Name: In Situ Tecniche di ibridazione per paraffina adulti coralli campioni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Scopri l'ibridazione in situ su campioni di corallo adulto inclusi in paraffina per visualizzare l'espressione spaziale dell'RNA. Questo metodo qualitativo permette di studiare i pattern di espressione genica nei tessuti corallini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato finanziato dal premio no. OCE-1323652 attraverso la National Science Foundation Ocean Science Postdoctoral Fellowship e il premio no.1012629 dal programma di arricchimento Postdoctoral di Burroughs Wellcome fondo.

1. rimozione di paraffina
Attenzione: Eseguire la procedura seguente sotto cappa aspirante.
<ol><li>Sparaffinatura le diapositive di paraffina sottile-sezionato con xilene 100% sotto il cofano in barattoli di vetro Coplin per 10 min. Non usare barattoli di plastica Coplin, come xilene si scioglie la plastica. Sterilizzare i barattoli di Coplin in autoclave prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare quattro barattoli di Coplin di vetro sterili con il seguente: etanolo al 100%, 80% etanolo, etanolo al 70% e 60% di etanolo. Diluire l'etanolo con acqua RNAsi-libera.<ol>
<li>Trasferire i vetrini per la vaschetta di Coplin vetro sterile con etanolo al 100% e metterli a bagno per 10 min. Dopo 10 min, svuotare la vaschetta di Coplin vetro e sostituire con etanolo al 100% nuove. Immergere i vetrini ancora per 10 min.</li>
		<li>Trasferire i vetrini per la vaschetta di Coplin vetro sterile con etanolo di 80% per 1 min.</li>
		<li>Trasferire i vetrini per la vaschetta di Coplin vetro sterile con etanolo al 70% per 1 min.</li>
		<li>Trasferire i vetrini per la vaschetta di Coplin vetro sterile con etanolo al 60% per 1 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. pretrattamento di diapositive per la preparazione della sonda del RNA ibridazione
<ol><li>Eseguire i seguenti lavaggi a temperatura ambiente, se non specificato diversamente. Eseguire lavaggi a temperatura ambiente su agitatore orbitale a bassa velocità. Utilizzare buste sterili diapositiva con spazio per fino a cinque scivoli per il lavaggio dei vetrini.</li>
	<li>Trasferire i vetrini per un mailer di diapositiva sterile con 18 mL di 1x tamponato fosfato salino (PBS). Lavare per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Versare il PBS 1X e immediatamente trattare il tessuto sulle diapositive con proteinasi K per consentire la penetrazione della sonda del tessuto. Aggiungere circa 18 mL di soluzione di proteinasi K per il mailer di diapositiva (Vedi tabella 1 per la concentrazione della soluzione di lavoro). Incubare a 37 ° C per 15 min. Non ti agitare.<ol>
<li>Mentre le diapositive sono incubando, preparare il prehybridization buffer (Buffer di Prehybe). Posizionare il Buffer di Prehybe in un bagno di acqua bollente per 10 minuti, poi raffreddare su un bagno di ghiaccio per 5 min. Per una ricetta di Prehybe Buffer, vedere tabella 1.</li>
		<li>Interrompere la digestione della reazione proteinasi K versando la soluzione di proteinasi K e immediatamente aggiungere 18 mL di soluzione di glicina-PBS 0,2% per il mailer di diapositiva. Lasciate che il mailer di diapositiva riposare a temperatura ambiente per 5 min.</li>
		<li>Versare la soluzione di glicina-PBS 0,2% e aggiungere 18 mL di soluzione di citrato di sodio Salina (SSC) 2 x mailer ogni diapositiva. Lavare i vetrini in 2 x SSC per 10 min a temperatura ambiente con agitazione a 100-150 giri/min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. prehybridization di diapositive in preparazione per l'ibridazione della sonda del RNA
<ol><li>Mentre le diapositive sono essere lavate con 2 x SSC, ottenere un nuovo mailer diapositiva sterile e messo circa 18 mL di Buffer di Prehybe nel mailer di diapositiva. Inserire il mailer di diapositiva in forno a temperatura di ibridazione ibridazione. Nota: La temperatura di ibridazione dipenderà la sonda utilizzata ma solitamente varia da 50-60 ° C.</li>
	<li>Una volta completato il lavaggio x SSC 2, versare il 2 x SSC e posto le diapositive all'interno il mailer di diapositiva nel Buffer di Prehybe al forno di ibridazione per 1 h.</li>
</ol>4. l'ibridazione della sonda RNA
<ol><li>Mentre le diapositive sono incubando con il Buffer di Prehybe al forno di ibridazione, preparare la soluzione di ibridazione-sonda.<ol>
<li>Diluire ogni sonda in tampone di ibridazione (0,5 µ l di sonda con 24,5 µ l di tampone di ibridazione). Nota: La ricetta per il tampone di ibridazione si trova nella tabella 1. Un esempio di preparazione della sonda e concentrazioni può essere trovato in Traylor-Knowles et al. 11.</li>
		<li>Posizionare la sonda diluita su un blocco di calore 86-90 ° C per 12 min, poi raffreddare per 1 min sul ghiaccio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimuovere il mailer di diapositiva dal forno ibridazione e individualmente Togliere i vetrini dal mailer di diapositiva utilizzando pinzette sterili. Posare le diapositive su un asciugamano di carta e pulire con cura tampone in eccesso Prehybe intorno i campioni di tessuto. Fare attenzione a non toccare i campioni e lavorare rapidamente per evitare l'essiccazione dei campioni di tessuto.</li>
