Name: In Vivo Sonde di microdialysis metodo di raccogliere grandi proteine extracellulari dal cervello liquido interstiziale con cut-off di alto peso molecolare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Impara la microdialisi in vivo con sonde ad alto peso molecolare per raccogliere grandi proteine dal liquido interstiziale cerebrale in topi svegli. Questo metodo consente di studiare il trasporto di substrati e la clearance dei rifiuti nel cervello.

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Questo lavoro è stato supportato da cm sovvenzione per la ricerca scientifica in settori innovativi (cervello proteina invecchiamento e demenza Control)(15H01552) dal MEXT e sovvenzione per giovani scienziati (B) (16K 20969). L'autore ringrazia il Dr. David M. Holtzman e Dr. John R. Cirrito per i consigli tecnici durante lo sviluppo di questo metodo.

Tutti gli studi sugli animali erano esaminati e approvati dal comitato di uso della Graduate School of Medicine presso l'Università di Tokyo e istituzionali Animal Care.
1. pre-chirurgico
<ol><li>Prima di iniziare l'intervento chirurgico, pulire tutto con etanolo al 70% per mantenere condizioni di sterilità. Supporto termico utilizzando un termoforo è raccomandato.</li>
	<li>Anestetizzare i topi tramite l'iniezione intraperitoneale di cloralio idrato (400 mg/kg). Confermare amputate eseguendo un pizzico di punta. Uso di meloxicam SR a induzione e buprenorfina al momento del ripristino BID per almeno 24 h è raccomandato.</li>
	<li>Radersi i capelli con un clipper chirurgico. Difficoltà un mouse con il mouse e adattatore neonatale del ratto utilizzando barre di orecchio e un morsetto di naso. Nota: È fondamentale per assicurarsi che la testa del mouse è assicurata in questa fase e non si muove by-side.</li>
	<li>Applicare unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.</li>
</ol>2. stereotassica chirurgia per l'impianto di Cannula Guida
<ol><li>Impostare il mouse e adattatore neonatale del ratto sull'apparato stereotassica. Fare un'incisione sagittally sulla pelle sopra il cranio usando un bisturi.　Pulire il sangue ed il tessuto connettivo sul cranio usando un batuffolo di cotone umido.</li>
	<li>Determinare le coordinate per la regione del cervello di interesse utilizzando Atlante del cervello. Prima di iniziare le misurazioni, assicurarsi che tale linea mediana è dritta in modo che la punta del trapano può essere spostato A-P e rimanere sulla sutura mediana tutto il tempo. Nota: Questo articolo utilizza la coordinata (A / p:-3,10 mm, M/l:-2,50 mm, D/v:-1,20 mm, 12 gradi) per indirizzare ippocampo posteriore.</li>
	<li>Cranio di livello A-P<ol>
<li>Allegare un trapano su un manipolatore della cornice stereotassica. Abbassare il trapano fino a toccare delicatamente lambda e registrare le coordinate ventrale. Ripetere questa procedura per bregma. Nota: Quando il cranio è livellato, la misura verticale di bregma è uguale a quello di lambda. Se non, modificare di conseguenza l'altezza del morsetto di naso. Dopo il cranio ottiene livellato, registrare la coordinata antero/posteriore, laterale di bregma.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Livello cranio sinistra-destra<ol>
<li>Spostare il trapano dal bregma alla coordinata (A / p:-3,10 mm, M/l: +2,0 mm), abbassare il trapano al cranio e registrare la coordinata verticale. Quindi ripetere questa procedura per la coordinata (A / p:-3,10 mm, M/l:-2,00 mm). Nota: Se il cranio è livellato, queste misurazioni verticali di due punti equidistanti dalla linea mediana sono uguali. In caso contrario, regolare l'altezza delle barre dell'orecchio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Praticare un foro della bava con attenzione all'altezza delle coordinate di destinazione (A / p:-3,10 mm, M/l:-2,50 mm) per impiantare una cannula di guida. Se il diametro di un foro della bava non è abbastanza grande per un impianto di cannula guida, praticare un altro foro che si sovrappone con quello primo. Praticare un altro foro sull'osso parietale di destra (lato controlaterale) e inserire una vite ossea, che aiuta a proteggere il cemento dentale in 1.10 (Vedi Figura 1B).</li>
	<li>Tagliare un pezzo di chiusura circolare dal lato posteriore del coperchio di una provetta da centrifuga da 1,5 mL di una lama di rasoio e fare una 'corona '. Questa corona è utilizzata per impedire la diffusione alla pelle di cemento dentale. Posizionarlo sul cranio in modo che i fori della bava effettuati nel passaggio 2.5 soggiorno all'interno del cerchio (Vedi Figura 1).</li>
	<li>Impostare un assembly stereotassica mettendo una cannula di guida sul braccio più corto di un adattatore stereotassica e fissarlo con un dado. Impostare il braccio più lungo dell'adattatore stereotassica sul morsetto elettrodo. Allegare il manipolatore dell'apparato stereotassica (Vedi Figura 1A).</li>
	<li>Ruotare il gruppo di stereotax D-V sul braccio manipolatore di 12 gradi (Vedi Figura 1B). Spostare la cannula guida il foro della bava fatto in 1.6. Inserire la cannula di guida lentamente nel cervello di abbassandola di 1,2 mm. Nota: L'angolo della sonda è specifico dell'ippocampo; altre regioni possono richiedere altri angoli o nessun angolo a tutti. Consultare un Atlante del cervello per coordinate precise. Asciugare la superficie del cranio, perché se non il cemento non attaccherà e tappo di cemento può diventare sloggiato</li>
	<li>Aggiungere il cemento dentale all'interno la corona per coprire integralmente sia la parte metallica della cannula di guida e la vite dell'osso abbastanza per fissarli. Applicare il cemento dentale aggiuntiva se c'è una parte del cranio esposto.</li>
