Name: Caratterizzazione delle risposte di isotipo dellimmunoglobulina timo-dipendenti e indipendenti del timo in topi usando lanalisi enzima-collegata dellimmunosorbente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Impara a caratterizzare le risposte di isotipo Ig timo-dipendenti e indipendenti nei topi usando l'ELISA. Questo metodo quantitativo permette di analizzare l'attivazione dei linfociti B e l'immunità umorale.

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Questo studio è stato sostenuto dagli istituti nazionali di sovvenzioni salute CA158402 R01 (P. Xie) e AI128264 R21 (P. Xie), il dipartimento della difesa concedere W81XWH-13-1-0242 (P. Xie), un premio di pilota il Cancer Institute del New Jersey attraverso Grant numero P30CA072720 dal National Cancer Institute (P. Xie), una sovvenzione di biomedica Busch (P. Xie), una borsa di studio Stollar Victor (a. Levi) e un B. Anne e James B. Leathem Fellowship (S. Zhu).

Questo protocollo segue le linee guida del comitato etico di ricerca animale istituzionale dell'Università di Rutgers. Tutti i topi sono utilizzati conformemente alle linee guida NIH e sotto un animale protocollo approvato dal comitato di uso e cura degli animali istituzionale.
1. preparazione di topi e raccolta di sieri ingenuo Mouse
<ol><li>Tenere tutti i topi per esperimenti di immunizzazione in uno specifico impianto privo di agente patogeno animale.</li>
	<li>Uso genere-abbinato, giovane adulto (8 – 12 settimane) knockout e littermate controllare topi che condividono gli stessi genitori e gabbie per gli studi di immunizzazione.</li>
	<li>Pianificare l'immunizzazione e gli orari di raccolta del siero come raffigurato nella Figura 1.</li>
	<li>Vendemmia ingenuo siero di ogni mouse a 7 giorni (7 giorni) prima di immunizzazione. Seguire le procedure di preparazione del siero e di spurgo del retro-orbitale come dettagliato di seguito nel passaggio 4.</li>
</ol>2. preparazione del TNP-polisaccaride (un antigene TI) e TNP-KLH (un antigene TD)
<ol><li>Sciogliere le polveri di antigene in PBS sterile (pH 7.4) completamente per essere 0,5 mg/mL di brodo di TNP-polisaccaride e 1 mg/mL delle soluzioni madre TNP-KLH. Aliquotare ogni antigene stock soluzione in provette sterili microfuge 0,5 mL/Tube e mantenere le aliquote a-80 ° C per la conservazione a lungo termine. Evitare più gelo e disgelo delle aliquote dell'antigene.</li>
	<li>Il giorno di iniezione, calcolare il volume di TNP-polisaccaride (50 µ g/100 µ l/mouse) o TNP-KLH (100 µ g/100 µ l/topo) necessari in base al numero di topi per essere iniettato. Scongelare il numero appropriato di TNP-polisaccaride o TNP-KLH aliquote a temperatura ambiente (TA).</li>
	<li>Iniettabile di TNP-KLH, prima di diluire l'adiuvante di allume (40 mg/mL) con 3 volumi di PBS sterile ad una concentrazione finale di 10 mg/mL. Assicurarsi che la miscela di adiuvante di allume è ben sospesa prima diluizione.</li>
	<li>Combinare uguale volume di liquame di adiuvante di allume 10mg/mL da passo 2.3 e la soluzione di TNP-KLH scongelata (1 mg/mL) in una provetta di polipropilene da 5 mL, mescolare bene e incubare a 37 ° C per 30 min. Prepare questo TNP-KLH/allume mescolare appena prima dell'iniezione.</li>
</ol>3. immunizzazione dei topi
<ol><li>Eseguire l'iniezione intraperitoneale (i.p.) di TNP-polisaccaride o TNP-KLH/allume per immunizzare i topi con siringhe da insulina 1 mL in un armadio di sicurezza biologica. Inserire l'ago all'angolo di 30° circa, preferibilmente nel quadrante in basso a destro di ogni mouse per impedire injection in organi interni.</li>
	<li>Iniettare i.p. 100 µ l di TNP-polisaccaride per topo il giorno 0 per immunizzazione TI Ag (Figura 1A).</li>
	<li>Iniettare i.p. 200 µ l della miscela TNP-KLH/allume (preparata nel passaggio 2.4) per topo il giorno 0 per immunizzazione TD Ag. Ripetere l'iniezione stessa il giorno 21 come una vaccinazione di richiamo per gli studi di memoria (Figura 1B).</li>
	<li>Dopo l'iniezione, tornare ogni mouse alla sua gabbia e mantenere tutti i topi iniettati in condizione da organismi patogeni specifici.</li>
</ol>4. retro-orbitale sanguinamento e preparazione del siero
<ol><li>Sieri di mouse in diversi momenti della raccolta: per l'immunizzazione di TNP-polisaccaride, raccogliere sieri del mouse sul giorno -7 e 7 (Figura 1A); per l'immunizzazione di TNP-KLH/allume, raccogliere sieri del mouse sul giorno -7, 7, 14 e 28 (Figura 1B).</li>
	<li>Per Retro-orbitale sanguinamento, anestetizzare ogni mouse con isoflurano 5% per 1 – 2 min in un armadietto di biosicurezza25. Eseguire pedale reflex per garantire un'anestesia adeguata di ogni mouse.</li>