	<li>Circondano il tessuto con una penna PAP. 25 µ l di soluzione della sonda diluita con una pipetta e riguardano il campione con un vetrino coprioggetto di plastica.<ol>
<li>Porre i campioni nella diapositiva umidità camera con 4x SSC + 50% formammide soluzione nella parte inferiore della camera.</li>
		<li>Una volta che le sonde sono state aggiunte a tutte le diapositive, è possibile posizionare la camera di umidità diapositiva nel forno ibridazione per almeno 24 ore ad una temperatura di ibridazione di 50-60 ° C. Il tempo di incubazione può variare a seconda della concentrazione della sonda ma dovrebbe essere per un minimo di 24 ore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo l'incubazione overnight con le sonde diluite, è necessario rimuovere la camera di umidità diapositiva dal forno ibridazione.<ol>
<li>Rimuovere le lamelle da ciascuna delle diapositive, facendo attenzione a non spostare il tessuto. In una pipetta 1000 µ l, 1000 µ l di soluzione di x SSC 2 e lavare delicatamente il vetrino.</li>
		<li>Porre il vetrino in un mailer di diapositiva sterile con 18 mL di soluzione di x SSC 2 per 5 min a temperatura ambiente. Versare la soluzione e sostituirlo con 18 mL di fresco 2 x SSC. Ripetere l'incubazione per 5 min a temperatura ambiente con agitazione delicata.</li>
		<li>Versare la soluzione di x SSC 2. Aggiungere 18 mL di 1 x SSC soluzione e lavare per 5 min a temperatura ambiente. Versare la soluzione di x SSC 1 e sostituirlo con 18 mL di fresco 1 x SSC. Ripetere l'incubazione per 5 min a temperatura ambiente con agitazione delicata.</li>
		<li>Versare il 1 x SSC. Aggiungere 18 mL di 0.5 x SSC e lavare per 10 min a 42 ° C senza agitazione. Riversare il 0,5 x SSC e Sostituisci con 18 mL di 0.5 fresco x SSC. Lavare nuovamente per 10 min a 42 ° C senza agitazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. visualizzazione della sonda RNA
Nota: Per visualizzare la sonda, viola BM verrà utilizzato durante il processo di sviluppo. Tuttavia, prima di questo passaggio, alcuni lavaggi sono necessari per preparare i campioni per la colorazione.
<ol><li>Lavare i vetrini con 18 mL di buffer di fosfatasi alcalina (AP-buffer) senza MgCl2 per 1 min. Pour il buffer di AP senza MgCl2e aggiungere 18 mL di tampone bloccante di Boehringer Mannheim 1x diluito con il tampone acido maleico. Incubare per almeno 1 h a temperatura ambiente in un mailer di diapositiva con agitazione delicata. Nota: Il tampone bloccante Boehringer Mannheim e acido maleico buffer utilizzato erano premade e acquistati nel lavaggio DIG e blocco Buffer Set (disponibile in commercio).<ol>
<li>In alternativa, può essere eseguita incubazione overnight a 4 ° C. Un periodo di blocco più diminuirà l'aspetto del legame non specifico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare i 20 mL di diluito frammenti Fab di DIG anti-digossigenina-AP (anticorpo anti-DIG = 2 µ l di anticorpo anti-DIG + 20 mL 1 x tampone bloccante Boehringer Mannheim). Questo è sufficiente per l'uso in 1 mailer di scivolo di plastica. Più di questa soluzione deve essere preparata se più di una slide mailer è utilizzabile.</li>
	<li>Aggiungere l'anticorpo anti-scavare un nuovo mailer diapositiva sterile e trasferire i vetrini per il mailer vetrino con la soluzione di anticorpo anti-DIG. Incubare a temperatura ambiente per 3 ore con agitazione delicata.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, versare l'anticorpo anti-DIG e lavare i vetrini in mailer diapositiva con 18 mL di Buffer di AP senza MgCl2 per 5 min con agitazione delicata.</li>
	<li>Versare il buffer di AP senza MgCl2 e aggiungere 18 mL di Buffer di AP. Lavare per 5 minuti con agitazione delicata. Dopo l'incubazione di 5 minuti, versare il AP-tampone, sostituirlo con 18 mL di fresco AP-Buffer e lavare per 5 minuti con agitazione delicata.</li>
	<li>Nel buio, versare il buffer di AP e aggiungere 18 mL di BM viola per il mailer di diapositiva. Incubare i vetrini a temperatura ambiente al buio, il controllo per lo sviluppo di colore viola che ogni ½ h. tempi di reazione per visualizzazione variano basato sulla sonda che è in fase di sviluppo. Nota: Invece di visualizzazione BM viola, soluzione di sviluppo può essere fatto utilizzando 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) e nitro blu di tetrazolio (NBT). Per istruzioni, vedere la tabella 1 .</li>
	<li>Interrompere lo sviluppo del colore trasferendo le diapositive a un mailer nuova diapositiva sterile con 18 mL di tampone Tris-EDTA (TE) per 5 min a temperatura ambiente al buio.</li>
	<li>Versare il tampone TE e aggiungere 18 mL di acqua RNAsi-libera la diapositiva mailer e lavaggio per 1 min, al buio.</li>
	<li>Rimuovere le diapositive dall'acqua e asciugarle intorno ai bordi del tessuto. Aggiungere glicerolo mezzo di montaggio e inserire i coprioggetti. Memorizzare le diapositive a 4 ° C fino a quando le immagini sono pronte per essere adottate.</li>
</ol>

