Name: Combinando lanalisi di DNA in unestrazione di greggio virione con lanalisi del RNA dalle foglie infette per scoprire nuovi Virus genomi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Scopri un metodo per isolare e sequenziare virus vegetali a DNA mediante omogeneizzazione di foglie infette, centrifugazione differenziale ed estrazione con fenolo-cloroformio. Questa tecnica consente di identificare nuovi genomi virali appartenenti alla famiglia Caulimoviridae.

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Ricerca è stata finanziata dal centro dell'Oklahoma per l'avanzamento della scienza e tecnologia applicata ricerca programma fase II AR 132-053-2; e dal dipartimento di Oklahoma di colture speciali agricoltura ricerca programma di sovvenzione. Si ringrazia il Dr. HongJin Hwang e la struttura di nucleo di bioinformatica OSU che è stata sostenuta da sovvenzioni da NSF (EOS-0132534) e NIH (2P20RR016478-04, 1P20RR16478-02 e 5P20RR15564-03).

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Negli ultimi anni una varietà di metodi sono stati impiegati per studiare la biodiversità di virus vegetali in ambienti naturali che comprendono arricchimento per particelle simili al virus (VLP) o virus specifici RNA o DNA2,3,44, 45,46 . Questi metodi sono seguiti da analisi NGS e bioinformatica. L'obiettivo di questo studio era quello di trovare l'agente causale di una malattia comune in una pianta coltivata. La malattia è stata segnalata per essere il risultato di un virus sconosciuto che ha senza involucro bacilliform particelle, e per cui solo un frammento di bp 565 è stato clonato47. Questa informazione è stata sufficiente per precedenti ricercatori ipoteticamente assegnare il virus al genere Badnavirus all'interno della famiglia Caulimoviridae. Mentre i rapporti anteriori supposto che canna mottle malattia in Gigli di canna era il risultato di un singolo badnavirus, utilizzando l'approccio di metagenomica delineato in questo studio, abbiamo determinato che la malattia è stata causata da due badnavirus provvisorio specie24. Così, la forza di un approccio metagenoma per scoprire l'agente causale di una malattia è che ora possiamo identificare situazioni dove ci possono essere più di una causa.
Il nostro approccio combinando dati di sequenziamento del DNA e RNA è approfondita e dimostra anche che i risultati utilizzando due approcci ha prodotto risultati coerenti e ha confermato la presenza di due virus correlati. Abbiamo impiegato una procedura modificata per isolamento di caulimoviruses e prodotto un campione che è stato arricchito per gli acidi nucleici di virus associato e che sono stati protetti all'interno del capside del virus. Un laboratorio di servizio è stato incaricato di effettuare il sequenziamento del DNA. Il concetto essenziale per il sequenziamento de novo è che quel DNA polimerasi incorpora il fluorescente etichettato nucleotidi in un filamento di DNA modello durante cicli sequenziali della sintesi del DNA. Il contigs assemblati seguita da NGS sono state presentate in un workflow di bioinformatic producendo contigs pochi che sono stati identificati come virus contigs. Ulteriore conferma di virus due genomi10,24,48,49,50 è stata ottenuta tramite analisi bioinformatica del RNA-seq dati ottenuti dalle preparazioni di RNA ribo-vuotati. Un risultato interessante era di imparare che le popolazioni delle sequenze recupero mediante sequenziamento del DNA e RNA fornito distribuzioni simili degli acidi nucleici virali e non virali. Per il sequenziamento del DNA e RNA, < 0,5% delle sequenze erano di origine del virus. All'interno della popolazione del virus sequenze 78-82% apparteneva alla famiglia Caulimoviridae. Confrontando i contigs virus assemblato dal sequenziamento del DNA e RNA, abbiamo confermato che i due genomi assemblati si è verificato in entrambi i set di dati.
Una preoccupazione di usare solo sequenziamento del DNA per identificare i nuovi genomi di virus è che il genoma di badnavirus è un DNA circolare aperto. Abbiamo ipotizzato che sequenze sovrapposte discontinuità nel genoma potrebbero presentare ostacoli per l'assemblaggio del genoma da contigs. L'esame iniziale dei risultati del sequenziamento del DNA ha rivelato due genomi di virus simili. Abbiamo supposto che questi genomi sia rappresentavano la diversità genetica di una specie che non è stata studiata, o rappresentate due specie co-infettare lo stesso impianto di24. Di conseguenza, l'analisi bioinformatica collettiva dei set di dati ottenuti da NGS DNA e RNA 16s, attivata la conferma della presenza di due genomi di integrale.