	<li>Tenere premuto il mouse anestetizzato in una mano con l'indice e il pollice tirando la pelle intorno al bulbo oculare indietro in modo che il bulbo oculare sporge fuori la presa25. Inserire una pipetta di Pasteur non eparinizzato o tubo capillare ad un angolo di 45° nell'angolo interno della cavità oculare sotto il bulbo oculare25.</li>
	<li>Applicare una leggera pressione verso il basso e ruotare la pipetta o il tubo dolcemente a rompere nella vena e raccogliere 150 – 200 µ l di sangue nella pipetta o tubo. Immediatamente trasferire il sangue in una provetta di microfuge sterili da 1,5 mL e tornare il mouse alla sua gabbia per recuperare.</li>
	<li>Cosi ' il sangue campioni sedersi al RT per 1 – 2 h coagulare.</li>
	<li>Centrifugare i campioni di sangue coagulato a 13.000 x g per 10 min a 4 ° C. Trasferire il siero chiaro in cima il coagulo di sangue in una provetta di microfuge sterili da 1,5 mL nuovo.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 4.6 ancora una volta per rimuovere il coagulo di sangue residuo e raccogliere il siero chiaro.</li>
	<li>Aliquota del siero nei tubi del microfuge sterili da 1,5 mL 50 µ l/Tube e conservare i sieri a-80 ° C.</li>
	<li>Si alternano l'occhio per sanguinamento in momenti diversi in modo che ogni occhio è bled al massimo due volte per l'intero esperimento. Al terminale del sanguinamento, è possibile raccogliere fino a 1 mL di sangue da ogni mouse prima di eutanasia. Eutanasia il mouse con 5% CO2 seguita da dislocazione cervicale. Nota: Le cellule B splenica possono essere raccolto per analisi cytometric di flusso e gli studi della coltura in vitro . Prepariamo anche DNA genomico da splenocytes per verificare il genotipo di ogni mouse.</li>
</ol>5. Mouse Ig specifici ELISA
<ol><li>
Preparare i buffer e soluzioni prima di ELISA.
	<ol>
<li>Preparare 500 mL di accoppiamento Buffer (PBS, pH 7.4).</li>
		<li>Preparare 500 mL di soluzione di lavaggio (PBS-T (0.05% Tween 20), pH 7.4).</li>
		<li>Preparare 100 mL di tampone di blocco (BSA 1% in PBS, pH 7.4, conservato a 4 ° C).</li>
		<li>Preparare 1 L di tampone substrato (1m dietanolammina, pH 9,8 (97 mL di dietanolammina in 1 L di H2O, pH regolato con 10 M HCl) e 0,5 mM MgCl2). Proteggere il tampone del substrato dalla luce avvolgendo la bottiglia con carta stagnola. Conservare a 4 ° C.</li>
		<li>Preparare 100 mL di soluzione di arresto (3 M NaOH).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rivestire le piastre ELISA:
	<ol>
<li>Per totale del siero Ig isotipo ELISA, cappotto piastre a 96 pozzetti immuno 10 µ g/ml di specifici attiva policlonale di capra anti-mouse Ig (M, G1, G2a, G2b, G3, A o E) Abs in accoppiamento Buffer (PBS) a 100 µ l/pozzetto.</li>
		<li>Per Ig TNP-specifico isotipo ELISA, cappotto piastre a 96 pozzetti immuno 10 µ g/ml di TNP(38)-BSA in PBS a 100 µ l/pozzetto.</li>
		<li>Per alta affinità specifici TNP Ig isotipo ELISA, cappotto piastre a 96 pozzetti immuno 10 µ g/ml di TNP(3)-BSA in PBS a 100 µ l/pozzetto26. Incubare le piastre a 4 ° C durante la notte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo l'incubazione di rivestimento, lavare le piastre 2 volte con 200 µ l/pozzetto di PBS-T. Gettare il tampone di lavaggio e macchia asciugare le piastre (tocca ogni piastra capovolta su una pila di asciugamani di carta) dopo ogni lavaggio.</li>
	<li>Bloccare le piastre: aggiungere 200 µ l/pozzetto di Blocking Buffer (1% BSA in PBS) nelle piastre rivestite e incubare le piastre per 1 h a TA.</li>
	<li>
Mentre stanno bloccando le piastre, preparare diluizioni dello standard di isotipo Ig e campioni di siero in blocco Buffer in una piastra a 96 pozzetti separato, non trattato a 150 µ l/pozzetto.
	<ol>
<li>Preparare 250 standard di isotipo Ig ng/mL come la concentrazione iniziale di standard (St01) e fare 7 su 10 di diluizioni seriali 1:2 delle norme Ig (St02 St07 o St10, Figura 2A).</li>
		<li>Preparare il siero del mouse fattore come la diluizione iniziale di campioni a una diluizione 1: 100 o 1: 500 e fare 3 o 4 di 01:10 diluizioni seriali per totale Ig isotipo o diluizioni seriali 1:5 per isotipo Ig TNP-specifiche di ciascun campione di siero (Figura 2A). Per IgE ELISA, preparare i campioni di siero del mouse a un fattore di diluizione di 1:2 come la diluizione iniziale e fare 3 di diluizioni seriali 1:5 di ogni campione di siero.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo il blocco, lavare i piatti dal passaggio 5.4 tre volte con 200 µ l/pozzetto di PBS-T e macchia asciugare le piastre dopo ogni lavaggio.</li>
