Un metodo invasivo per l'attivazione della circonvoluzione dentata del Mouse dalla stimolazione ad alta frequenza

L'obiettivo generale di questo esperimento è osservare l'effetto della stimolazione ad alta frequenza sull'attività neuronale nella neurogenesi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in un meccanismo cellulare e molecolare allineato della stimolazione cerebrale profonda ad alta frequenza, come l'induzione dell'attività neuronale e la neurogenesi nell'ippocampo. Il vantaggio di questa tecnica è che dimostra il potente effetto della TBS ad alta frequenza sull'attività neuronale e sulla neurogenesi nel cervello adulto.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sugli effetti della TBS ad alta frequenza sul giro dentato del topo, può essere applicato anche ad altri sistemi come i gangli della base e le regioni subtalamiche per i disturbi cerebrali in clinica. Per iniziare questa procedura, posizionare un topo anestetizzato sul telaio stereotassico. Allineare gli archetti auricolari con la testa e stringerli delicatamente per sostenere la testa centrata.

Afferra la pelle anteriormente alle orecchie e rimuovine circa un centimetro quadrato sopra il cranio. Quindi rimuovere il muscolo e gli altri accessori che sovrastano il cranio con un batuffolo di cotone per esporre la superficie del cranio. Successivamente, applicare una soluzione di perossido di idrogeno per asciugare il cranio al fine di identificare le linee di sutura sagittale e lambda.

Quindi, identifica il bregma e il lambda. Il punto di bregma verrà utilizzato come punto originale per impostare la posizione del nucleo. Dopodiché, livella il cranio sul piano orizzontale usando questi due punti.

Assicurati che le altezze di questi due punti siano quasi le stesse sul piano ventrale dorsale. Inoltre, assicurarsi che il cranio sia livellato sul piano laterale mediale. Quindi, montare un elettrodo a microfilo di rame a due canali fatto in casa nel portaelettrodo rotante sul telaio chirurgico stereotassico.

Posizionare l'elettrodo direttamente sopra il bregma e impostarlo come sito originale. Quindi, spostare delicatamente l'elettrodo nella posizione corretta sopra il cranio, senza toccarlo. Utilizzare il display digitale sul telaio chirurgico stereotassico per indicare le posizioni anteriore, posteriore, laterale mediale e dorso-ventrale.

Quando viene identificato il sito desiderato per l'inserimento dell'elettrodo, contrassegnare la posizione con un pennarello nero. Successivamente, utilizzare le regolazioni stereotassiche dorso-ventrali per sollevare il portaelettrodo. Quindi, sterilizzare la punta del trapano con etanolo al 70%.

Utilizzare un trapano assistito da micromanipolatore portatile, praticare un foro di fresatura esattamente nella posizione contrassegnata. Utilizzare un batuffolo di cotone sterile per fermare qualsiasi sanguinamento durante l'operazione. Continuare a forare fino a quando la dura madre non è esposta.

Utilizzare un ago piegato per rimuovere eventuali frammenti ossei generati durante la perforazione e praticare un foro di spillo sulla dura madre senza danneggiare il tessuto cerebrale molle sottostante. Per confermare che il foro della fresa sia realizzato correttamente nella posizione desiderata, abbassare l'elettrodo per assicurarsi che si inserisca attraverso il foro della fresa senza intoppi senza toccare alcun ostacolo. Se non viene rilevata resistenza, inserire lentamente l'elettrodo alla profondità target dalla superficie del cranio.

Quindi, applicare il cemento dentale utilizzando una piccola spatola per tenere l'elettrodo in posizione. Man mano che il cemento si addensa, modellalo attorno all'elettrodo inserito e ad altre viti ossee per formare un bel tappo liscio. Quindi, sganciare l'elettrodo dal portaelettrodo.

Rimuovi il mouse dalla cornice stereotassica e rimettilo in una gabbia calda. Lascia che il topo si muova liberamente e lascialo riprendersi per due giorni nella gabbia. Per erogare la stimolazione, collegare l'elettrodo impiantato a uno stimolatore programmabile tramite elettrocateteri.

Configurare l'interfaccia del software. Quindi, impostare i parametri HFS come sei serie di sei treni di sei impulsi a 400 Hertz e l'intensità di stimolazione di 200 milliampere. Erogare HFS per il periodo di tempo desiderato come impostato.

Per il gruppo di controllo, impiantare elettrodi nei topi senza fornire alcuna stimolazione. Per la colorazione CFAS, stimolare i topi sperimentali due volte per un giorno. Per la marcatura BrdU, applicare stimolazioni appropriate sia al gruppo di stimolazione acuta che al gruppo di stimolazione cronica.

