Un'analisi di virulenza batterica basata su immagine rapida usando ameba

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della patogenesi batterica, ad esempio quando gli effettori di virulenza che uccidono l'ospite sono espressi nelle cellule batteriche e quali sono gli stati di virulenza delle cellule implantoniche attaccate alla superficie? Il vantaggio principale di questa tecnica è che è veloce, quantitativa e le cellule ospiti sono relativamente facili da maneggiare. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo notato che la sottopopolazione implantonica di Pseudomonas ha diversi fenotipi di uccisione dell'ospite.

Per iniziare a coltivare il ceppo BR di E.coli durante la notte come indicato nel protocollo di testo. Quindi portare la coltura di E.coli a temperatura ambiente. Usando un bastoncino di legno, innoculare l'ameba in 750 l di coltura.

Aggiungere immediatamente 700 l della miscela di E.coli ameba in una piastra GYP. Inclinare la piastra per distribuire uniformemente la coltura sulla superficie della piastra. Quindi posizionare il piatto in una scatola che mantenga alta l'umidità.

Incubare la piastra all'interno della scatola a 22 C per quattro o cinque giorni. Al termine del periodo di incubazione, utilizzare una punta di pipetta sterile per raccogliere le spore dell'ameba da metà della piastra. Quindi pipettare su e giù per risospendere l'ameba sul puntale della pipetta in 1 mL di terreno PS.

Trasferire la miscela inoculata in un pallone da 250 mL con 25 mL di terreno PS integrato con soluzione antibiotica antimicotica. Coltivare l'ameba a 22 C in uno shaker rotante a 100 giri/min. Dopo aver coltivato Pseudomonas aeruginosa per una notte, diluire la coltura con PSB media in una capsula di Petri di 6 cm.

Quindi agitare la coltura su un rotatore da banco impostato a 100 giri/min a 37 C.Prima microonde 50 mL di agar all'1% in tampone DB in un pallone da 250 mL. Aggiungere 15 L di calcium AM ai 15 mL di agar fuso e mescolare delicatamente. Versare il composto di agar fuso in un piatto di vetro di 12 x 10 cm e lasciare solidificare l'agar per dieci minuti a temperatura ambiente.

Quindi, usa un righello di metallo e una griglia stampata per tagliare il tampone di agar solidificato in sezioni più piccole di 1,5 x 1,5 cm. Assicurati che il gel rimanga idratato fino a quando non è pronto per l'uso. Successivamente, per isolare le cellule attaccate alla superficie, rimuovere il mezzo liquido dalla capsula di Petri.

Quindi lavare il piatto con 1 mL di tampone di sviluppo per rimuovere le cellule planctoniche. Per saggiare la virulenza delle cellule batteriche attaccate alla superficie, aggiungere 10 L di cellule ameba dalle cellule batteriche attaccate alla superficie precedentemente ottenute. Per isolare le cellule planctoniche, trasferire 10 L di coltura in una capsula di Petri fresca.

Successivamente, saggiare la virulenza delle cellule planctoniche mescolando 10 L di cellule di ameba con i batteri planctonici precedentemente ottenuti. Posizionare immediatamente il piccolo tampone di agar sopra la miscela di ameba batterica appropriata sulla superficie della capsula di Petri. Quindi, rimuovere il liquido in eccesso pipettando delicatamente il liquido in eccesso e lasciare asciugare la piastra per 20 minuti.

Coprite il piatto con il coperchio e incubatelo a temperatura ambiente per altri 40 minuti. Infine, utilizzare un microscopio a fluorescenza per acquisire immagini per almeno 100 cellule di ameba. In questo protocollo, è stata analizzata la virulenza delle cellule planctoniche e di Pseudomonas aeruginosa attaccate alla superficie.

L'ameba selvatica di tipo Pseudomonas aeruginosa ha ucciso l'ameba, indicata da una forma rotonda della cellula dell'ameba e dalla presenza di fluorescenza della calceina. Rispetto alle cellule planctoniche, lo Pseudomonas aeruginosa wild type attaccato alla superficie aveva un alto indice di uccisione dell'ospite. Le cellule planctoniche sono state consumate dall'ameba, indicato dalla forma amorfa delle cellule dell'ameba e dalla fluorescenza relativamente piccola della calceina.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare una scorta fresca di calcina, cellule AM e ameba e tenere traccia della densità ottica dell'ameba. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il profilo di trascrizione per rispondere a ulteriori domande come: quali geni sono attivati nella sottopopolazione planctonica e attaccata alla superficie? Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come condurre il test di virulenza rapido basato su immagini.