Combinando l'analisi di DNA in un'estrazione di greggio virione con l'analisi del RNA dalle foglie infette per scoprire nuovi Virus genomi
27 luglio 2018
Qui vi presentiamo un nuovo approccio per identificare virus vegetali con genomi di DNA double-strand. Usiamo metodi standard per estrarre RNA e DNA da foglie infette e svolgere il sequenziamento di nuova generazione. Strumenti bioinformatici assemblare sequenze in contigs, identificano contigs che rappresenta il genoma del virus e assegnano genomi a gruppi tassonomici.
Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sulla virologia ambientale, come l'emergere di nuove malattie. Il principale vantaggio di questo metodo consiste nella purificazione di varianti libere da componenti cellulari e nell'utilizzo di tali varianti per estrarre il DNA da sottoporre a sequenziamento. Sono giunto a questo approccio per la prima volta quando abbiamo scoperto che le piante nei nostri serbatoi erano infettate da uno o più Badnavirus sconosciuti. Gli individui alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà per tre motivi. Primo, l'omogeneizzazione è una fase critica per garantire rese di qualità. Secondo, la centrifugazione differenziale può produrre diversi pellet ed è necessario saperli identificare e separare. Terzo, l'interpretazione dei risultati ottenuti con il bio-analizzatore può risultare difficoltosa.
Per tutti i passaggi di questa procedura, è necessario indossare una camice da laboratorio e guanti. Iniziare tagliando da 80 a 100 grammi di foglie da piante malate precedentemente congelate a meno 20 gradi Celsius. Quindi macinare le foglie in un frullatore Waring utilizzando 200 millilitri di buffer di macerazione e lo 0,5% di solfito di sodio. Trasferire l'omogeneato in un becher da un litro.
Indossando ancora l'apparecchiatura di protezione individuale appropriata, aggiungere 18 grammi di urea e 25 millilitri di detergente non ionico al 10% all'omogenato e coprire il becher con della pellicola. Mescolare con un agitatore magnetico per tutta la notte. Il giorno successivo, trasferire l'omogenato in bottiglie per rotore da centrifuga da 250 millilitri e centrifugare in un rotore ad angolo fisso a 4000 ×g a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Recuperare il soprannatante e filtrare attraverso quattro strati di garza. Misurare il volume del liquido omogenato recuperato, quindi dividere l'omogenato in provette da centrifuga in polipropilene da 38,5 millilitri. Centrifugare l'omogenato a 40.000 ×g a quattro gradi Celsius per 2,5 ore. Al termine della centrifugazione, verificare la presenza di un pellet verde sul fondo della provetta e di un pellet bianco lungo la parete della provetta. Versare con attenzione il soprannatante, mantenendo entrambi i pellet, e posizionare i campioni sul ghiaccio.
Separare il pellet bianco da quello verde è uno dei passaggi più complessi della procedura. Richiede pazienza e abilità.
Lavorando in una cappa chimica, utilizzare un raschietto di gomma per separare i pellet. Raschiare e trasferire i pellet in diverse bottiglie per rotore. Posizionare le bottiglie per rotore contenenti i pellet bianchi sul ghiaccio. Aggiungere un millilitro di acqua a ciascuna bottiglia ed eseguire pipettaggi su e giù. Ogni cinque minuti, nell'arco di una o due ore, pipettare la miscela su e giù per ri-sospendere il pellet. Dopo che i pellet bianchi sono stati ri-sospesi, conservare le sospensioni tutta la notte a quattro gradi Celsius.
Il giorno seguente, centrifugare la sospensione a 6000 ×g a quattro gradi Celsius per 10 minuti per rimuovere i residui rimanenti. Trasferire le sospensioni concentrate in nuove provette e centrifugare a 136.000 ×g a quattro gradi Celsius per due ore per ottenere il pellet di virioni. Rimuovere il sopranatante e risospendere il pellet in un millilitro di tampone.
Iniziare questa procedura rompendo i virioni. Aggiungere quaranta microlitri di una soluzione di proteinasi K da due microgrammi per microlitro alle sospensioni del pellet e incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Aggiungere un volume di fenolo cloroformio alcol isoamilico a ciascun campione e agitare manualmente per 20 secondi.
Centrifugare a temperatura ambiente a 16.000 ×g per cinque minuti. Rimuovere la fase acquosa superiore e trasferirla in un nuovo tubo. Ripetere questa estrazione due o più volte.
Concentrare il DNA utilizzando la precipitazione con etanolo. Utilizzare 0,3 moli di acetato di sodio a pH 5,2 e 2,5 volumi di etanolo al 95%. Collocare i campioni a meno 20 gradi Celsius per 30-60 minuti. Successivamente, centrifugare a 13.000 ×g per 10-20 minuti per ottenere il pellet di DNA.