Durante il corso della stimolazione, assicurarsi che il mouse sia sveglio. Ricordarsi di assicurarsi che i cavi non siano attorcigliati. Al termine della stimolazione, scollegare con cautela il perno dell'elettrodo dal portaelettrodo nel connettore del sistema di registrazione.

Per il CFAS e la colorazione notch one, circa tre ore dopo l'ultimo HFDBS, anestetizzare i topi iniettando pentobarbital per ottenere un piano chirurgico di anestesia. Per la marcatura di BrdU, circa 12 ore dopo l'ultima stimolazione HFDBS, somministrare sei iniezioni di BrdU al controllo e ai topi stimolati a intervalli di due ore. 36 ore dopo l'ultima iniezione, anestetizzare profondamente i topi con pentobarbital e cospargerlo per via transcardiaca con 50 millilitri di PBS freddo seguito da 50 millilitri di paraformaldeide fredda al 4%.

Rimuovi la testa e fai un'incisione sulla pelle per esporre l'abilità. Usando una pinza, scheggia leggermente il cranio e rimuovi con cura l'intero cervello. Quindi, dopo aver fissato il cervello è al 4% di paraformaldeide per altri due giorni e trasferirlo in una soluzione di saccarosio al 30% a quattro gradi Celsius durante la notte.

Usando un criostato, taglia il cervello in sezioni coronali di 20 micron. Trasferisci e monta le sezioni sul vetrino con un pennello e conservale a meno 20 gradi Celsius. Successivamente, trasferire i vetrini in PBS normale senza fissativo.

Lavare le sezioni con PBS tre o quattro volte per cinque minuti ciascuna per rimuovere il fissativo in eccesso. Per il gruppo marcato con BrdU, incubare le sezioni in due molari di HCL per 30 minuti a 37 gradi Celsius e sciacquarle in un tampone borato molare da 0,1. Dopo 10 minuti, lavare le sezioni due volte in PBS per cinque minuti ogni volta.

Successivamente, incubare le sezioni in soluzione bloccante per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, incubare le sezioni con anticorpo policlonale anti-CFAS, anticorpo anti-notch one o anticorpo anti-BrdU in una soluzione bloccante a quattro gradi Celsius durante la notte. È stato le sezioni tre volte in PBS per 10 minuti ogni volta, quindi incubarle con Alexa Fluor 568 coniugato anti-rabbioso, Alexa Fluor 488 coniugato anti-capra o Alexa Fluor 488 coniugato anti-ratto anticorpo secondario per un'ora a temperatura ambiente.

Sono state le sezioni tre volte in PBS per 10 minuti ogni volta. Successivamente, coprire le sezioni cerebrali immunomarcate utilizzando un terreno di montaggio reagente anti-dissolvenza contenente DAPI. Lascia asciugare le sezioni all'aria e conservale al riparo dalla luce a quattro gradi Celsius.

Qui è mostrato un paradigma sperimentale per il trattamento con HFS nella generazione di neuroni proliferanti marcati con BrdU nel DG. Gli animali sono stati divisi in un gruppo acuto e uno cronico per ricevere diversi modelli di stimolazione. Successivamente, agli animali di entrambi i gruppi è stato iniettato BrdU il sesto giorno. L'ottavo giorno, gli animali sono stati anestetizzati e cosparsi per la preparazione delle sezioni del criostato.

Ecco le immagini della colorazione in immunofluorescenza BrdU post-HFDBS nel DG. Un'analisi quantitativa della produzione neuronale ha indicato che la stimolazione acuta nel DG non poteva migliorare la neurogenesi. Mentre la stimolazione cronica nel DG ha significativamente sovraregolato la neurogenesi. Rispetto al gruppo di controllo, il numero di cellule marcanti BrdU è aumentato significativamente nel gruppo cronico, sia nell'emisfero omolaterale che in quello controlaterale.

Queste sono le immagini della colorazione immunofluorescente BrdU post-HFDBS nella sottoregione PP. Un'analisi quantitativa della produzione neuronale ha indicato che la stimolazione acuta o cronica nel PP non può aumentare significativamente la neurogenesi. Il numero di cellule marcanti BrdU era relativamente stabile con o senza il trattamento HFS.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di posizionare correttamente l'elettrodo e di erogare correttamente la stimolazione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della stimolazione ad alta frequenza delle neuroscienze arruolati nei modelli. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come fornire una stimolazione ad alta frequenza al nucleo cerebrale profondo.