	<li>Attendere fino a quando il cemento dentale è completamente asciugato (~ 12-20 min). Rimuovere l'adattatore stereotassica dal morsetto elettrodo. Rimuovere il dado e sostituire l'adattatore stereotassica con una sonda testimone e fissare il dado.</li>
	<li>Rilasciare il mouse dall'apparato stereotassica e ospitano il mouse da solo in una gabbia individuale. Nota: Il mouse non deve essere lasciato incustodito fino a quando ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale. Controllare il mouse ogni giorno fino al giorno di microdialysis. Il mouse riceve NSAIDs quali carprofen, se sembra essere nel dolore. 2 settimane di attesa è necessario per gli studi di sonno-veglia quindi il mouse habituates per il nuovo ambiente10, ma altri tipi di studi possono richiedere periodi di recupero più brevi (ad es., 1-2 giorni).</li>
</ol>3. Microdialysis Setup
<ol><li>Controllo di qualità delle sonde: riempire una siringa monouso da 1ml con acqua distillata waterand collegarlo alla presa (più breve porta) di una sonda utilizzando un tubo di Chester. Coprire i fori di sfiato con le dita e premere lo stantuffo della siringa delicatamente per infondere acqua alla sonda. Controllare che l'acqua appare dall'entrata della sonda e non vi siano perdite sulla superficie di una membrana di microdialysis.<ol>
<li>Attivazione delle sonde: immergere le membrane di una sonda in etanolo (70-100%) per due secondi. Quindi, infondere acqua distillata nella sonda nuovamente con una siringa nuovamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione del tampone di aspersione di: al fine di evitare l'adesione delle molecole bersaglio per i tubi, aggiungere BSA di diluire la soluzione di BSA 30% al 4% con artificiale CSF (1,3 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 3 mM KCl, 0,4 mM KH2PO4, 25mm NaHCO3 , 122 mM NaCl, pH = 7,35), concentrazione di elettroliti nel CSF, immediatamente prima dell'uso che si avvicina. Il buffer di perfusione attraverso un'unità filtro siringa con 0,1 µm dei pori del filtro. Nota: 4% BSA migliora il recupero per attaccare le proteine ma può limitare severamente la consegna di composti, soprattutto per i composti che hanno alta BSA-associazione. Si tratta di un vantaggio di usare la concentrazione più bassa di BSA (ad esempio 0,15%) in taluni casi3. Si noti che BSA può aggregare molto facilmente quando agitato da piastra vortice o mescolare. Questi aggregati possono ostruire sonde o pori di membrana. Usare cautela quando si prepara una soluzione di BSA per limitare questa aggregazione</li>
	<li>Preparare due linee separate per ingresso e uscita (Vedi Figura 1) e collegare entrambe le linee con un ago di connessione. Riempire una siringa monouso da 3 mL riempita con buffer di aspersione e collegarlo con il fine di ingresso del tubo utilizzando un ago smussato-fine. Riempire il tubo intero con buffer di aspersione eseguendo la pompa a siringa.</li>
	<li>Arrestare la pompa a siringa e sostituire l'ago di connessione tra ingresso e uscita linea con una sonda per microdialisi attivato dal punto 3.3 (Vedi Figura 1). Prima di questa sostituzione, inserire il dado la sonda.</li>
	<li>Montare il rullo di avvolgimento nel tubo di uscita della pompa a rulli. Avviare la pompa a siringa a 10 µ l/min e quindi la pompa roller alla portata leggermente più lenta (9.5-9.8 µ l/min). Assicurarsi di rimuovere tutte le bolle d'aria nel tubo intero, che può influenzare il recupero quando entrano la sonda.</li>
	<li>Anestetizzare il mouse dal punto 1.12 nello stesso modo come descritto al punto 1.2. Mettere il collare del mouse intorno al collo. Rimuovere il dado e la sonda testimone e lentamente inserire una sonda per microdialisi da 3,4 attraverso la cannula di guida e fissare il dado.</li>
	<li>Posto il mouse nella gabbia collegato ad un sistema di movimento libero e di legare il mouse con il collare. Continuare a correre sia pompa a siringa e pompa roller alla portata indicata nel passaggio 3.5 per almeno 1 h. Nota: Per raggiungere collezione ISF da animali svegli, questo articolo utilizza un sistema di movimento libero, dove la gabbia stessa risponde al movimento di un animale per mantenere i tubings di torsione. In alternativa, il liquide girelle disponibile da varie aziende possono essere utilizzate anche.</li>
	<li>Fermata del rullo pompa prima e poi la pompa a siringa. Impostare la portata desiderata. Eseguire la siringa pompa 20% più veloce rispetto alla pompa a rulli. Nota: per esempio, se si esegue a 1 µ l/min, azionare la pompa a siringa a 1.2 µ l/min portata ottimale dovrebbe essere determinata empiricamente per ogni molecola.</li>
	<li>Raccolta dei campioni ISF: inserire l'estremità libera del tubo di uscita sul collettore frazione refrigerati. Nota: Volume di campione appropriato varia a seconda di analisi utilizzate per l'analisi.</li>
	<li>Dopo il completamento dell'esperimento, rimuovere la sonda. (Anestetizzare il mouse come necessario).  Gestire il recupero del mouse allo stesso modo come descritto al punto 2.11. Analizzare l'ISF raccolti da metodi quali HPLC o ELISA.</li>
	<li>Per lavare il tubo intero dopo microdialisi, collegare ingresso e presa tubi nuovo sostituendo la sonda con la connessione dell'ago ed eseguire la candeggina diluita nel tubo intero e poi lavare con acqua. Asciugare e conservarla per un uso ripetuto. Nota: Altri tipi di tubi sono accettabili, tuttavia, BSA nel buffer di perfusione possa ostruire i tubi di piccolo diametro, così questi tubi sono considerati come monouso. I tubi possono essere logorati o intasato dopo molteplici usi, quindi assicuratevi di che la portata sia coerenza ogni volta prima dell'uso.</li>
</ol>

