Citometria di flusso di database-Guida per la valutazione della maturazione delle cellule mieloidi del midollo osseo

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella diagnosi di malattie mieloidi come sindromi mielodisplasia o altre malattie ematologiche che si evolvono con anomalie di maturazione nei lignaggi delle cellule mieloidi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che riduce la soggettività dello sperimentatore in tale analisi e interpretazione. Questo metodo può fornire informazioni su quali sono i parametri più discriminatori per la mielodisplasia.

Permette la quantificazione delle differenze rispetto alle normali popolazioni di cellule mieloidi. A dimostrare la procedura sarà Tiphanie Picot, una borsista post-dottorato del nostro laboratorio. Iniziare mescolando 600 microlitri del campione di cellule primarie con 10 millilitri di tampone di lavaggio in un tubo conico da 15 millilitri per due centrifugazioni e 10 millilitri di tampone di lavaggio fresco per lavaggio.

Dopo il secondo lavaggio, sospendere nuovamente il pellet in 400 microlitri di tampone di lavaggio fresco e trasferire 350 microlitri della sospensione cellulare in un tubo FACS in polipropilene a cinque millilitri, contenente l'intero pannello di anticorpi dorsali. Dopo aver accuratamente miscelato le cellule, pipetta uguale volumi della soluzione anticorpale cellulare in tre nuovi tubi in polipropilene e portare il volume finale in ogni tubo fino a 200 microlitri con tampone di lavaggio fresco, se necessario. Successivamente, aggiungere il volume appropriato di anticorpi contro i marcatori della superficie cellulare di interesse con la miscelazione, per un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente, protetta dalla luce.

Al termine dell'incubazione, aggiungere due millilitri di soluzione lisciviante con miscelazione, per un'incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente, protetta dalla luce. Raccogliere le cellule lisciviate per centrifugazione e scartare tutti tranne gli ultimi 50 microlitri di supernatante in ogni tubo, senza disturbare il pellet. Sospendere di nuovo i pellet nel supernatante rimanente, con miscelazione delicata, e aggiungere due millilitri di tampone di lavaggio fresco ad ogni campione.

Dopo il secondo lavaggio, scartare il supernatante, lasciando circa 50 microlitri di volume residuo in ogni tubo, senza disturbare il pellet. Sospendere di nuovo il pellet in 200 microlitri di PBS con miscelazione, per un'analisi immediata. Per leggere i campioni su un citometro a flusso, aprire prima un nuovo esperimento nel software del citometro di flusso e rinominare l'esperimento in base al nome, al tipo di campione e alla data.

Create un nuovo campione per tre tubi e specificate gli anticorpi utilizzati in ogni tubo nel layout dell'esperimento. Aprire le impostazioni del citometro e selezionare le impostazioni dell'applicazione per applicare i valori ottenuti nella configurazione mensile. Aprire un nuovo foglio di lavoro globale e creare i grafici a punti appropriati per la gating delle cellule singole, nonché per le popolazioni di granulociti, monociti, blast e linfociti.

Creare un nuovo foglio di lavoro globale per i controlli di retribuzione. Quindi, acquisire 500.000 eventi da ogni tubo, a un tasso di acquisizione medio, esportando i dati come file fcs 3.0, dopo la loro convalida tecnica. Prima di iniziare una nuova analisi, scaricare i file cyt contenenti i normali dati del midollo osseo, per lignaggi rossi neutrofili, monocitici e nucleati e i file di analisi in formato inp.

Quindi, salva i dati sul desktop. Al fine di salvare la maturazione neutrofila nella base di dati, aprire prima il software Infinicyt e quindi aprire il file di cito corrispondente ai dati di maturazione dei neutrofili. Disegnare la via di maturazione sul grafico APS e salvare il percorso di maturazione del neutrofilo nel database.

Aprire il file fcs per la maturazione del lignaggio neutrofilo che deve essere analizzata. Caricare il file inp di maturazione neutrofilo dalla scheda profili. L'analisi per questo lignaggio è divisa in tre fasi.

Inizia con la selezione di esplosioni positive cd34 impegnate con neutrofili. A tal fine, utilizzare un incrocio di sette gate, per consentire la selezione degli eventi b-negativi CD34 positivi, CD117 positivi, HLADR bassi, CD10 negativi, CD13 positivi, CD11 b-negativi. Continuare l'analisi con la selezione dei precursori neutrofili positivi CD117, CD34 negativi.

Continuare l'analisi con la selezione di cellule neutrofile più mature. Quindi, mostra l'analisi delle cellule di lignaggio monocitico. Disegnare il percorso di maturazione sul grafico APS.

Verificare che la freccia che indica il senso di maturazione sia orientata da cellule immature, monocitiche, CD14 negative, IREM2 negative, ai monociti maturi, CD14 positivo, IREM2 positivo. Salvare il percorso di maturazione per il lignaggio monocitico nel database. Aprire il file fcs per la maturazione del lignaggio monocitico che deve essere analizzato.