C'è un altro rapporto che si è sviluppato un metodo alternativo per l'estrazione VLP e acidi nucleici da omogenati di pianta per gli studi di metagenomica, basati su procedure per recuperare il DNA dal virus del mosaico del cavolfiore (CaMV; un caulimovirus)3. Questo approccio identificato romanzo RNA e virus a DNA sequenze nelle piante non coltivate. I passaggi derivati dalla procedura di isolamento caulimovirus utilizzata in questo studio per individuare l'agente causale di una malattia delle piante coltivate sono a differenza i passaggi derivati per l'estrazione VLP da piante naturalmente infettati24. Il successo di entrambi i metodi modificati suggerisce che la procedura di quadro per l'isolamento di caulimovirus può essere un prezioso punto di partenza per studi metagenomica di virus vegetali in generale.

Malattie delle piante emergenti guidare i ricercatori a sviluppare nuovi strumenti per l'individuazione degli agenti causali corretti. I primi rapporti di malattie da virus nuovi o ricorrenti si basano su sintomi che si verificano comunemente come mosaico e malformazioni della foglia, vena di compensazione, nanismo, avvizzimento, lesioni, necrosi, o altri sintomi. Lo standard per la segnalazione di un nuovo virus come agente causale di una malattia è per separarla da altri agenti patogeni contaminanti, si propagano in host adatto e riprodurre la malattia inoculando nelle piante sane della specie ospite originale. La limitazione in questo approccio è che molti generi di virus vegetali dipendono da un insetto o altri vettori per la trasmissione a un host adatto o tornare alla originale specie ospiti. In questo caso, la ricerca per il vettore appropriato può essere prolungata, ci possono essere difficoltà a fondare colonie di laboratorio del vettore e ulteriori sforzi sono necessari per elaborare un protocollo per la trasmissione sperimentale. Se le condizioni per gli studi di trasmissione di successo di laboratorio non è possibile, quindi il lavoro cade a corto lo standard per la segnalazione di una nuova malattia di virus. Per virus che si verificano nei loro ospiti naturali a titoli molto bassi, i ricercatori devono identificare host alternativo per la propagazione per mantenere scorte sufficienti infettive per svolgere ricerche. Per specie di virus che infettano soltanto poche piante questo può anche essere un ostacolo per la coltivazione di colture di riserva1.
Negli ultimi anni, gli scienziati stanno impiegando più spesso alto-rendimento NGS e metagenomica approcci per scoprire le sequenze di virus che sono presenti nell'ambiente, che può esistere non correlata ad una malattia nota, ma può essere assegnato a generi e specie tassonomica 2 , 3 , 4. tali approcci alla scoperta e alla categorizzazione dei materiali genetici in un ambiente distinto forniscono un modo per descrivere la diversità di virus in natura o la loro presenza in un certo ecosistema ma non necessariamente confermare un quadro per la definizione agenti causali per una malattia apparente.
Il genere Badnavirus appartiene alla famiglia Caulimoviridae dei virus. Questi virus sono bacilliform in forma con genomi di DNA circolare a doppio filamento di circa 7-9 kb. Tutti i virus si replicano attraverso un intermedio del RNA. Virus esistono come episomi e replicare indipendente della pianta cromosomica del DNA5,6. Gli studi di campo delle popolazioni di virus indicano che queste popolazioni di virus sono geneticamente complesse. Inoltre, le informazioni ottenute attraverso una gamma dei genomi delle piante di sequenziamento ad alta hanno scoperto numerosi esempi di frammenti di genoma badnavirus inserite da eventi illegittimo integration in genomi delle piante. Queste sequenze di badnavirus endogeno non sono necessariamente associate a infezione7,8,9,10,11. Successivamente, l'uso di NGS per identificare nuove badnaviruses come l'agente causale della malattia è complicata dalla diversità della sottopopolazione di genomi episomal così come la presenza di sequenze endogeno12,13.
Mentre non c'è non una pipeline ottima per la scoperta dei genomi di romanzo pararetrovirus, ci sono due approcci comuni per identificare questi virus come agenti causali per la malattia. Un metodo consiste nell'arricchire per piccole sequenze di RNA da foglie infette e poi assemblare queste sequenze per ricostituire il virus genome(s)14,15,16,17. Un altro approccio è l'amplificazione di rotolamento cerchio (RCA) per amplificare i virus a DNA circolare genomi18. Il successo di RCA dipende l'età della foglia e il titolo del virus nel tessuto selezionato. I prodotti RCA sono sottoposti a digestione di limitazione e clonati in plasmidi per direct sequencing19,20,21.
Virus giallo mottle canna (CaYMV) è una badnavirus ed è descritto come la causa eziologica della malattia mottle giallo in canna, anche se solo un frammento di bp 565 del genoma è stato precedentemente isolato da infetto cannas22. Uno studio contemporaneo identificato CaYMV in Alpinia purpurata (fioritura zenzero; CaYMV-Ap)23. L'obiettivo di questo studio era di recuperare sequenze di genoma completo badnavirus da gigli canna infetti. Descriviamo un protocollo per purificare i virus da contaminanti di pianta e quindi isolare il DNA virale da questa preparazione e preparare una libreria di DNA per l'uso in NGS. Questo approccio elimina la necessità di passaggi intermedi di amplificazione molecolare. Isoliamo anche mRNA da piante infette per RNA-seq. NGS, che comprende RNA-seq è stata effettuata utilizzando ogni preparazione di acidi nucleici. Contigs assemblati sono stati trovati a relazionarsi con il taxon Badnavirus in entrambi i set di dati utilizzando il centro nazionale per la biotecnologia e Information (NCBI) strumento di ricerca di base di allineamento locale per gli acidi nucleici (BLASTn). Abbiamo identificato i genomi di due badnavirus specie24.