<ol><li>Lei, Y., Han, H., Yuan, F., Javeed, A., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+interstitial+system%3A+Anatomy%2C+modeling%2C+in+vivo+measurement%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The brain interstitial system: Anatomy, modeling, in vivo measurement, and applications.</a> Progress in Neurobiology. 157, 230-246 (2017).</li>
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<li>Yamada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Microdialysis+of+brain+interstitial+fluid+for+the+determination+of+extracellular+tau+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo Microdialysis of brain interstitial fluid for the determination of extracellular tau levels.</a> Methods in Molecular Biology. 1523, 285-296 (2017).</li>
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<li>Bero, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+the+regional+vulnerability+to+amyloid-%CE%B2+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates the regional vulnerability to amyloid-β deposition.</a> Nature Neuroscience. 14 (6), 750-756 (2011).</li>
<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+extracellular+tau+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates extracellular tau in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (3), 387-393 (2014).</li>
<li>Pooler, A. M., Phillips, E. C., Lau, D. H. W., Noble, W., Hanger, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+release+of+endogenous+tau+is+stimulated+by+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Physiological release of endogenous tau is stimulated by neuronal activity.</a> EMBO Reports. 14 (4), 389-394 (2013).</li>
<li>Castellano, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+apoE+isoforms+differentially+regulate+brain+amyloid-%CE%B2+peptide+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human apoE isoforms differentially regulate brain amyloid-β peptide clearance.</a> Science Translational Medicine. 3 (89), 89ra57(2011).</li>
<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+in+vivo+turnover+of+tau+in+a+mouse+model+of+tauopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Analysis of in vivo turnover of tau in a mouse model of tauopathy.</a> Molecular Neurodegeneration. 10 (1), 55(2015).</li>
<li>Taylor, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+local+and+long-range+neuronal+network+dynamics+by+simultaneous+optogenetics%2C+reverse+microdialysis+and+silicon+probe+recordings+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Investigating local and long-range neuronal network dynamics by simultaneous optogenetics, reverse microdialysis and silicon probe recordings in vivo.</a> Journal of Neuroscience Methods. 235, 83-91 (2014).</li>
</ol>

L'autore non ha nulla di divulgare.