<ol><li>Hughes, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Climate+Change%2C+Human+Impacts%2C+and+the+Resilience+of+Coral+Reefs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs.</a> Science. 301 (5635), 933(2003).</li>
<li>Chen, P. -Y., Chen, C. -C., Chu, L., McCarl, B. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959378014001782">Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs.</a> Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).</li>
<li>Hoegh-Guldberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coral+Reefs+Under+Rapid+Climate+Change+and+Ocean+Acidification%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coral Reefs Under Rapid Climate Change and Ocean Acidification.</a> Science. 318 (5857), 1742(2007).</li>
<li>Grasso, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+identifies+candidate+genes+for+key+roles+in+coral+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development.</a> BMC Genomics. 9 (1), 540(2008).</li>
<li>Miller, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+innate+immune+repertoire+in+Cnidaria+-+ancestral+complexity+and+stochastic+gene+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The innate immune repertoire in Cnidaria - ancestral complexity and stochastic gene loss.</a> Genome Biology. 8 (4), R59(2007).</li>
<li>Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox+genes+in+the+coral+Acropora+millepora%3A+divergent+expression+patterns+reflect+differences+in+developmental+mechanisms+within+the+Anthozoa%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Sox genes in the coral Acropora millepora: divergent expression patterns reflect differences in developmental mechanisms within the Anthozoa.</a> BMC Evolutionary Biology. 8 (1), 311(2008).</li>
<li>Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+and+expression+of+four+coral+G+protein-coupled+receptors+distinct+from+all+classifiable+members+of+the+rhodopsin+family%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family.</a> Gene. 392 (1-2), 14-21 (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22In+situ+hybridization+protocols%22">In situ hybridization protocols</a>. Darby, I. A., Hewitson, T. D. , Humuna Press. Towtowa, New Jersey. (2006).</li>
<li>Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aValentino%2C+KL+%22In+situ+hybridization%22">In situ hybridization</a>. , Oxford University Press. (1987).</li>
<li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).</li>
<li>Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+specificity+of+gene+expression+in+the+response+to+heat+stress+in+corals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals.</a> Journal of Experimental Biology. 220 (10), (2017).</li>
<li>Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+spatiotemporal+expression+of+RNAs+and+proteins+in+the+starlet+sea+anemone%2C+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis.</a> Nature Protocols. 8, 900(2013).</li>
<li>Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+multiple+Sox+genes+through+embryonic+development+in+the+ctenophore+Mnemiopsis+leidyi+is+spatially+restricted+to+zones+of+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation.</a> EvoDevo. 5 (1), 15(2014).</li>
<li>Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-specific+and+developmental+expression+of+Dmrt+genes+in+the+starlet+sea+anemone%2C+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis.</a> EvoDevo. 6 (1), (2015).</li>
<li>Barry, S. N., Crow, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+HoxA11+and+HoxA13+in+the+evolution+of+novel+fin+morphologies+in+a+representative+batoid+%28Leucoraja+erinacea%29%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea).</a> EvoDevo. 8 (1), 24(2017).</li>
<li>Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdivision+of+arthropod+cap-n-collar+expression+domains+is+restricted+to+Mandibulata%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata.</a> EvoDevo. 5 (1), 3(2014).</li>
<li>Piatigorsky, J., Kozmik, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cubozoan+jellyfish%3A+an+Evo%2FDevo+model+for+eyes+and+other+sensory+systems%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems.</a> The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il metodo descritto in questo protocollo è stato modificato dal lavoro precedente in ricerca inerente allo sviluppo evolutivo medico8,9,10,12,17. Questo protocollo si concentra sulle sfumature di un'ibridazione in situ con una sonda di scavare-contrassegnate RNA anti-senso sui coralli adulti, che sono stati conservati e inclusi in paraffina. Questo me...