<table><tbody><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich St. Louis MO</td><td>S5976 Tampone</td><td>di macinazione per la purificazione dei virus</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S0751</td><td>Tampone di macinazione per la purificazione dei virus</td></tr><tr><td>Na2SO3</td><td>Thermo-Fisher Waltham, MA</td><td>28790</td><td>Tampone di macinazione per la purificazione dei virus</td></tr><tr><td>urea</td><td>Thermo-Fisher</td><td>PB169-212</td><td>Estrazione dell'omogeneizzato&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Estrazione dell'omogeneizzato</td> <td>X-100</td>&nbsp;</tr><tr><td>Garza</td><td>VWR Radnor, PA</td><td>21910-107</td><td>Filtro omogeneizzato&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP152-5</td><td>Pellet risospensione & tamponi di risospensione del DNA&nbsp;</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Spectrum, Gardena, CA</td><td>M1035</td><td>Tampone di risospensione in pellet</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Spectrum</td><td>E1045</td><td>Arresta le reazioni enzimatiche</td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Thermo-Fisher</td><td>25530</td><td>Tampone di risospensione del DNA</td></tr><tr><td>fenolo:cloroformio:isoamilalcol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2069</td><td>Dissolvere le proteine del virione</td></tr><tr><td>DNAsi I</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>Degradare il DNA cellulare da estratti</td></tr><tr><td>95% etanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6B-100</td><td>Precipitazione del DNA virale Miscelatore</td></tr><tr>da<td>laboratorio</td><td>VWR</td><td>58984-030</td><td>Macinare campioni di foglie</td></tr><tr><td>Ultracentrifuga modello da pavimento&nbsp; & Rotore Ti70</td><td>Beckman Coulter, Irving TX&nbsp;</td><td>A94471</td><td>Separazione di estratti cellulari</td></tr><tr><td>Centrifuga modello da pavimento e rotore JA-14</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>369001</td><td>Separazione di estratti cellulari Piastra di</td></tr><tr><td>agitazione magnetica</td><td>VWR</td><td>75876-022</td><td>Miscelazione dell'urea nei campioni durante la notte</td></tr><tr><td>Poliziotto di gomma</td><td>VWR</td><td>470104-462</td><td>Dissolvere il pellet virale</td></tr><tr><td> 2100 bioanalyzer Instrument</td><td>Agilent Genomics, Santa Clare, CA</td><td>G2939BA</td><td>Rilevamento sensibile della qualità e della quantità di DNA e RNA</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer RNA-Picochip</td><td></td><td>5067-1513</td><td>Chip microfluidico utilizzato per spostare, colorare e misurare la qualità dell'RNA in un bioanalizzatore 2100 2100 Bioanalizzatore</td></tr><tr><td></td><td>DNA chip ad alta sensibilità</td><td>5067-4626</td><td>Chip microfluidico utilizzato per spostare, colorare e misurare la qualità del DNA in un bioanalizzatore 2100</td></tr><tr><td>Spettrofotometro Nanodrop</td><td>Thermo-Fisher</td><td>ND-2000</td><td>Analisi della qualità del DNA/RNA nelle fasi intermedie delle procedure</td></tr><tr><td>Kit di isolamento dell'RNA totale delle piante</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>STRN50-1KT</td><td>Isolare l'RNA per l'RNA-seq</td></tr><tr><td>Acqua priva di RNasi&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10128-514</td><td>Risospensione di DNA e RNA per</td></tr><tr><td>colonna di spin del concentratore di RNA</td> NGS <td>Zymo Research, Irvine, CA</td><td>R1013</td><td>Preparare l'RNA per il kit di rimozione dell'RNA-seq</td></tr><tr><td>Illumina</td><td>, San Diego, CA</td><td>MRZPL116</td><td>Preparare l'RNA per l'RNA-seq</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td>Preparare l'RNA per l'RNA-seq</td></tr><tr><td>&nbsp; RNA&nbsp; sistema di arricchimento</td><td>Roche</td> 7277300001 <td>Preparare l'RNA per l'RNA-seq</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio&nbsp;</td><td>Thermo-Fisher</td><td>16500100</td><td>Analisi su gel della qualità del DNA/RNA nelle fasi intermedie delle procedure</td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15585011</td><td>Colorazione su gel di agarosio</td></tr><tr><td>pGEM-T +JM109 cellule competenti</td><td>Promega, Madison, WI</td><td>A3610</td><td>Clone genoma frammenti</td></tr><tr><td>pFU Taq