DNA. Questa tecnica viene utilizzata per identificare i geni bersaglio nelle cellule di leucemia linfocitica cronica umana.

Saggio di immunoprecipitazione della cromatina: una tecnica per studiare le interazioni proteina-DNA nelle cellule

Descriviamo un metodo robusto per immunoprecipitazione della cromatina utilizzando cellule T primarie. Il metodo si basa su approcci standard, ma utilizza uno specifico insieme di condizioni e reagenti che migliorano l'efficienza per una limitata quantità di cellule. Importante, una descrizione dettagliata della fase di analisi dei dati è presentato.

Efficiente immunoprecipitazione della cromatina utilizzando Limitare quantità di biomassa

Forniamo un protocollo dettagliato per l'induzione del potenziamento a lungo termine nella regione CA1 dell'ippocampo e il successivo isolamento di frazioni arricchite nucleari dalla zona tetanized della fetta. Questo approccio può essere utilizzato per determinare l'attività dipendente di importazione proteina nucleare in modelli cellulari di apprendimento e memoria.

Isolamento di CA1 nucleari arricchiti Frazioni di fettine di ippocampo per studiare l&#39;attività-dipendente nucleare Importazione di Messenger proteine ​​Synapto-nucleari

Descriviamo una tecnica per l'analisi della sintesi dell'RNA globale in ipossia utilizzando immagini. Click-chimica etichettatura di RNA non è stato precedentemente eseguito in ipossia e consente la visualizzazione dei cambiamenti di RNA globali a livello di singola cellula. Questo approccio integra le tecniche RNA medi esistenti, permettendo la visualizzazione diretta di cellula-cellula cambiamenti nella sintesi dell'RNA globale.

Analisi globale di RNA Sintesi a livello di singola cellula seguente ipossia

Questo manoscritto descrive un approccio per isolare RNP affini selezionati formati in cellule eucariotiche tramite uno specifico arricchimento diretto da oligonucleotidi. Dimostriamo l'applicabilità di questo approccio isolando un RNP affine legato alla regione retrovirale 5' non tradotta che è composta da DHX9/RNA elicasi A.

Isolamento di cognate Complessi RNA-proteina da Cellule con eluizione oligonucleotidi-diretto

Le interazioni proteina-proteina possono verificarsi sia nel nucleo che nel citoplasma di una cellula. Per studiare queste interazioni, vengono applicati la tradizionale co-immunoprecipitazione e il moderno saggio di legatura di prossimità. In questo studio, confrontiamo questi due metodi per visualizzare la distribuzione delle interazioni NF90-RBM3 nel nucleo e nel citoplasma.

Visualizzazione di interazione proteina-proteina in nucleare e citoplasmatica frazioni da Co-immunoprecipitazione e<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Assay legatura

Indagando più, modificazioni post-traduzionali endogeni per una proteina bersaglio possono essere estremamente impegnativi. Tecniche descritte qui utilizzano un sistema di tampone e di filtro ottimizzato Lisi sviluppato con PTM-targeting specifico, matrici di affinità per rilevare le modifiche di fosforilazione di acetilazione, ubiquitinazione, sumoilazione 2/3 e tirosina per una destinazione proteine utilizzando un unico sistema semplificato.

Che utilizzano un sistema di arricchimento di immunoprecipitazione completa per identificare un profilo di modificazione post-traduzionale endogeno per proteine bersaglio

Descritto è un flusso di lavoro proteomico per identificare i partner di interazione delle proteine da una frazione subcellulare nucleare utilizzando l'arricchimento dell'immunoaffinità di una determinata proteina di interesse e la spettrometria di massa priva di etichette. Il flusso di lavoro include frazionamento subcellulare, immunoprecipitazioni, preparazione dei campioni assistiti dal filtro, pulizia offline, spettrometria di massa e una pipeline bioinformatica a valle.

Flusso di lavoro per spettrometria di massa per l'immunoprecipitazioni nucleari senza etichetta per la profilazione del contraglio nucleare su larga scala

Qui descriviamo un protocollo in vitro per modellare danni da ipossia/reossigenazione nelle cellule epiteliali tubulari prossimali altamente metaboliche. Questo modello è progettato per indurre danni indotti dallo stress metabolico, che possono essere misurati attraverso l'espressione di marcatori di danno prossimale dei tubuli e la valutazione della funzione respiratoria mitocondriale.

Modellizzazione dell'ipossia/lesione da reossigenazione nelle cellule epiteliali tubolari prossimali

Scopri la co-immunoprecipitazione per studiare interazioni tra fattori di trascrizione nucleari endogeni in condizioni di ipossia utilizzando cellule HEK293A. Questo metodo consente di analizzare meccanismi cellulari in risposta a bassi livelli di ossigeno.

Analisi di co-immunoprecipitazione utilizzando proteine endogene nucleari da cellule coltivate in condizioni di ipossia

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