Lavorando al banco del laboratorio, risospendere il pellet di DNA in un millilitro di tampone TE 0,1 millimolare. Filtrare la sospensione attraverso una colonna commerciale di filtrazione su gel mediante centrifugazione. Analizzare i campioni mediante elettroforesi su gel di agarosio al 1% utilizzando la colorazione con bromuro di etidio per osservare la qualità delle preparazioni e valutare la qualità del DNA come indicato nel testo.
Quando esaminati mediante microscopia elettronica a trasmissione, particelle virali erano presenti nel pellet bianco ottenuto dalla frazionamento grezzo di foglie di canna infette. L'elettroforesi su gel di agarosio del DNA estratto dai pellet verde e bianco ha identificato due bande di DNA ad alto peso molecolare nella frazione bianca, indicate dai punti rossi e gialli.
L'integrità dell'RNA isolato da foglie infette è stata inoltre verificata mediante elettroforesi su gel di agarosio. Questo grafico mostra l'abbondanza e la distribuzione tassonomica dei contig assemblati a partire dalla preparazione grezza del virus. E questo grafico rappresenta le proporzioni dei contig virali associati alla famiglia Caulimoviridae, al genere Badnavirus e ai contig associati a tre specie strettamente correlate.
Questi due grafici mostrano l'abbondanza di contig derivati dal sequenziamento dell'RNA in base alla loro distribuzione tassonomica. Il grafico a destra rappresenta l'abbondanza di contig all'interno della popolazione di contig virali associati alla famiglia Caulimoviridae, genere Badnavirus e tre specie strettamente correlate. Il confronto tra i contig della lunghezza del genoma virale ottenuti mediante sequenziamento del DNA e dell'RNA, utilizzati come supporto reciproco, conferma la presenza di due genomi virali completi.
Infine, l'analisi di RT-PCR utilizzando RNA isolato da foglie infette da virus ha rilevato entrambi i genomi virali.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può richiedere due giorni, mentre un principiante potrebbe impiegarne tre. Durante il primo utilizzo di questa procedura, è importante tenere traccia del volume dell'omogenato in ciascuno dei supernatanti, in modo da poter confrontare alla fine della procedura il rendimento finale di DNA con il materiale iniziale di partenza.
Dopo la sua scoperta, questo metodo ha aperto la strada nel campo della virologia vegetale, consentendo ai ricercatori di identificare nuovi virus a DNA nell'ambiente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come omogeneizzare il materiale vegetale, concentrare le varianti e ottenere un buon rendimento di DNA utilizzabile per il sequenziamento di nuova generazione. Non dimenticare che lavorare con urea e fenolo cloroformio è estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni come indossare occhiali protettivi, guanti, camice da laboratorio e mascherina quando si maneggiano questi composti chimici. Per una ultracentrifugazione sicura, è fondamentale bilanciare correttamente i tubi; pertanto, è necessario pesarli e posizionarli in posizione opposta nel rotore, assicurandosi che il loro peso differisca al massimo di 0,01 g l'uno dall'altro.
Panoramica
Questo articolo presenta un nuovo metodo per l'identificazione di virus vegetali con genomi a DNA a doppio filamento, mediante estrazione di DNA e RNA da foglie infette e sequenziamento di nuova generazione. L'approccio sottolinea la purificazione di varianti virali da componenti cellulari, consentendo un sequenziamento accurato e una classificazione tassonomica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Virologia vegetale
- Virologia ambientale
- Sequenziamento genomico
Sfondo
- L'identificazione dei virus vegetali è fondamentale per comprendere le malattie emergenti.
- I metodi precedenti presentavano difficoltà nella separazione dei componenti virali dal materiale vegetale.
- Questo studio introduce una tecnica migliorata per aumentare il rendimento e la qualità del DNA virale.
- Comprendere la distribuzione tassonomica dei virus può essere utile per studi ecologici.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per l'isolamento e il sequenziamento dei virus vegetali.
- Migliorare la comprensione della diversità e distribuzione virale nell'ambiente.
- Facilitare l'identificazione di nuovi virus a DNA che colpiscono le piante.
Metodi Utilizzati
- Omosessazione delle foglie infette delle piante seguita da centrifugazione differenziale.
- Separazione dei pellet virali e purificazione mediante estrazione con fenolo-cloroformio.
- Concentrazione del DNA attraverso precipitazione con etanolo.