Coralli sono costruttori di ecosistema critico e importante per la biodiversità nell'oceano e salute umana1,2,3. Sono minacciata a causa del cambiamento climatico e altri fattori di stress antropogenici, e molte specie di corallo sono considerate in pericolo critico. Così, c'è un forte bisogno di strumenti molecolari e cellulari per diagnosticare Coralli sotto stress. Inoltre, là poco è capito circa dove i geni sono espressi all'interno di tessuto adulto corallo e quindi poca comprensione delle funzioni di questi geni. Per risolvere questo problema, abbiamo adattato il in situ (ISH) protocollo di ibridazione, comunemente utilizzato in medicina umana e biologia evolutiva dello sviluppo, per l'uso su campioni di tessuto paraffina-incastonato di coralli adulti. Questa tecnica è più potente quando viene utilizzato su Coralli adulti che hanno subito un evento stressante come l'esposizione allo stress da calore. Tuttavia, questa tecnica può essere utilizzata su una vasta gamma di tessuti e fasi della vita di coralli e non è limitata al solo calore-sollecitato coralli4,6,7. Inoltre, questa tecnica può essere utilizzata su tessuti o cellule di qualsiasi metazoi finché sono disponibili informazioni di sequenza di cDNA.
Lo scopo di questo metodo è quello di visualizzare le sonde del RNA all'interno di tessuto adulto corallo che è stata conservata e inclusi in paraffina e sezionati sui vetrini. Questo metodo è un potente strumento di diagnostica che permette di visualizzare degli acidi nucleici all'interno di tessuto adulto corallo. Inizialmente questo metodo è stato sviluppato per la diagnostica medica, e da allora è diventato uno strumento popolare in campi come la biologia dello sviluppo e biologia inerente allo sviluppo evolutiva8,9,10. ISH è anche un metodo critico, specialmente in sistemi non-modello, quando genomica e trascrittomica dati di sequenza sono disponibili ma pattern di espressione genica spaziale sono sconosciuti. Per lavoro diagnostico in sistemi non-modello, questa tecnica è potente perché può indicare quali cellule e tessuti esprimono un gene di interesse e possono portare a ulteriori approcci terapeutici mirati8,9,10, 11,12. Infine, questa tecnica è più potente quando accoppiato con espressione genica quantitativa dei dati11e qualitativa.
L'approccio descritto in questo articolo sarà di interesse per i ricercatori che hanno già progettato un digossigenina (DIG)-scritta sonda RNA (sonde sia il senso e antisenso) e sono ora pronti per eseguire in situ di ibridazione delle sonde ad un campione. Per eseguire questo metodo, due sezioni di serie di un tessuto paraffina corallo saranno necessari per ogni sonda in fase di test. Una sezione sarà utilizzata per la sonda di senso e l'altra per la sonda antisenso. La sonda di senso sarà un controllo per indicare il legame non specifico. Se si osserva una colorazione della sonda di senso, quindi la sonda antisenso non è specifica per il RNA di interesse. Sonde possono essere progettati per qualsiasi gene espresso. In questo protocollo, alcuni esempi sono utilizzati che precedentemente sono stati trovati per essere espressi durante lo stress da calore in Coralli: omologo FBJ osteosarcoma murino oncogene virale B (Fos-B), proteina dell'attivatore (AP1) e fattore di necrosi tumorale recettore 41 (TNFR 41)11. ISH usando le sonde Scavare-contrassegnate RNA è preferito rispetto all'uso di sonde radioattive perché la loro gestione è molto più sicuro10. Inoltre, questa tecnica è altamente sensibile e può essere eseguita su una vasta gamma di tessuti ed embrioni oltre ha sottolineato calore adulto coralli13,14,15,16.