	<li>Trasferire 100 µ l/pozzetto di diluito standard di isotipo Ig (appropriato per la cattura e la rilevazione dell'Abs) e campioni di siero diluito dal passaggio 5.5 alle piastre preparate al punto 5.6. Incubare le piastre con gli standard e i campioni a 4 ° C durante la notte.</li>
	<li>Lavare le piastre 3 volte con 200 µ l/pozzetto di PBS-T e macchia asciugare le piastre dopo ogni lavaggio.</li>
	<li>In ogni piatto, aggiungere 100 µ l/pozzetto di 10 µ g/mL di un'appropriato della fosfatasi alcalina (AP)-anti-topo di capra coniugata con specifico isotipo Ig (M, G1, G2a, G2b, G3, A o E) Abs diluito in un tampone di bloccaggio.</li>
	<li>Incubare le piastre con AP-coniugato Abs per 1-2 h a TA. Per il rilevamento di IgE, incubare le piastre per 1 – 2 h a 37 ° C.</li>
	<li>Preparare 1 mg/mL di soluzione di substrato sciogliendo due compresse di substrato di fosfatasi 5 mg in 10 mL di tampone substrato.</li>
	<li>Lavare ogni piastra 5 volte con 200 µ l/pozzetto di PBS-T e macchia asciugare le piastre dopo ogni lavaggio.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l/pozzetto di soluzione di substrato in ogni piatto. Consentire la reazione a svilupparsi a RT, che di solito richiede solo pochi minuti.</li>
	<li>
Leggere ogni piastra a 405 nm utilizzando un lettore di micropiastre con il suo software associato.
	<ol>
<li>Fare clic su "Impostazioni" per impostare le lunghezze d'onda "Lm1" presso "405 nm" e fare clic su "OK".</li>
		<li>Fare clic su "Template" per assegnare il "vuoto" pozzi, pozzi "standard" e "sconosciuto" secondo il programma di installazione di piastra a 96 pozzetti.</li>
		<li>Per pozzi "standard", fare clic su "serie" per impostare il "Primo esempio di"come"St01", selezionare "Inizia da" al "Top" e impostare "replica" come "2". Verifica"Campione Descriptor" e "Valore Standard" di input: selezionare "unità"come"ng/mL", impostare "valore a partire" come "250", impostare "passaggio da" come "2". Fare clic su "OK".</li>
		<li>Clicca su "Leggi" per leggere la piastra quando la maggior parte concentrati standard raggiunge una densità ottica (OD) di ~ 1.</li>
		<li>Fare clic sul menu "File" e fare clic su "Salva" per salvare il file.</li>
		<li>Fare clic su "Read" per leggere la piastra nuovamente quando lo standard più concentrato si avvicina OD405 di ~ 1.5, 2 e 2.5, rispettivamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fermare la reazione aggiungendo 25 µ l/pozzetto di 3 M NaOH. La procedura 5.12-5.15 per un piatto alla volta.</li>
	<li>
Analizzare i dati di ELISA utilizzando il software associato il lettore di micropiastre:
	<ol>
<li>Controllare i valori di OD405 gli standard di isotipo Ig di leggere file e selezionare una lettura adeguata con buona gamma lineare degli standard per l'analisi dettagliata dei dati.</li>
		<li>Selezionare il programma di montaggio 4 parametri per tracciare curve standard. Controllare il coefficiente della curva standard (R2), che è richiesta di essere > 0.98 per garantire dati di buona qualità.</li>
		<li>Verifica se i valori di OD405 di ogni campione di diminuiscono con l'aumento di fattori di diluizione. Recuperare la concentrazione di tutti i pozzetti campione diluito facendo clic su "Incognite".</li>
		<li>Selezionare un pozzo appropriato di ciascun campione con OD405 nell'intervallo lineare della curva standard isotipo Ig per il calcolo della concentrazione.</li>
		<li>Calcolare la concentrazione di isotipo Ig di ciascun campione utilizzando la formula del siero: concentrazione di Ig del siero = concentrazione di ben selezionato x fattore di diluizione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tracciare grafici ed eseguire analisi statistiche utilizzando un software appropriato9,10,11. Fare grafici a dispersione verticale del siero i livelli di isotipo Ig per confrontare le risposte di Ig presso lo stesso punto di tempo. Per gli studi di reazione di memoria TD, fare le curve di risposta di corso di tempo per esaminare le risposte di isotipo Ig prima e dopo la vaccinazione di richiamo. Utilizzare barre di errore per mostrare la deviazione standard (SD) di ciascun gruppo di campioni. Per confrontare le risposte di isotipo Ig tra due genotipi dei topi, utilizzare lo spaiato t test per dati a due code per determinare la significatività statistica. Impostare il valore di p < 0,05 come significativamente diverso.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nessun concorrenti interessi finanziari.