- Analisi della qualità del DNA mediante elettroforesi su gel di agarosio e microscopia elettronica a trasmissione.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di DNA ad alto peso molecolare da foglie infette da virus.
- Identificazione di due genomi virali completi mediante sequenziamento.
- Grafici che illustrano la distribuzione tassonomica dei contig assemblati.
- La RT-PCR ha confermato la presenza dei genomi virali identificati.
Conclusioni
- Questo metodo migliora in modo significativo la capacità di identificare nuovi virus vegetali.
- Fornisce un quadro di riferimento per future ricerche in virologia ambientale.
- La padronanza di questa tecnica può semplificare il processo di identificazione dei virus.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente ai team di ricerca e sviluppo biofarmaceutici di identificare nuovi genomi di virus vegetali integrando il sequenziamento del DNA e dell'RNA ottenuti da estratti grezzi di virioni, supportando la validazione precoce del bersaglio nella scoperta di antivirali. Recuperando sequenze indicative di una replicazione virale attiva, fornisce un'elevata affidabilità predittiva per le campagne successive di de-risking meccanicistico e di identificazione dei composti promettenti. L'approccio affronta un punto critico nella scoperta: distinguere i virus in replicazione dagli elementi retrovirali endogeni, migliorando così la selezione del portafoglio per bersagli terapeutici o diagnostici di origine vegetale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche confermando un'infezione virale attiva mediante l'assemblaggio concorde dei genomi DNA e RNA.
- Valore operativo: Riduce i falsi positivi derivanti da elementi virali integrati, aumentando la certezza del bersaglio durante lo screening iniziale.
- Valore predittivo: Favorisce l'affidabilità predittiva distinguendo i virus in replicazione dal rumore trascrizionale.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Produce acidi nucleici virali purificati adatti per qPCR, sequenziamento o sviluppo di saggi basati sull'ibridazione.
- Riproducibilità: Fasi standardizzate di separazione del pellet e concentrazione del DNA consentono un materiale in ingresso costante per campagne di screening.
- Scalabilità: Utilizza attrezzature di laboratorio comuni (frullatore, centrifuga, fenolo-cloroformio), facilitando l'adattamento attraverso diversi sistemi modello.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le Malattie: Recupera i genomi di badnavirus attivamente infettivi, supportando l'allineamento di biomarcatori traslazionali nei modelli di malattia vegetale.
- Continuità Preclinica: Permette il passaggio dalla scoperta alla validazione preclinica fornendo genomi virali autentici per studi di infezione sperimentale.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Conferma la presenza virale mediante RT-PCR, supportando decisioni di avanzamento o interruzione nell'ottimizzazione di composti antivirali promettenti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso iniziale della scoperta, collegando la verifica delle ipotesi in virologia ambientale all'identificazione di candidati promettenti mediante il recupero validato del genoma virale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi isolando virioni da matrici vegetali complesse e confermando lo stato di infezione mediante analisi doppia degli acidi nucleici.
- Screening: Fornisce estratti di DNA e RNA standardizzati e con ridotta contaminazione, consentendo prestazioni affidabili nei saggi successivi.
- Analisi: Produce risultati quantificabili (lunghezza dei contig, distribuzione tassonomica, positività alla RT-PCR) per l'analisi comparativa tra condizioni diverse.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta al lavoro preclinico fornendo genomi virali autentici per la validazione funzionale in sistemi rilevanti per la malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile per la prospezione virale su diversi ospiti vegetali e campioni ambientali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduzione del rischio meccanicistico attraverso la conferma della presenza di genomi virali replicanti, riducendo l'ambiguità nella validazione della proteina bersaglio.
- Valore operativo: Standardizzazione mediante passaggi definiti di centrifugazione, estrazione con fenolo-cloroformio e precipitazione con etanolo.
- Valore strategico: Permette decisioni più informate su prosegui/non prosegui distinguendo patogeni attivi da fossili genomici, riducendo il rischio biologico in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione degli antivirali in base al rischio, basata sulla presenza confermata del virus e sull'integrità del genoma.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella purificazione dei virioni, nella separazione dei pellet e nella manipolazione degli acidi nucleici.
- Richiede l'accesso a ultracentrifughi, fenolo-cloroformio e strumenti bioanalizzatori.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i protocolli di omogeneizzazione e centrifugazione.
- L'adattamento a diversi sistemi modello può richiedere l'ottimizzazione della composizione dei tamponi e delle velocità di centrifugazione.
- I limiti pratici includono la manipolazione di sostanze chimiche pericolose (urea, fenolo-cloroformio) e la difficoltà tecnica nella separazione dei pellet bianchi e verdi.