<table><tbody><tr><td>Soluzione di Denhardt</td><td>Affymetrix</td><td>70468 50 ML</td><td></td></tr><tr><td>Bioworld Tampone fosfatasi alcalina</td><td>Fisher</td><td>50-198-724</td><td></td></tr><tr><td>Buste per vetrini</td><td>Fisher</td><td>12-587-17B</td><td></td></tr><tr><td>Bioworld Tampone fosfatasi alcalina</td><td>Fisher</td><td>50-198-724</td><td></td></tr><tr><td>Provette Falcon da 50 mL</td><td>Fisher</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di DNA di sperma di salmone ultrapuro</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>PBS - Soluzione salina tamponata con fosfato (10X) pH 7,4</td><td>Invitrogen</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Acqua distillata ultrapura senza DNasi/RNasi, 10 x 500 mL</td><td>Invitrogen</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>Acqua distillata ultrapura senza DNasi/RNasi, 10 x 500 mL</td><td>Invitrogen</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di DNA spermatico di salmone ultrapuro</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino bianco apice adesivo superiore</td><td>Leica Biosystems</td><td>3800080</td><td></td></tr><tr><td>soluzione PBS, pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010072</td><td></td></tr><tr><td>proteinasi K, grado molecolare, 2 mL</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Super Pap Pen bloccante liquido</td><td>Promega</td><td>22309</td><td></td></tr><tr><td>DIG Anti-digossigenina-AP Fab fragments</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple, 100 mL</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>DIG Wash and Block Buffer Set</td><td>Roche</td><td>11585762001</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide soluzione, formato 500 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-500ML</td><td></td></tr><tr><td>SSC Buffer 20X</td> concentrazione <td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639-1L</td><td></td></tr><tr><td>Anidride acetica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320102-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47670-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Trietanolammina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90279-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Eparina sale sodico dalla mucosa intestinale suina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Xileni, AR (ACS), per uso</td> <td>istologicoVWR</td><td>MK866806</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>VWR</td><td>EM-EX0276-4S</td><td></td></tr><tr><td>TE tampone VWR</td><td></td><td></td> PAV6232 <td></td></tr><tr><td>forno di ibridazione</td><td>VWR</td><td>97005-252, 97005-254</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore orbitale</td><td>VWR</td><td>89032-088</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ tecniche di ibridazione per paraffina adulti coralli campioni