Qui, descriviamo il protocollo per la caratterizzazione delle risposte di isotipo TD e TI Ig in topi usando ELISA. Efficace attuazione del presente protocollo richiede l'uso di materiali specificati in tabella 1, compreso le piastre di dosaggio ELISA, immunizzazione Ags, mouse Ig specifici anticorpi e standard. Prestare la massima attenzione per evitare di utilizzare piastre di coltura del tessuto trattato per ELISA. Diluizioni degli standard e dei campioni di siero dovrebbero essere fatte in piastre sep...

I linfociti B sono il principale attore in immunità umorale e l'unico tipo di cellula in mammiferi che sono in grado di produrre anticorpi, anche definiti come le immunoglobuline (Ig)1,2. Gli anticorpi secernuti dalle cellule di B forniscono una difesa formidabile contro l'invasione patogeni tramite diversi meccanismi di neutralizzazione, opsonizzazione e l'attivazione del complemento, che conduce a un'immunità protettiva3. Secrezione di anticorpi dalle cellule di B si raggiunge solo dopo la completa attivazione di cellule B specifiche, che normalmente richiede che due distinti segnali3. Segnale 1 viene inoltrato da binding diretto dell'antigene (Ag) per il recettore delle cellule B (BCR) espresso sulla superficie delle cellule di B ingenui specifiche3. A seconda della fonte di segnale 2, attivazione delle cellule B può essere suddivisa in timo-dipendenti (TD) o timo-indipendenti (TI)3,4. In risposta all'antigene un TD, segnale 2 è fornito da attivato cognate CD4 linfociti T helper (TH), che esprimono CD154, il ligando per il recettore co-stimolatore CD40 espresso sulle cellule di B1,2,3. In risposta all'antigene una TI, 2 segnale proviene da entrambi fidanzamento dei Toll-like receptors (TLRs nel caso tipo 1 TI Ag) o cross-linking vasto del BCRs (nel caso di tipo 2 TI Ag) sulla B cellule3,4. Gli antigeni di TI (TI-1) di tipo 1 sono microbiche ligandi dei TLR, inclusi lipopolisaccaridi batterici (LPS), RNA virale e microbica CpG DNA4,5. Gli antigeni di TI (TI-2) di tipo 2 hanno struttura altamente ripetitiva e sono in grado di fornire prolungata e persistente segnalazione alla cella B da più cross-linking del BCRs4,6. Tipici esempi di antigeni TI-2 pneumococcici polisaccaridi e polisaccaride coniugato aptene6,7. Gli antigeni sia TD e TI possono suscitare risposte antigene-specifiche IgM di robuste e possono anche indurre la produzione di anticorpi isotipo-switched (IgG, IgA e IgE) con l'aiuto fornito dall'antigene che presenta le cellule (APCs) quali le cellule dendritiche (DCs)1 ,2,3. Inoltre, gli antigeni sia TD e TI sono in grado di indurre risposte di memoria con l'aiuto di APC, ma gli antigeni TD sono più efficienti a indurre la memoria delle cellule di B generazione3,8.
In questo protocollo, TD e TI Ig risposte sono tratte in topi tramite immunizzazione intraperitoneale (i.p.) con emocianina di modello aptene coniugato antigeni 2, 4,6-trinitrophenyl-keyhole limpet (TNP-KLH) e TNP-polisaccaride (neutro, molto ramificato e a massa elevata), rispettivamente9,10,11. Gli antigeni TD sono usati solitamente con un adiuvante per migliorare la produzione di anticorpi12. Qui nel nostro protocollo, TNP-KLH viene iniettato con allume, un adiuvante comunemente utilizzato in studi di immunizzazione12. Altri esempi di coadiuvanti che possono essere utilizzati completa o incompleta l'adiuvante di Freund (CFA o IFA), monofosforil-lipidico A / trehalose dicorynomycolate ("Ribi" adiuvante) e CpG oligodeoxynucleotides, ecc.13, 14. dopo immunizzazione, sieri del mouse sono stati raccolti in diversi momenti e gli anticorpi di TNP-specifici nel siero sono quantificati tramite Ig specifici enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) dosaggio9,10, 11.
ELISA è un saggio basato su piastra che è ampiamente usato come uno strumento di diagnostica in medicina e anche come strumento analitico in ricerca biomedica15,16. Esso viene utilizzato per rilevare e quantificare analiti compresi gli anticorpi, ormoni, citochine, chemochine e vari antigeni, ecc. ELISA può essere eseguita in diversi formati, tra cui diretto, indiretto, panino e competitivo ELISA15,16. In generale, coinvolge l'immobilizzazione dell'antigene ad una superficie solida, solitamente una piastra microtiter a 96 pozzetti, che viene incubata con un anticorpo primario. Dopo l'incubazione, l'anticorpo non legato è lavato via. In una ELISA diretta, l'anticorpo primario è direttamente coniugato ad un enzima (tipicamente perossidasi o fosfatasi alcalina), che può fendere un substrato cromogenico per produrre un cambiamento di colore visibile rilevato da uno strumento di rilevamento del segnale come un spettrofotometro15,16. Al contrario, se un anticorpo secondario enzima-collegata è usato per legare l'anticorpo primario, quindi questo è considerato come un'indiretta ELISA15,16. ELISA diretta è più velocemente mentre ELISA indiretto è più sensibile15,16. In un panino ELISA, le piastre sono rivestite con un anticorpo di "cattura" utilizzato per immobilizzare l'antigene di interesse nei campioni, e quindi l'antigene catturato può essere rilevato da un altro anticorpo di "rilevazione" in un modo diretto o indiretto15, 16. Sandwich ELISA offre alta specificità poiché l'antigene viene rilevato da due differenti anticorpi dell'antigene. In una ELISA competitivo, è istituita la competizione tra l'antigene del campione e l'antigene associato a piastra per il legame dell'anticorpo primario, e quindi alla concentrazione di antigene nel campione è quantificata misurando la riduzione del segnale dal substrato 15 , 16. ELISA competitivo può essere eseguita utilizzando il formato di diretto o indiretto di cui sopra ed è utile per la rilevazione degli antigeni piccoli con un solo epitopo15,16.
Tecniche alternative per la misurazione degli anticorpi comprendono radioimmunoanalisi (RIA), dosaggio elettrochemiluminescenza (ECL) analisi e superficie di risonanza plasmonica (SPR)17. RIA è stato il primo immunoassay sviluppato misure che la presenza di un antigene (o l'anticorpo) con elevata specificità e sensibilità usando reagenti radiomarcato18,19. Tuttavia, a causa delle preoccupazioni di tossicità radioattiva, i costi di smaltimento, shelf-life e licenze speciali per lavorare con materiali radioattivi, ELISA è una migliore e più conveniente tecnica comune utilizza20,21. ECL è un test altamente sensibile in cui reazioni chemiluminescenti sono avviate usando l'elettricità per generare specie altamente reattive da precursori stabili sulla superficie di un elettrodo e possono essere utilizzate per misurare la quantità di analiti (come antigeni o gli anticorpi)22. Tuttavia, ECL richiede uno strumento speciale e così non è usato nel senso più ampio come ELISA23. SPR è un dosaggio diretto che può essere utilizzato per misurare il grippaggio dei ligands (ad es., anticorpi) per immobilizzato molecole (ad es., antigeni) su un sensore chip superficie24. SPR rileva le interazioni in tempo reale in modo molto specifico e non richiede l'uso di reagenti etichettati come ELISA. Tuttavia, SPR inoltre richiede un'attrezzatura speciale e ha una sensibilità inferiore rispetto ELISA17. Date le limitazioni dei metodi alternativi, ELISA è la tecnica più adatta e conveniente per il nostro scopo in questo protocollo. Qui, descriviamo l'uso di sandwich ELISA per l'analisi dei livelli di isotipo Ig totali e le procedure di ELISA indiretto per l'analisi dell'antigene-specifiche Ig isotipi.