polimerasi</td><td>Promega</td><td>M7741</td><td>PCR amplificare il genoma virale</td></tr><tr><td>dNTP Promega</td><td></td><td>U1511</td><td>La PCR amplifica il genoma del virus</td></tr><tr><td>PCR oligonucleotidi</td><td>IDT, Coralvill, IA</td><td>Ordine personalizzato</td><td>La PCR amplifica il genoma del virus</td></tr><tr><td>Kit di purificazione del DNA Miniprep Promega</td><td></td><td>A1330</td><td>Purificazione del DNA plasmidico prima del sequenziamento Kit di</td></tr><tr><td>pulizia PCR</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td>Preparare prodotti PCR per la clonazione</td></tr><tr><td>software pDRAW32</td><td>ACAClone</td><td></td><td>Analisi al computer di DNA circolari e motivi</td></tr><tr><td>Software MEGA6.0</td><td>MEGA</td><td></td><td>Analisi genetica evolutiva molecolare</td></tr><tr><td>Primer 3.0</td><td>Simgene.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT&trade; RiboGreen&commercio; Kit per il dosaggio dell'RNA</td><td>Thermo-Fisher</td><td>R11490</td><td>Determinazione fluorimetrica della quantità di RNA</td></tr><tr><td>GS Junior&trade; Sistema di pirosequenziamento</td><td>Roche</td><td>5526337001</td><td>Piattaforma di sequenziamento</td></tr><tr><td>GS Junior Titanium EmPCR Kit (Lib-A)</td><td>Roche</td><td>5996520001</td><td>Reagenti per PCR in emulsione</td></tr><tr><td>GS Jr Reagenti per il recupero delle perle EmPCR</td><td>Roche</td><td>5996490001</td><td>Reagenti per PCR</td></tr> <tr><td>in emulsioneReagenti GS Junior EmPCR (Lib-A)</td><td>Roche</td><td>5996538001</td><td>Reagenti per PCR in emulsione</td></tr><tr><td>GS Jr EmPCR Oil & Kit di rottura</td><td>Roche</td><td>5996511001</td><td>Reagenti per PCR in emulsione</td></tr><tr><td>GS Jr Kit di sequenziamento in titanio*</td><td>Roche</td><td>5996554001</td><td>Include reagenti di sequenziamento, enzimi, tamponi e perline di imballaggio</td></tr><tr><td>Kit di piastre Picotiter in titanio GS Jr.</td> Piastra di sequenziamento <td>Roche</td><td>5996619001</td><td>Piastra di sequenziamento con reagenti e guarnizioni associati Miscelatore</td></tr><tr><td></td><td>IKA Turrax</td><td>3646000</td><td>Miscelatore speciale utilizzato con Turrax Provette</td></tr><tr><td>IKA Turrax Tube (miscelatore specializzato)</td><td></td><td>20003213</td><td>Provette di miscelazione specializzate con rotore interno per la creazione di emulsioni</td></tr><tr><td>Kit nebulizzatori GS</td><td>Roche</td><td>5160570001</td><td>Separatore granulometrico di acidi nucleici da utilizzare durante le preparazioni della libreria</td></tr><tr><td>GS Junior emPCR Conta perline</td><td>Roche</td><td>05 996 635 001</td><td>Conta microsfere da libreria</td></tr><tr><td>GS Junior Dispositivo di deposizione di perline</td><td>Roche</td><td>05 996 473 001</td><td>Supporto per piastra Picotiter durante la centrifugazione</td></tr><tr><td>Contrappeso & Adattatore per i dispositivi di deposizione a microsfere</td><td>Roche</td><td>05 889 103 001</td><td>Utilizzato per bilanciare il dispositivo di deposizione con centrifugazione a piastre picotiter</td></tr><tr><td>GS Junior Software Roche</td><td></td><td>05 996 643 001</td><td>Suite software per il controllo dello strumento, la raccolta e l'analisi dei dati</td></tr><tr><td>GS Junior Sequencer Control v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Incluso nell'articolo 05 996 643 001 sopra)</td></tr><tr><td>GS Run Processor v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Incluso nella voce 05 996 643 001 sopra)</td></tr><tr><td>GS De Novo Assembler v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Incluso nella voce 05 996 643 001 sopra)</td></tr><tr><td>GS Reference Mapper v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Incluso nella voce 05 996 643 001 sopra)</td></tr><tr><td>GS Amplicon Variant Analyzer v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Incluso nella voce 05 996 643 001 sopra)</td></tr></tbody></table>

combinando l'analisi di dna in un'estrazione di greggio virione con l'analisi del rna dalle foglie infette per scoprire nuovi virus genomi

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

