Imaging di fluorescenza Live-cella del completo ciclo cellulare vegetativo della lenta crescita sociale batterio xanthus di Myxococcus

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia cellulare batterica, come ad esempio come le cellule replicano il loro DNA, come crescono e come si dividono. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le cellule batteriche viventi possono essere monitorate per almeno 24 ore al microscopio e la tecnica non richiede attrezzature speciali. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla crescita e la divisione del Myxococcus xanthus, può anche essere facilmente applicato ad altri batteri a crescita lenta.

Per iniziare, sospendi nuovamente una singola colonia di M.xanthus in 500 microlitri di CTT all'1%, integrata con antibiotici, in una provetta sterile e trasferisci l'intera sospensione in un pallone di Erlenmeyer da 50 millilitri contenente cinque millilitri di CTT all'1%. Preparare una soluzione per microscopia di agarosio all'1% contenente lo 0,2% di CTT mescolando un grammo di agarosio con 80 millilitri di tampone TPM e 20 millilitri di terreno CTT all'1%. Microonde la soluzione fino a quando l'agarosio non è fuso.

Riempite una capsula di Petri con circa 60 millilitri di agarosio fuso e lasciatela raffreddare a temperatura ambiente. Preriscaldare il tampone di agarosio a 32 gradi Celsius per almeno 15 minuti prima dell'uso. Quindi, posiziona un vetrino coprioggetti in vetro sterile su un telaio di plastica o metallo che ha un foro nel mezzo, quindi usa del nastro adesivo per fissare il vetrino coprioggetti al telaio.

Aggiungere da 10 a 20 microlitri di cellule di M.xanthus cresciute in modo esponenziale sul vetrino coprioggetti. Per aggiungere microsfere fluorescenti come marcatori fiduciali delle cellule, utilizzare il tampone TPM per diluire le microsfere a 1:100. Agitare accuratamente la sospensione del tallone e aggiungere da cinque a 10 microlitri alle cellule.

Dal grande tampone di agarosio preriscaldato all'1%, ritaglia un piccolo tampone delle dimensioni del vetrino coprioggetti e posizionalo sopra le cellule. Quindi posizionare un vetrino coprioggetti sulla parte superiore del tampone per prevenire l'evaporazione e mantenere le celle in un ambiente umido. Incubare il campione al microscopio a 32 gradi Celsius per 15-20 minuti per consentire alle cellule di attaccarsi al fondo del tampone di agarosio prima delle registrazioni al microscopio time-lapse.

Per eseguire la microscopia time-lapse, accendere il microscopio e avviare il software di controllo del microscopio. Selezionare l'obiettivo corretto, gli specchi e il filtro corretti per acquisire immagini a contrasto di fase e immagini di proteine fluorescenti verdi, fluorescenti rosse o gialle. Aggiungere una goccia di olio da immersione di alta qualità sulla lente dell'obiettivo e sul fondo del campione pre-incubato a 32 gradi Celsius.

Con il lato del foro rivolto verso l'obiettivo, posizionare la struttura metallica con il campione sul tavolino del microscopio, quindi fissare saldamente il campione nel supporto del tavolino. Metti a fuoco le celle spostando il tavolino in direzione Z più vicino all'obiettivo. Quando l'olio sull'obiettivo e il campione entrano in contatto, spostare lo stadio in direzione X/Y.

Passa al software Metamorph e apri lo strumento di acquisizione. Selezionare Contrasto di fase nell'elenco a discesa Impostazioni e impostare il Tempo di esposizione su 100 millisecondi. Fare clic su Mostra in tempo reale, Porta cella nel piano focale e spostare lo stage in direzione X/Y fino a quando non sono visibili più celle singole nel campo visivo.

Assicurarsi che almeno una microsfera fluorescente si trovi nella regione di view per allineare successivamente le immagini acquisite. Quindi, aprire la procedura guidata di acquisizione multidimensionale del software di controllo del microscopio per impostare un esperimento time-lapse che consente al microscopio di acquisire immagini a più lunghezze d'onda e posizioni del tavolino, se necessario. Nella scheda Principale, attiva il time-lapse e le lunghezze d'onda multiple.

Sul lato sinistro della finestra appariranno altre schede. Fare clic sulla scheda Salvataggio e selezionare Directory per selezionare una cartella vuota sul disco rigido del computer in cui salvare le immagini acquisite, quindi attivare Incrementa nome base se il file esiste per assicurarsi che i set di dati consecutivi non sovrascrivano quelli precedenti. Assegna all'esperimento un nome con la data e il nome del ceppo o il titolo dell'esperimento.

Fare clic sulla scheda time-lapse per regolare i parametri time-lapse, quindi impostare l'intervallo di tempo su 20 minuti e impostare la durata su 24 ore. Il numero di punti temporali cambierà automaticamente. Ora, fai clic sulla scheda Lunghezze d'onda.

Selezionare il numero di lunghezze d'onda da acquisire per ogni immagine in ogni punto temporale modificando il numero. Selezionare Consenti posizione AF memorizzata hardware separata per ciascuna lunghezza d'onda. Fare clic sulla scheda Prima lunghezza d'onda dall'alto.