<table><tbody><tr><td>VersaMax Tunable Microplate Reader</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>VERSAMAX</td><td>Apparecchiature per la lettura delle piastre</td></tr><tr><td>SOFTmax PRO 5.3</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>SOFTmax PRO 5.3</td><td>Software per il lettore di piastre</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Prism Software per la rappresentazione grafica e statistica</td></tr><tr><td>TNP-AECM-polisaccaride (FICOLL)</td><td>Biosearch Technologies</td><td>F-1300-10</td><td>A TI Ag per l'immunizzazione</td></tr><tr><td>TNP-KLH</td><td>Biosearch Technologies</td><td>T-5060-5</td><td>A TD Ag per l'immunizzazione</td></tr><tr><td>TNP(38)-BSA</td><td>Biosearch Technologies</td><td>T-5050-10 (rapporto di coniugazione: 38)</td><td>Coating Ag per ELISA TNP-specifico</td></tr><tr><td>TNP(3)-BSA</td><td>Biosearch Technologies</td><td>T-5050-10 (rapporto di coniugazione: 3)</td><td>Coating Ag per l'allume Ig Imject TNP-specifico ad alta affinità</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>PI-77161</td><td>Coadiuvante allume per l'immunizzazione</td></tr><tr><td>Falcon Provette in polipropilene</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-959-11A</td><td>Per l'incubazione di TNP-KLH/allume</td></tr><tr><td>BD Siringa da insulina</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-829-1B</td><td>Per iniezione i.p. di topi</td></tr><tr><td>Piastre Immuno a 96 pozzetti, fondo piatto</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-245-61</td> Per micropiastre <td>ELISA</td></tr><tr><td>a 96 pozzetti non trattate, fondo tondo</td><td>VWR</td><td>82050-622</td><td>Per diluizioni seriali di standard e campioni</td></tr><tr><td>Substrato di fosfatasi, 5 mg Compresse</td><td>Sigma</td><td>S0942-200TAB</td><td>Substrato AP</td></tr><tr><td>Dietanolammina</td><td>VWR</td><td>IC15251690</td><td>Un componente del tampone del substrato AP</td></tr><tr><td>Capra anti-topo</td><td>IgM SouthernBiotech</td><td>1020-01</td><td>Cattura Ab per topo IgM</td></tr><tr><td>Capra anti-topo IgG1</td><td>SouthernBiotech</td><td>1070-01</td><td>Cattura Ab per topo IgG1</td></tr><tr><td>Capra anti-topo IgG2a</td><td>SouthernBiotech</td><td>1080-01</td><td>Cattura Ab per topo IgG2a</td></tr><tr><td>Capra anti-topo IgG2b</td><td>SouthernBiotech</td><td>1090-01</td><td>Cattura Ab per topo IgG2b</td></tr><tr><td>Capra anti-topo IgG3</td><td>SouthernBiotech</td><td>1100-01</td><td>Capture Ab per topo IgG3</td></tr><tr><td>Capra anti-topo IgA</td><td>meridionaleBiotech</td><td>1040-01</td><td>Cattura Ab per topo IgA</td></tr><tr><td>Capra anti-topo IgE</td><td>meridionaleBiotech</td><td>1110-01</td><td>Cattura Ab per topo IgE</td></tr><tr><td>AP-Capra anti-topo IgM</td><td>meridionaleBiotech</td><td>1020-04</td><td>Rilevamento Ab per topo IgM</td></tr><tr><td>AP-Capra anti-topo IgG1</td><td>meridionaleBiotech</td><td>1070-04</td><td>Rilevamento Ab per topo IgG1</td></tr><tr><td>AP-Goat anti-mouse IgG2a</td><td>SouthernBiotech</td><td>1080-04</td><td>Rilevamento Ab per topo IgG2a</td></tr><tr><td>AP-Goat anti-mouse IgG2b</td><td>SouthernBiotech</td><td>1090-04</td><td>Detection Ab per topo IgG2b</td></tr><tr><td>AP-Goat anti-mouse IgG3</td><td>SouthernBiotech</td><td>1100-04</td><td>Rilevamento Ab per topo IgG3</td></tr><tr><td>AP-Goat anti-mouse</td><td>IgA SouthernBiotech</td><td>1040-04</td><td>Rilevamento Ab per topo IgA</td></tr><tr><td>AP-Goat anti-mouse IgE</td><td>SouthernBiotech</td><td>1110-04</td><td>Rilevamento Ab per topo IgE</td></tr><tr><td>IgM di topo standard</td><td>BD Biosciences</td><td>553472</td><td>TNP-specifiche IgM, clone&nbsp; G155-228</td></tr><tr><td>IgG1 di topo standard</td><td>BD Biosciences</td><td>554054</td><td>IgG1 TNP-specifiche, clone&nbsp; 107.3</td></tr><tr><td>IgG2a di topo standard</td><td>BD Biosciences</td><td>556651</td><td>IgG2a TNP-specifiche, clone&nbsp; G155-178</td></tr><tr><td>IgG2b di topo standard</td><td>BD Biosciences</td><td>554055</td><td>IgG2b specifiche per TNP, clone&nbsp; 49.2</td></tr><tr><td>IgG3 di topo standard</td><td>BD Biosciences</td><td>553486</td><td>IgG3 specifiche per KLH, clone&nbsp; A112-3</td></tr><tr><td>IgA di topo standard</td><td>BD Biosciences</td><td>550924</td><td>IgA indotte da olio minerale, clone MOPC-320</td></tr><tr><td>IgE di topo standard</td><td>BD Biosciences</td><td>557079</td><td>IgE specifiche per TNP, clone C38-2</td></tr></tbody></table>