Questo approccio metagenoma viene utilizzato per identificare virus vegetali con genomi di DNA circolari e le loro trascrizioni. Spesso virus a DNA vegetale che si verificano in titoli bassi nel loro ospite o non possono essere inoculati meccanicamente a un altro host sono difficili da propagare per conseguire un titolo maggiore di materiale infettivo. Foglie infette sono macinati in un buffer delicato con pH ottimale e composizione ionica consigliato per la maggior parte dei retrovirus di Para di bacilliform di purificazione. L'urea è utilizzata per rompere in sui corpi di inclusione che intrappolano i virions e dissolvere componenti cellulari. Centrifugazione differenziale fornisce ulteriore separazione dei virions da contaminanti di pianta. Quindi proteinasi K trattamento rimuove i capsidi. Quindi il DNA virale è concentrato ed utilizzato per il sequenziamento di nuova generazione (NGS). I dati NGS sono utilizzati per assemblare contigs che vengono sottoposti a NCBI-BLASTn per identificare un sottoinsieme delle sequenze di virus nel dataset generato. In una pipeline parallela, RNA è isolato dalle foglie infette tramite un metodo di estrazione RNA basato su colonna standard. Quindi lo svuotamento ribosoma avviene per arricchire per un sottoinsieme dei trascritti di mRNA e virus. Assemblati sequenze derivate da RNA (RNA-seq) di sequenziamento sono stati sottoposti al NCBI-BLASTn per identificare un sottoinsieme di sequenze di virus in questo set di dati. Nel nostro studio, abbiamo identificato due genomi correlati badnavirus full-length in due DataSet. Questo metodo è preferibile a un altro approccio comune che estrae la popolazione totale di piccole sequenze di RNA per ricostituire la pianta virus sequenze genomic. Questo virus di quest'ultimo metagenomica pipeline recupera relative sequenze che sono retrò-trascrivere gli elementi inseriti nel genoma della pianta. Questo è accoppiato all'analisi biochimiche e molecolare di discernere ulteriormente gli agenti infettivi attivamente. L'approccio documentato in questo studio, recupera sequenze rappresentative di replicare il virus che probabilmente indicare infezione attiva del virus.

Questo metodo di purificazione del virus modificato fornito un arricchimento del virus DNAs utile per l'identificazione di due specie di virus da NGS e bioinformatica. Dopo l'omogeneizzato è stato centrifugato a 40.000 x g per 2,5 h, c'era una pallina verde nella parte inferiore del tubo e una pallina bianca lungo la lunghezza. La pastiglia verde è stato risospeso in un tubo del microcentrifuge e il pellet bianco è stato risospeso in due provette per microcentrifuga. PCR è stata effettuata utilizzando standard CaYMV diagnostica gli iniettori di PCR, e i prodotti sono stati rilevati in pellet bianco solubilizzate e non la pastiglia verde (Figura 1A). Un campione di preparazione grezza è stato esaminato secondo microscopia elettronica di trasmissione e abbiamo osservato le particelle bacilliform misura 124-133 nm di lunghezza (Figura 1B). Questo è all'interno la lunghezza prevista modale della maggior parte dei badnaviruses. DNA è stata estratta dai pellet bianchi e verdi e risospesi separatamente. Figura 1C, abbiamo caricato 5 µ l di DNA estratto dal verde e pellet bianco campione (1,6 µ g di DNA per la frazione verde) e 3,1 µ g di DNA per la frazione di bianco da 0,8% agarosio elettroforesi su gel e analizzato il DNA seguendo il bromuro di etidio la macchiatura. La frazione verde contenuto basso peso molecolare del DNA, mentre la frazione bianca prodotto due bande di più alto peso molecolare del DNA, così come il più basso peso molecolare del DNA (Figura 1C). Il gel ha presentato nella Figura 1C è stato eseguito per 40 min a 100 V e lo striscio in vicolo 3 suggerisce che la tensione di gel dovrebbe essere abbassata per produrre bande più chiare. Questi dati suggeriscono che la pallina bianca è stata arricchita per i virions. La concentrazione di DNA (0,6 µ g/mL) estratta dal campione bianco era basso, ma adeguata per NGS, che richiede un minimo di 10 ng di DNA per procedere. DNAs frammentati sono stati utilizzati per preparare una libreria per NGS.
In parallelo, il RNA è stato estratto dalle piante infette canna (Figura 1D) per high throughput RNA-seq. Un flusso di lavoro standard è stato effettuato per la preparazione di biblioteca, NGS, creando contigs e identificare sequenze di genoma virale (Figura 1E). Sono stati confrontati i risultati di uscita da usando il DNA e RNA come materiali di partenza.