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

I coralli sono invertebrati oceano importanti che sono critici per la salute generale dell'oceano così come la salute umana. Tuttavia, a causa di impatti antropici come aumento delle temperature dell'oceano e l'acidificazione degli oceani, coralli sono sempre più minacciati. Per affrontare queste sfide, i progressi nella biologia cellulare e molecolare hanno dimostrato di essere fondamentale per la diagnosi della salute dei coralli. Modificare alcune delle tecniche comunemente utilizzate in medicina umana potrebbe migliorare notevolmente la capacità dei ricercatori di trattare e salvare i coralli. Per risolvere questo problema, un protocollo per l'ibridazione in situ utilizzato principalmente in medicina umana e biologia inerente allo sviluppo evolutiva è stato adattato per l'uso in adulti Coralli sotto stress.
Lo scopo di questo metodo è quello di visualizzare l'espressione spaziale di una sonda RNA in tessuto adulto corallo che è stato incastonato in paraffina e sezionato su vetrini. Questo metodo si concentra sulla rimozione della paraffina e reidratazione del campione, il pretrattamento del campione per garantire permeabilità del campione, pre-l'ibridazione incubazione, ibridazione della sonda RNA e la visualizzazione della sonda RNA. Si tratta di un metodo potente quando si utilizza organismi non-modello per scoprire dove sono espressi geni specifici, e il protocollo può essere facilmente adattato per altri organismi non-modello. Tuttavia, il metodo è limitato in quanto è soprattutto qualitativa, perché espressione intensità può variare a seconda della quantità di tempo utilizzata durante il punto di visualizzazione e la concentrazione della sonda. Inoltre, pazienza è necessaria, in quanto questo protocollo può richiedere fino a 5 giorni (e in molti casi, più a lungo) a seconda della sonda viene utilizzata. Infine, una colorazione di fondo non specifico è comune, ma questa limitazione può essere superata.

Dopo aver completato questo protocollo, si otterrà l'identificazione di cellule e tessuti che stanno esprimendo la sonda RNA di interesse. I risultati rappresentativi per questo protocollo sono per AP-1, FosB e TNFR41. Questi risultati, precedentemente pubblicati da Traylor-Knowles et al. 11, Visualizza espressione spaziale di RNA sonde sui coralli adulti che sono stati esposti allo stress da calore. Due esempi di diversi tipi di colorazione sono presentat...

L'obiettivo del presente protocollo è effettuare ibridazione in situ su adulti coralli campioni che sono stati inclusi in paraffina e sezionati su vetrini. Si tratta di un metodo qualitativo permette di visualizzare l'espressione spaziale di una sonda di RNA anti-senso in tessuti paraffina-incastonati.

In Situ Tecniche di ibridazione per paraffina adulti coralli campioni

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia delle cellule di corallo, ad esempio quali tipi di tessuti e cellule esprimono tipi specifici di geni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si hanno informazioni visive sull'espressione dell'RNA. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'espressione genica spaziale nei coralli adulti, può essere utilizzato anche in altre fasi della vita dei coralli, così come in altri sistemi di invertebrati.In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché ci sono così tanti passaggi e soluzioni di cui tenere traccia. Quindi devono prestare attenzione a dove si trovano nel protocollo e tenere traccia del tempo quando fanno i lavaggi. Kevin Rodriguez, un tecnico del mio laboratorio, dimostrerà questa procedura.Per iniziare, decerare i vetrini incorporati in paraffina a sezione sottile con xilene al 100% in barattoli di vetro Coplin per 10 minuti sotto il cofano. Quindi, riempi quattro barattoli di vetro sterili Coplin rispettivamente con etanolo al 100%, 80% etanolo, 70% etanolo e 60% etanolo. Per prima cosa, trasferisci i vetrini nel barattolo Coplin contenente etanolo al 1

in-situ-hybridization-techniques-for-paraffin-embedded-adult-coral

Research

Ricerca

JoVE Journal

Environment

Ambiente

Una combinazione di tecniche differenti per massimizzare la raccolta dati dal tessuto del mouse è presentato.