Carica il profilo per l'analisi del lignaggio monocitico. Per identificare le cellule di lignaggio monocitico, utilizzare un'intersezione di quattro porte che consenta la selezione di eventi positivi CD64, POSITIVI CD117, CD117 negativi, HLADR. Assegnare questi eventi alla scheda monocitica nell'albero della gerarchia della popolazione.

Aprire il file di cito NRC che deve essere salvato nel database NRC. Disegnare la via di maturazione sul grafico APS e salvare la via di maturazione dei globuli rossi nucleati nel database. Aprire il file fcs che deve essere analizzato.

Caricare dai profili il modello di analisi per i globuli rossi nucleati. L'analisi per questo lignaggio è divisa in due fasi. A partire dalla selezione delle esplosioni positive ed eretroidi positive del CD34.

Qui, utilizzare un'intersezione di sette porte per consentire la selezione degli eventi positivi CD34, CD117 positivi, HLADR bassi, CD105 positivi, CD33 negativi, CD36 positivi, CD71 positivi. Assegnare questi eventi alla scheda NRC nella gerarchia della popolazione. Rimuovere dalla visibilità le esplosioni positive di erythroid cd34.

Per identificare cellule erytroidi più mature, utilizzare un'intersezione di quattro porte che consentono la discriminazione di CD45 negativo e CD45 positivo basso, basso a dispersione laterale, CD36 positivo alto e CD71 positivo alto. Quindi, rimuovere le piastrine basse a dispersione del lato alto CD36 dai globuli rossi nucleati e assegnare questa popolazione alla scheda NRC. Per valutare la maturazione mieloide nel compartimento del midollo osseo, aprire il file del cito corrispondente al lignaggio di interesse dal caso che deve essere valutato.

Mantenere visibili solo gli eventi assegnati alla scheda del neutrofilo nella struttura gerarchica della popolazione. Disegnare la via di maturazione sul grafico APS e caricare il database corrispondente alla maturazione del neutrofilo nel midollo osseo normale e confrontare i dati. Se i dati sono almeno parzialmente compatibili, il software creerà un diagramma delle differenze di maturazione normalizzato e una banda di parametri per visualizzare le differenze di maturazione.

Per confrontare la maturazione dei monociti nel compartimento del midollo osseo, per un nuovo caso con i dati dei normali midolli ossei, anche nel database dei monociti, aprire il file del cito corrispondente al lignaggio delle cellule monocitiche. Mantenere visibili solo gli eventi assegnati alla scheda monociti nell'albero della gerarchia delle popolazioni e disegnare il percorso di maturazione nel grafico APS. Caricare il database corrispondente alla maturazione dei monociti nei normali midolli ossei e confrontare i dati.

Per confrontare la maturazione dei globuli rossi nucleati nel compartimento del midollo osseo, per un nuovo caso, con i dati dei normali midolli ossei, inclusi nel database NRC, aprire il file di cito corrispondente al lignaggio dell'NRC. Mantenere visibili solo gli eventi assegnati alla scheda NRC nella struttura gerarchica della popolazione. E disegnare il percorso di maturazione sul grafico APS.

Caricare il database corrispondente alla maturazione NRC nei normali midolli ossei e confrontare i dati. Quindi, per visualizzare il significato delle differenze tra il nuovo file e i dati inclusi nel database, fare clic su differenze di maturazione normalizzate e zoom. Tenere presente che i metodi che utilizzano gli algoritmi di classificazione gerarchica nell'analisi citometrica dei dati di flusso sono altamente soggettivi e intrinsecamente imprecisi, perché non contano per la sovrapposizione della popolazione cellulare.

La valutazione di nuovi casi di citopenia, sospettati di essere MDS rispetto ai database di maturazione normale mieloide, consente l'identificazione di antigeni di maturazione anormalmente espressi di lignaggi neutrofili, monociti e NRC, anche in casi senza anomalie citologiche o citogeniche. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di acquisire i dati citometrici del flusso, in modo standardizzato, per eseguire la configurazione mensile dell'impostazione del citometro, i controlli giornalieri, per pipettare rigorosamente l'anticorpo prima dell'uso e rispettare i tempi di colorazione. Seguendo questa procedura, un altro metodo come compass, può essere eseguito per confrontare il diverso gruppo di casi e per rispondere a domande aggiuntive, come qual è l'impronta tipografica finale per un particolare gruppo di casi.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori interessati ad esplorare i modelli di maturazione cellulare mieloide, nei casi di ematopoiesi clonale di potenziale indeterminato per identificare i cambiamenti tipici finali correlati in modo affidabile per il processo displastico. Si prega di notare che l'aggiornamento della banca dati con un numero maggiore di dati provenienti da donatori sani può migliorare la solidità dell'analisi.