caratterizzazione delle risposte di isotipo dell'immunoglobulina timo-dipendenti e indipendenti del timo in topi usando l'analisi enzima-collegata dell'immunosorbente

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Anticorpi, anche definiti come differenziano immunoglobuline (Ig), secernute dai linfociti B, cellule di plasmablasts/plasma, nell'immunità umorale forniscono una formidabile difesa contro l'invasione patogeni tramite diversi meccanismi. Uno degli obiettivi principali della vaccinazione è di indurre anticorpi protettivi di antigene-specifiche per prevenire le infezioni pericolose per la vita. Timo-dipendenti (TD) e gli antigeni timo-indipendenti (TI) possono suscitare risposte antigene-specifiche IgM di robuste e possono anche indurre la produzione di anticorpi isotipo-switched (IgG, IgA e IgE) così come la generazione di cellule B di memoria con l'aiuto fornito dalla (APCs) di cellule presentanti l'antigene. Qui, descriviamo un protocollo per caratterizzare le risposte di isotipo TD e TI Ig nei topi utilizzando analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA). In questo protocollo, TD e TI Ig risposte sono tratte in topi tramite intraperitoneale (i.p.) immunizzazione con antigeni coniugato aptene modello TNP-KLH (in allume) e TNP-polisaccaride (in PBS), rispettivamente. Per indurre la risposta di memoria TD, un'immunizzazione di booster di TNP-KLH in allume è dato a 3 settimane dopo la prima immunizzazione con l'antigene stesso/adiuvante. Sieri di mouse vengono raccolte in diversi momenti prima e dopo l'immunizzazione. I livelli del siero Ig totali e anticorpi specifici per TNP successivamente sono quantificati tramite Ig specifici Sandwich ed ELISA indiretto, rispettivamente. Per quantificare correttamente la concentrazione nel siero di ogni isotipo Ig, i campioni devono essere opportunamente diluito per adattarsi all'interno della gamma lineare delle curve standard. Usando questo protocollo, abbiamo ottenuto sempre risultati affidabili con sensibilità e alta specificità. Quando usato in combinazione con altri metodi complementari quali la citometria a flusso, cultura in vitro di cellule di B spleniche e immunohistochemical che macchiano (IHC), questo protocollo permetterà ai ricercatori di acquisire una comprensione globale dell'anticorpo risposte in una determinata impostazione sperimentale.