La combinazione di coloranti lipofili, In situ Ibridazione, Immunoistochimica e Istologia

Tutto il monte In Situ</emIbridazione> di E8.5 a E11.5 embrioni di topo

Ibridazione in situ per la localizzazione precisa delle Trascrizioni nelle piante

Grazie alla combinazione di metodi di montaggio RNA...

RNA<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; in embrioni Mount interi e istologia Adattato per Elasmobranchi Marine

Il pesce zebra, un piccolo pesce tropicale, è diventata un modello importante per studiare la funzione del gene durante lo sviluppo dei vertebrati e la malattia. L'espressione temporale e spaziale dei geni bersaglio può essere...

Alta Risoluzione intero monte<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in embrioni di zebrafish per studiare l&#39;espressione genica e la funzione

Una suite integrata di tecniche di imaging è stata applicata per determinare polipo morfologia e struttura del tessuto in coralli dei Caraibi Montastraea annularis e M. faveolata. Fluorescenza, blocco faccia seriale, e due fotoni laser microscopio confocale a scansione hanno identificato struttura lobate, pareti polipo, e chromatophore stimato e densità di zooxantelle e distribuzioni.

Multimodali ottici Metodi Microscopia Reveal Polyp Tissue morfologia e struttura in Caribbean Reef costruzione Coralli

Questo protocollo descrive un efficace approccio di ibridazione in situ per rilevare i livelli di espressione dell'mRNA e i modelli spaziali dei geni bersaglio nel fluido coelomico del nudus Sipunculus.

Ibridazione in situ per Sipunculus nudus Coelomic Fluid

Questo protocollo descrive come ottenere immagini combinando l'ibridazione in situ e l'immunoistochimica delle sezioni embrionali di zebrafish. L'ibridazione in situ è stata eseguita prima della criosezione, seguita dalla colorazione anticorpale. È utile rilevare i modelli di espressione di due geni nel pesce zebra se c'è una scarsità di anticorpi.

Sul posto Ibridazione combinata con immunoistochimica in embrioni di zebrafish criosezionati

Qui, descriviamo un protocollo per visualizzare le cellule proliferanti simili a staminali nella medusa Cladonema. L'ibridazione fluorescente in situ a montaggio intero con un marcatore di cellule staminali consente il rilevamento di cellule staminali e la marcatura con 5-etinil-2'-deossiuridina consente l'identificazione delle cellule proliferanti. Insieme, possono essere rilevate cellule staminali che proliferano attivamente.

Ibridazione fluorescente in situ e marcatura di 5-etinil-2'-deossiuridina per cellule staminali nella medusa idrozoica Cladonema pacificum

Questo articolo presenta due metodi basati sull'ibridazione fluorescenza in situ per determinare il contenuto cromosomico X delle cellule ovariche nel tessuto della corteccia ovarica non innestato e innestato da femmine con aberrazioni cromosomiche X.

Esplorazione delle aberrazioni cromosomiche X nelle cellule ovariche utilizzando l'ibridazione fluorescenza in situ

Qui, presentiamo l'estrazione e la preparazione di metaboliti polari e semi-polari da un olobionte di corallo, nonché tessuto ospite di corallo separato e frazioni cellulari di Symbiodiniaceae, per l'analisi gascromatografica-spettrometria di massa.

Gascromatografia-Metabolomica mirata basata sulla spettrometria di massa di campioni di corallo duro

Scopri l'ibridazione in situ su campioni di corallo adulto inclusi in paraffina per visualizzare l'espressione spaziale dell'RNA. Questo metodo qualitativo permette di studiare i pattern di espressione genica nei tessuti corallini.

In Situ Tecniche di ibridazione per paraffina adulti coralli campioni

Esplora altri video