Abbiamo ottenuto 188.626 crudo DNA letture da NGS usando il DNA isolato dalla preparazione di virus grezza. Letture sono state assemblate in 13.269 contigs e BLASTn è stato utilizzato per la ricerca il dataset NCBI delle sequenze nucleotidiche (utilizzando Viridplantae TaxID: 33090 e Virus TaxID: 10239 come gli organismi limitanti) (Figura 1E). I risultati di NCBI-BLASTn ha rivelato che erano 93% del de novo assemblati contigs sequenze cellulari, 22% erano sconosciuti, e 0,3% erano virus contigs (Figura 2A). La maggior parte dei contigs categorizzato come sequenze di cellulari sono stati identificati come mitocondriale o cloroplasto DNA. All'interno del dataset del virus contigs, 32% di contigs i virus sono stati collegati ai membri del Caulimoviridae (che non erano Badnavirus sequenze) e 58% di questi sono stati collegati con Badnavirus. Di contigs il virus, 29% erano molto simili (e < 1 x 10-30) al CaYMV isolare V17 ORF3 gene (EF189148.1), virus del bacilliform di canna da zucchero isolare Batavia D, completa del genoma (FJ439817.1), e Banana streak CA virus completo (genoma KJ013511). All'interno di questa popolazione, c'erano contigs lungo che ha assomigliato a due genomi di integrale.
Alto-rendimento RNA-seq prodotta 153.488 pulite singole sequenze letture con una media lunghezza di < 500 b.p. Contig Assemblea di leggere questo ridotto a 8.243 contigs. Questi sono stati sottoposti a NCBI-BLASTn (utilizzando Viridplantae TaxID: 33090 e Virus TaxID: 10239 come gli organismi limitanti) e le uscite collocate il 76% del contigs in una categoria di sequenze cellulari di impianto, 23% erano sconosciute, e 0,1% sono stati categorizzati come virus contigs ( Figura 2 B). esame più attento della popolazione della popolazione 0,1% di virus contigs determinato che il 68% di questi sono stati assegnati a Caulimoviridae (Figura 2B). Tre grandi contigs all'interno di questa popolazione sono stati identificati con alta somiglianza (e < 1 X 10-30) al CaYMV isolare V17 ORF3 gene (EF189148.1), virus del bacilliform di canna da zucchero isolare Batavia D, completa del genoma (FJ439817.1) e Banana streak Virus di CA completa del genoma (KJ013511). Esaminando i tre contigs, unimmo manualmente due di questi per produrre un genoma di virus full-length.
Abbiamo confrontato il virus genoma lunghezza contigs prodotta mediante sequenziamento del DNA e RNA come impalcatura reciproca per confermare la presenza di due genomi di virus full-length. Un genoma del virus full-length di 6.966 bp è stato provvisoriamente chiamato virus giallo mottle associato Canna 1 (CaYMAV-1) (Figura 3A). Il secondo genoma era 7.385 bp e una variante del CaYMV infettare Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01) (Figura 3A).
Infine, gli iniettori di PCR che sono stati progettati per clone ~ 1.000 bp frammento di ogni virus, sono stati utilizzati per rilevare differenzialmente entrambi genomi in una popolazione di 227 piante di canna che rappresenta nove varietà commerciali. In molti casi singoli impianti sono stati infettati con entrambi i virus. Forniamo un esempio di rilevazione di RT-PCR di CaYMAV-1 e CaYMV-Ap01 nelle 12 piante. Tre di questi erano positivi solo per CaYMV-Ap01 e nove erano positive per entrambi i virus (Figura 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig1.jpg"> Figura 1 : Preparazioni di acido nucleico del virus e NGS workflow. Agarosio (A) (1,0%) elettroforesi di frammenti PCR bp 565 di genomi di CaYMV. Due prodotti di PCR sono stati rilevati in campioni preparati dal pellet bianco (corsie 1, 2) ma non nel campione pastiglia verde (corsia 3). Controllo positivo (+) rappresenta un prodotto PCR amplificato dalla pianta infetta del DNA che è stato isolato utilizzando un metodo automatizzato che coinvolgono particelle standard cellulosa paramagnetico. Lane L contiene la scala di DNA utilizzata come standard per misurare le dimensioni delle bande di DNA lineare nelle corsie di campione. (B) esempio di particella virale visualizzata da microscopia elettronica di trasmissione nel pellet bianco recuperati da frazionamento grezzo di foglie di canna infetti. (C) agarosio (0,8%) gel elettroforesi di DNA recuperato dal verde (corsia 1) e pellet bianchi (lane 2) quello testato positivo mediante PCR in pannello A. I puntini rossi e gialli accanto a corsia 2 identificano due bande di DNA ad elevato peso molecolare che si verificano nella frazione di bianco. (D) agarosio (1%) elettroforesi del gel di RNA totale recuperato dalla purificazione di RNA basata su colonne. Lane L contiene la scala di DNA utilizzata come standard per misurare le dimensioni delle bande lineari nelle corsie di campione. Lane 1-6 contiene RNA isolato dalle foglie di canna infetti che sono stati riuniti per un singolo campione per ribo-svuotamento e pipeline schematica di RNA-seq. (E) di acido nucleico isolamenti, preparazione di biblioteca, sequenziamento, contig assieme e il genoma del virus scoperta. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig2.jpg"> Figura 2 : Grafici di krona visualizzando le categorie tassonomiche di contigs. (A) il grafico a sinistra mostra l'abbondanza e la distribuzione tassonomica di contigs assemblati dalla preparazione grezza virus. Il grafico a destro raffigura le proporzioni del virus contigs connesso con la famiglia Caulimoviridae , Badnavirus genere e tre specie strettamente imparentate. (B) il pannello a sinistra mostra l'abbondanza di contigs derivate da RNA-seq basato sulla loro distribuzione tassonomica. Sulla destra si trova il grafico raffigurante l'abbondanza di contigs all'interno della popolazione del virus contigs connesso con la famiglia Caulimoviridae , Badnavirus genere e tre specie strettamente imparentate. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig3.jpg"> Figura 3 . Caratterizzazione dei genomi di CaYMAV-1 e CaYMV-Ap01. (A) rappresentazione schematica di mottle Canna giallo associare virus 1 (CaYMAV) e virus giallo mottle Canna simile al genoma isolato da Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01). Posizioni del nucleotide 1-10 è identificato come l'inizio del genoma e contiene un tipico della maggior parte dei genomi di badnavirus sito anticodonemet tRNA. Le posizioni di stop e start per traduzione di open reading frame (ORF) 1 e 2 sono adiacenti. Queste proteine hanno sconosciuto funzioni. ORF3 è una poliproteina contenente dito di zinco (ZnF), proteasi (Pro), della trascrittasi inversa (RT) e domini RNAsi H. Una sequenza di segnale di poli (a) 3' è conservata per entrambi genomi di virus. (B) l'analisi di RT-PCR è stata effettuata utilizzando RNA isolato dalle foglie infetti da virus e gli iniettori che rilevano CaYMAV e CaYMV-Ap01. Nella stessa popolazione di 12 impianti, tre sono stati infettati con CaYMV-Ap01 solo, mentre i restanti sono stati infettati con CaYMAV e CaYMV-Ap01. (+) indica il controllo positivo e (-) indica il controllo negativo. Questa figura è riprodotto/modificati da Wijayasekara et al. 24 con permesso. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Qui vi presentiamo un nuovo approccio per identificare virus vegetali con genomi di DNA double-strand. Usiamo metodi standard per estrarre RNA e DNA da foglie infette e svolgere il sequenziamento di nuova generazione. Strumenti bioinformatici assemblare sequenze in contigs, identificano contigs che rappresenta il genoma del virus e assegnano genomi a gruppi tassonomici.

Combinando l'analisi di DNA in un'estrazione di greggio virione con l'analisi del RNA dalle foglie infette per scoprire nuovi Virus genomi

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sulla virologia ambientale, come l'emergere di nuove malattie. Il principale vantaggio di questo metodo consiste nella purificazione di varianti libere da componenti cellulari e nell'utilizzo di tali varianti per estrarre il DNA da sottoporre a sequenziamento. Sono giunto a questo approccio per la prima volta quando abbiamo scoperto che le piante nei nostri serbatoi erano infettate da uno o più Badnavirus sconosciuti. Gli individui alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà per tre motivi. Primo, l'omogeneizzazione è una fase critica per garantire rese di qualità. Secondo, la centrifugazione differenziale può produrre diversi pellet ed è necessario saperli identificare e separare. Terzo, l'interpretazione dei risultati ottenuti con il bio-analizzatore può risultare difficoltosa.Per tutti i passaggi di questa procedura, è necessario indossare una camice da laboratorio e guanti. Iniziare tagliando da 80 a 100 grammi di foglie da piante malate precedentemente congelate a meno 20 gradi Celsius. Quindi macinare le foglie in un frullatore Waring utilizzando 200 millilitri di buffer di macerazione e lo 0,5% di solfito di sodio. Trasferire l'omogeneato in un becher da un litro. Indossando ancora l'apparecchiatura di protezione individuale appropriata, aggiungere 18 grammi di urea e 25 millilitri di detergente non ionico al 10% all'omogenato e coprire il becher con della pellicola. Mescolare con un agitatore magnetico per tutta la notte. Il giorno successivo, trasferire l'omogenato in bottiglie per rotore da centrifuga da 250 millilitri e centrifugare in un rotore ad angolo fisso a 4000 ×g a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Recuperare il soprannatante e filtrare attraverso quattro strati di garza. Misurare il volume del liquido omogenato recuperato, quindi dividere l'omogenato in provette da centrifuga in polipropilene da 38,5 millilitri. Centrifugare l'omogenato a 40.000 ×g a quattro gradi Celsius per 2,5 ore. Al termine della centrifugazione, verificare la presenza di un pellet verde sul fondo della provetta e di un pellet bianco lungo la parete della provetta. Versare con attenzione il soprannatante, mantenendo entrambi i pellet, e posizionare i campioni sul ghiaccio. Separare il pellet bianco da quello verde è uno dei passaggi più