Abbiamo usato questo protocollo per indagare i ruoli di un critico regolatore del sistema immunitario, TRAF3, a TI e TD Ig isotipo risposte9,10,11. TRAF3 direttamente o indirettamente regola la trasduzione del segnale di un numero di recettori immuni innati e adattivi, tra cui la superfamiglia dei recettori del TNF, recettori Toll-like e T cell receptor/CD28, tra gli altri27</su...

In questo articolo, descriviamo un protocollo per caratterizzare le risposte di isotipo dell'immunoglobulina (Ig) T-dipendenti e T-indipendente in topi usando ELISA. Questo metodo usato da solo o in combinazione con flusso cytometry permetterà ai ricercatori di identificare le differenze nelle risposte di isotipo Ig B cellulo-mediata nei topi dopo immunizzazione antigene T-dipendente e T-indipendente.

Caratterizzazione delle risposte di isotipo dell'immunoglobulina timo-dipendenti e indipendenti del timo in topi usando l'analisi enzima-collegata dell'immunosorbente

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia sulle risposte anticorpali dipendenti e indipendenti indotte dall'immunizzazione con l'antigene, nonché sull'attivazione delle cellule B e sulle reazioni del centro germinale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce misurazioni affidabili e quantitative della risposta all'isotipo Ig con un confronto diretto dell'attivazione delle cellule B e dell'immunità umorale nei topi. Per l'immunizzazione con polisaccaridi TNP, caricare una siringa da insulina da un millilitro per topo con 100 microlitri di soluzione antigenica appena preparata e inserire l'ago nel quadrante inferiore destro di ciascun animale con un angolo di circa 30 gradi per evitare l'iniezione di organi inferiori.Quando tutti i topi sono stati iniettati, riportare gli animali nelle loro gabbie per la stabulazione in una struttura specifica priva di agenti patogeni. Ai tempi sperimentali appropriati, raccogliere da 150 a 200 microlitri di sangue da ciascun animale immunizzato mediante sanguinamento retro-orbitale e lasciare coagulare i campioni a temperatura ambiente per una o due ore. Al termine dell'incubazione, centrifugare i campioni di sangue coagulato e trasferire il siero chiaro dalla parte superiore di ciascun coagulo di sangue in una provetta sterile da microcentrifuga da 1,5 millilitri.Dopo una seconda centrifugazione per rimuovere eventuali residui di coaguli di sangue, trasferire 50 microlitri di siero in singole provette sterili da microcentrifuga da 1,5 millilitri per la conservazione a meno 80 gradi Celsius. Prima della piastratura, rivestire le singole piastre immunoidrauliche a 96 pozzetti con la concentrazione appropriata di anticorpi di cattura specifici per l'isotipo Ig di topo per l'isotipo Ig sierico totale, l'antigene TNP-38BSA per l'isotipo Ig TNP-specifico o l'antigene TNP-3BSA per l'isotipo Ig TNP-specifico ad alta affinità e incubare le piastre rivestite per una notte a quattro gradi Celsius. La mattina successiva lavare le piastre due volte con 200 microlitri di tampone di lavaggio per pozzetto.Scartare il tampone di lavaggio e asciugare i piatti su una pila di carta assorbente dopo ogni lavaggio. Successivamente, bloccare le piastre con 200 microlitri di tampone bloccante per pozzetto per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente. Mentre le piastre vengono bloccate, preparare le diluizioni standard e di siero appropriate e il tampone di blocco in una piastra separata da 96 pozzetti non trattata a 150 microlitri per pozzetto, come indicato.Quindi lavare la piastra ELISA con il tampone di lavaggio come dimostrato e aggiungere 100 microlitri di ogni standard di isotipo di Ig diluito e campione di siero nei pozzetti appropriati della piastra ELISA. Dopo un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius, lavare le piastre come dimostrato e aggiungere 100 microlitri di un appropriato anticorpo isotipo specifico coniugato con fosfatasi alcalina diluito in tampone bloccante a ciascun pozzetto per un'incubazione di una o due ore a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare le piastre e aggiungere 100 microlitri di soluzione di substrato appena preparata in ogni pozzetto.Monitoraggio della reazione mentre si sviluppa nei minuti successivi a temperatura ambiente. Quando la reazione è sufficientemente robusta da poter essere analizzata, posizionare la piastra in un lettore di micropiastre e fare clic su Impostazioni per impostare la lunghezza d'onda a 405 nanometri. Fare clic su ok, quindi fare clic su modello per assegnare i pozzetti vuoti, standard e sconosciuti appropriati in base alla configurazione della piastra a 96 pozzetti.Quindi, quando lo standard più concentrato raggiunge una densità ottica di circa uno, 1,5, due e 2,5, fare clic su lettura per leggere la lastra e salvare il file di dati risultante dopo ogni analisi. In assenza di immunizzazione, si osserva un aumento dei livelli sierici basali di IgM, IgG2a, IgG2b, IgG3 e IgA nei topi knockout con fattore tre associato al recettore TNF specifico delle cellule B o B-TRAF3, rispetto agli animali di controllo B-TRAF3 con cucciolata sufficiente per sesso ed età. Sette giorni dopo l'immunizzazione con TNP-polisaccaride o TNP-KLH, come appena dimostrato, l'analisi delle risposte dell'isotipo Ig timo-indipendente all'immunizzazione rivela livelli significativamente più elevati di IgG3 TNP-specifici thymus-independent e livelli elevati di IgG2b TNP-specifici thymus-dependent nei topi knockout TRAF3 specifici per le cellule mieloidi rispetto ai controlli della cucciolata.Inoltre, la valutazione delle risposte primarie e di memoria del topo timo-dipendente all'immunizzazione TNP-KLH indica la presenza di risposte primarie IgM timo-dipendenti parzialmente diminuite e di risposte primarie e di memoria IgG1 difettose nei topi knockout per TRAF3 specifici per le cellule T. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che l'ELISA ha limiti di rilevamento che sono solitamente definiti dall'intervallo lineare delle curve standard e quindi potrebbero essere necessarie più diluizioni del campione. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi complementari come la citometria a flusso o il punto L per ottenere una comprensione completa delle risposte anticorpali in un determinato contesto sperimentale.