Nell'elenco a discesa Illuminazione, selezionare Contrasto di fase. Selezionare 100 millisecondi per l'esposizione e nell'elenco a discesa Acquisisci, selezionare Ogni punto temporale. Disattivare l'esposizione automatica nell'elenco a discesa selezionando Mai e selezionare Ogni acquisizione nell'elenco a discesa per Messa a fuoco automatica.

Impostare l'esposizione per ogni lunghezza d'onda come appena dimostrato utilizzando i seguenti parametri. Quindi, per acquisire immagini da più posizioni del tavolino, nella scheda Principale attivare Posizioni multiple del tavolino. Fare clic sulla scheda Stage e fare clic sul pulsante Live per visualizzare il campo visivo.

Spostare lo stage nella direzione X/Y fino a quando non si raggiunge una ROI nel campo visivo. Salvare le coordinate X e Y nella scheda Stage facendo clic sul segno più. Sposta nuovamente la fase in direzione X/Y fino a quando non viene trovata una nuova ROI e salva nuovamente le coordinate facendo clic sul segno più.

Continuare fino a quando non viene salvato il numero di regioni desiderato. Controlla ancora una volta che le celle siano a fuoco facendo clic sulle diverse posizioni X e Y salvate e avvia l'autofocus hardware facendo clic su AFC hold per mantenere costante la posizione Z salvata nel corso dell'esperimento. Avviare la registrazione time-lapse nella procedura guidata di acquisizione multidimensionale del software di controllo del microscopio facendo clic su Acquisisci.

Verificare che le celle siano ancora a fuoco dopo i primi punti temporali nelle registrazioni time-lapse per massimizzare la qualità delle immagini e rimettere a fuoco se necessario. Per generare filmati time-lapse ed eseguire l'allineamento delle immagini, avviare il software di analisi ed elaborazione delle immagini. Aprire le immagini come pila facendo clic su Rivedi dati multidimensionali, Seleziona file di base, Seleziona directory, quindi aprire la cartella con i dati multidimensionali.

Controllare il set di dati e fare clic su Visualizza. Il set di dati verrà mostrato come singole immagini dal punto temporale uno fino alla fine. Attiva la lunghezza d'onda per la creazione di una pila, quindi seleziona tutte le immagini che devono essere nella pila e fai clic su Carica immagini.

Ripeti questo passaggio per tutte le lunghezze d'onda e salva le pile completate. Attiva la pila di immagini che deve essere corretta per la deriva. Apri lo strumento di allineamento utilizzando App, Allineamento automatico.

Selezionare Pila come origine per le immagini e Primo piano/punto temporale come piano di riferimento, quindi selezionare la pila con il pulsante Pila di origine e fare clic su Applica. Al termine dell'allineamento automatico, salvare la pila allineata. Per generare un filmato in formato MOV o AVI, aprire la funzione Crea filmato tramite Stack, Crea filmato.

Seleziona le registrazioni time-lapse con il pulsante Stack sorgente, quindi seleziona il formato di output, la frequenza dei fotogrammi, il numero di fotogrammi e fai clic su Salva. In questo esperimento time-lapse con cellule mobili DK1622 wild type, le immagini a contrasto di fase sono state acquisite ogni cinque minuti per 24 ore. Come previsto, le cellule erano mobili e si muovevano prevalentemente in gruppi.

Nell'imaging di cellule vive a contrasto di fase con cellule Delta-mgIA non mobili, la crescita e la divisione delle singole cellule sono state seguite durante la formazione delle microcolonie. Quando le immagini sono state acquisite ogni cinque minuti per 24 ore, è stato possibile quantificare il tempo di interdivisione di 235 più o meno 50 minuti con risoluzione di una singola cella. Per indagare se le cellule crescono normalmente mentre tracciano le proteine marcate con yfp per lunghi periodi, sono state tracciate le cellule di M.xanthus che esprimono ParB-YFP.

ParB-YFP ha inizialmente formato un singolo cluster nella regione cellulare subpolare. Poco prima o dopo la divisione cellulare, l'ammasso si è duplicato, con un ammasso rimasto al vecchio polo cellulare e il secondo traslocato al nuovo polo cellulare. In questo esperimento, le cellule non mobili che esprimono FtsZ-gfp hanno mostrato un forte accumulo di FtsZ-gfp a livello della cellula mediana, che determina la posizione della divisione cellulare.

FtsZ-gfp ha formato un cluster a metà cellula, prevalentemente nelle cellule più lunghe. Due ore dopo la divisione cellulare, FtsZ-gfp si è accumulato a metà cellula nelle cellule figlie. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita di routine su Myxococcus xanthus e su qualsiasi altro batterio a crescita lenta.

Quando si imposta questa procedura per un batterio, è importante regolare la composizione del terreno di crescita nella piastra di agar per soddisfare le esigenze di crescita specifiche di quel batterio. Per qualsiasi batterio, è importante determinare le condizioni di imaging ottimali come il tempo di esposizione, l'intensità della luce e la frequenza di imaging per evitare la fototossicità. Inoltre, per qualsiasi proteina marcata con fluorescenza, le condizioni di imaging devono essere regolate per evitare la fototossicità e anche il fotosbiancamento.