complessi della procedura. Richiede pazienza e abilità.Lavorando in una cappa chimica, utilizzare un raschietto di gomma per separare i pellet. Raschiare e trasferire i pellet in diverse bottiglie per rotore. Posizionare le bottiglie per rotore contenenti i pellet bianchi sul ghiaccio. Aggiungere un millilitro di acqua a ciascuna bottiglia ed eseguire pipettaggi su e giù. Ogni cinque minuti, nell'arco di una o due ore, pipettare la miscela su e giù per ri-sospendere il pellet. Dopo che i pellet bianchi sono stati ri-sospesi, conservare le sospensioni tutta la notte a quattro gradi Celsius.Il giorno seguente, centrifugare la sospensione a 6000 ×g a quattro gradi Celsius per 10 minuti per rimuovere i residui rimanenti. Trasferire le sospensioni concentrate in nuove provette e centrifugare a 136.000 ×g a quattro gradi Celsius per due ore per ottenere il pellet di virioni. Rimuovere il sopranatante e risospendere il pellet in un millilitro di tampone.Iniziare questa procedura rompendo i virioni. Aggiungere quaranta microlitri di una soluzione di proteinasi K da due microgrammi per microlitro alle sospensioni del pellet e incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Aggiungere un volume di fenolo cloroformio alcol isoamilico a ciascun campione e agitare manualmente per 20 secondi.Centrifugare a temperatura ambiente a 16.000 ×g per cinque minuti. Rimuovere la fase acquosa superiore e trasferirla in un nuovo tubo. Ripetere questa estrazione due o più volte.Concentrare il DNA utilizzando la precipitazione con etanolo. Utilizzare 0,3 moli di acetato di sodio a pH 5,2 e 2,5 volumi di etanolo al 95%. Collocare i campioni a meno 20 gradi Celsius per 30-60 minuti. Successivamente, centrifugare a 13.000 ×g per 10-20 minuti per ottenere il pellet di DNA. Lavorando al banco del laboratorio, risospendere il pellet di DNA in un millilitro di tampone TE 0,1 millimolare. Filtrare la sospensione attraverso una colonna commerciale di filtrazione su gel mediante centrifugazione. Analizzare i campioni mediante elettroforesi su gel di agarosio al 1% utilizzando la colorazione con bromuro di etidio per osservare la qualità delle preparazioni e valutare la qualità del DNA come indicato nel testo. Quando esaminati mediante microscopia elettronica a trasmissione, particelle virali erano presenti nel pellet bianco ottenuto dalla frazionamento grezzo di foglie di canna infette. L'elettroforesi su gel di agarosio del DNA estratto dai pellet verde e bianco ha identificato due bande di DNA ad alto peso molecolare nella frazione bianca, indicate dai punti rossi e gialli.L'integrità dell'RNA isolato da foglie infette è stata inoltre verificata mediante elettroforesi su gel di agarosio. Questo grafico mostra l'abbondanza e la distribuzione tassonomica dei contig assemblati a partire dalla preparazione grezza del virus. E questo grafico rappresenta le proporzioni dei contig virali associati alla famiglia Caulimoviridae, al genere Badnavirus e ai contig associati a tre specie strettamente correlate.Questi due grafici mostrano l'abbondanza di contig derivati dal sequenziamento dell'RNA in base alla loro distribuzione tassonomica. Il grafico a destra rappresenta l'abbondanza di contig all'interno della popolazione di contig virali associati alla famiglia Caulimoviridae, genere Badnavirus e tre specie strettamente correlate. Il confronto tra i contig della lunghezza del genoma virale ottenuti mediante sequenziamento del DNA e dell'RNA, utilizzati come supporto reciproco, conferma la presenza di due genomi virali completi.Infine, l'analisi di RT-PCR utilizzando RNA isolato da foglie infette da virus ha rilevato entrambi i genomi virali.Una volta padroneggiata, questa tecnica può richiedere due giorni, mentre un principiante potrebbe impiegarne tre. Durante il primo utilizzo di questa procedura, è importante tenere traccia del volume dell'omogenato in ciascuno dei supernatanti, in modo da poter confrontare alla fine della procedura il rendimento finale di DNA con il materiale iniziale di partenza.Dopo la sua scoperta, questo metodo ha aperto la strada nel campo della virologia vegetale, consentendo ai ricercatori di identificare nuovi virus a DNA nell'ambiente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come omogeneizzare il materiale vegetale, concentrare le varianti e ottenere un buon rendimento di DNA utilizzabile per il sequenziamento di nuova generazione. Non dimenticare che lavorare con urea e fenolo cloroformio è estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni come indossare occhiali protettivi, guanti, camice da laboratorio e mascherina quando si maneggiano questi composti chimici. Per una ultracentrifugazione sicura, è fondamentale bilanciare correttamente i tubi; pertanto, è necessario pesarli e posizionarli in posizione opposta nel rotore, assicurandosi che il loro peso differisca al massimo di 0,01 g l'uno dall'altro.

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