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Questo video dimostra un metodo per valutare la risposta immunitaria degli anticorpi a un nuovo vaccino adiuvante a nanoemulsione in topi pre-immunizzati. L'immunizzazione migliora la risposta anticorpale, come confermato dalla determinazione dei titoli anticorpali IgG.

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L'analisi in vitro della ricombinazione del cambio di classe nei topi è impegnativa a causa delle molecole IgE citofile legate ai recettori Fc sulla superficie delle cellule B.  Descriviamo un metodo per la rilevazione delle IgE utilizzando la scissione mediata dalla tripsina delle IgE legate alla superficie prima della fissazione e della permeabilizzazione per la colorazione a fluorescenza citoplasmatica.

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Questo rapporto fornisce una descrizione dettagliata del trapianto di timo murino da diversi topi donatori anziani sotto la capsula renale di riceventi di topi immunodeficienti. L'obiettivo di questo approccio è quello di modellare lo sviluppo delle cellule T e gli eventi di selezione timica in vivo.

Isolamento e Trapianto di diversi invecchiato murini del timo innesti.

Le cellule T CD4+ ingenue si polarizzano in vari sottoinsiemi a seconda dell'ambiente al momento dell'attivazione.  La differenziazione delle cellule T CD4+ naive in vari sottogruppi di effettori può essere ottenuta in vitro attraverso l'aggiunta di stimoli recettoriali delle cellule T e segnali specifici delle citochine.

Mouse Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento T cellulare e<em&gt; In vitro</em&gt; Differenziazione in T sottopopolazioni cellulari

Questo articolo descrive la metodologia in vivo e in vitro per caratterizzare i progenitori di sedimentazione timica mediante l'analisi della cinetica di generazione, fenotipo e numero della loro progenie di cellule T.

Caratterizzazione di timica assestamento Progenitori nell&#39;embrione mouse Uso<em&gt; In Vivo</em&gt; E<em&gt; In Vitro</em&gt; Saggi

Viene presentato un protocollo ottimizzato per la generazione di anticorpi monoclonali basati sulla tecnologia degli ibridomi. I topi sono stati immunizzati con un immunoconiugato. Le cellule della milza sono state fuse mediante PEG e un impulso elettrico con cellule di mieloma immortale. Le cellule di ibridoma produttrici di anticorpi sono state selezionate mediante HAT e screening ELISA antigene-specifico.

Generazione di Murine anticorpi monoclonali da ibridomi Tecnologia

Farmaci a base di anticorpi hanno rivoluzionato il trattamento per le malattie infiammatorie. Oltre ad avere effetti diretti su target specifici, gli anticorpi possono attivare i macrofagi per diventare anti-infiammatori. Questo protocollo descrive come antinfiammatorio del macrofago attivazione può essere valutato in vitro utilizzando macrofagi del midollo osseo del topo e in vivo, utilizzando i macrofagi peritoneali.

Valutazione degli effetti di farmaci a base di anticorpi sul midollo osseo murino e l'attivazione dei macrofagi peritoneali

In questo studio, presentiamo un romanzo e un efficace protocollo per l'isolamento dei linfociti da placche di Peyer (PPs), che può essere utilizzati successivamente per saggi funzionali in vivo ed in vitro come pure gli studi cytometric di flusso di follicolare T Helper e cellule centro germinale B.

Unraveling i giocatori chiave di immunità umorale: avanzata e ottimizzata protocollo di isolamento del linfocita da Patches murino placche di Peyer

Descriviamo qui una semplice analisi dell'eterogeneità del compartimento delle cellule B immunitarie murine nel peritoneo, nella milza e nei tessuti del midollo osseo mediante citometria a flusso. Il protocollo può essere adattato ed esteso ad altri tessuti di topo.

Caratterizzazione citometrica a flusso dello sviluppo delle cellule B murine

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Identificazione di rare cellule T antigene-specifiche da polmoni di topo con tetrameri del complesso peptide:istocompatibilità maggiore

Impara a caratterizzare le risposte di isotipo Ig timo-dipendenti e indipendenti nei topi usando l'ELISA. Questo metodo quantitativo permette di analizzare l'attivazione dei linfociti B e l'immunità umorale.

Caratterizzazione delle risposte di isotipo dellimmunoglobulina timo-dipendenti e indipendenti del timo in topi usando lanalisi enzima-collegata dellimmunosorbente (Video) | JoVE Journal

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