Microdialisi con alto peso molecolare, tagliata le membrane deve essere operati da una modalità push-pull, pertanto è fondamentale che la portata è accurata e costante. L'imprecisione nei tassi di flusso può essere la causa della generazione di bolla di aria e incoerenza nella concentrazione del campione. Se il flusso è incoerente, controllare tutti i collegamenti per perdite. Se il problema persiste, potrebbe essere necessario ri-iniziare con tubi e nuove sonde.
Microdilaysis sonde sono conti...

ISF comprende 15-20% del volume totale del cervello e offre un microambiente critico per la trasduzione del segnale, il substrato trasporto e sdoganamento dei rifiuti1. Quindi, la capacità di raccolta ISF da animali viventi fornirà maggiori implicazioni per vari processi biologici come pure il meccanismo di malattia. Microdialisi in vivo sono uno dei pochi metodi quel campione e quantificare molecole extracellulari da ISF da sveglio, animali liberi di muoversi e servono quindi come uno strumento utile nel campo di ricerca neuroscienze2,3. In questo metodo, sonde di microdialisi con membrane semipermeabili sono inseriti nel cervello e irrorati con buffer di perfusione alla portata relativamente lento (0.1-5 µ l/min). Durante la perfusione, molecole extracellulari in ISF passivamente diffondono la sonda secondo il gradiente di concentrazione e raccolgono un dializzato. Sebbene questo articolo si concentra sul metodo a campione ISF nel cervello, sia il principio che il metodo può essere applicati ad altri organi di modifica appropriata se necessario.
Microdialisi in primo luogo è stato impiegato nel 1960 e da allora è stato ampiamente utilizzato per raccogliere piccole molecole, tra cui gli aminoacidi o neurotrasmettitori nel cervello. Tuttavia, recenti disponibilità commerciale di microdialysis sonde con alto peso molecolare tagliato membrane (100 kDa-3 MDa) ha esteso la sua applicazione alle proteine relativamente più grandi in ISF come pure4,5,6 ,7. Gli studi utilizzando queste sonde ha portato all'individuazione quello proteine tau o α-synuclein che a lungo sono stati pensati per essere esclusivo citoplasmico presentano anche come fisiologicamente in ISF4,5,8.
Una delle difficoltà usando le sonde microdialisi con grande tagliata membrane (in genere oltre 1.000 kDa) è che sono più suscettibili alla perdita di liquidi dovuta alla pressione interna accumulata nelle sonde ultrafiltrazione. Microdialisi sonde utilizzate qui hanno una struttura unica per evitare questo problema. La pressione non sarà costruita a causa di questa struttura, così microdialisi con queste sonde devono essere operati in modalità "push-pull" utilizzando una pompa a siringa per irrorare le sonde (= push) e una pompa a rulli/peristaltica per raccogliere la venuta del dializzato dalla presa sonda (= pull) 9 (anche se ha bisogno di pompe sia push e pull, a causa della pressione annullando i fori di sfiato presenti le sonde, il sistema è tecnicamente solo guidato dalla pompa pull). Questo articolo inizia con la chirurgia stereotassica di un impianto di cannula guida e viene descritto come impostare le linee di microdialysis al fine di raccogliere ISF tramite sonde di microdialisi con 1.000 membrane di cut-off di kDa.

<table><tbody><tr><td>Il microcampionatore Univentor 820</td><td>Univentor</td><td>8303002</td><td>Collettore di frazioni refrigerato</td></tr><tr><td>Pompa a siringa</td><td>KD scientific</td><td>KDS-101</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a rulli</td><td>Microdialisi Eicom</td><td>ERP-10</td><td></td></tr><tr><td>Raturn Sistema autonomo</td><td>BASi</td><td>MD-1409</td><td>Sistema a movimento libero</td></tr><tr><td>Kit gabbia a doppia specie</td><td>BASi</td><td>CX-1600</td><td></td></tr><tr><td>Sonda per microdialisi AtmosLM (lunghezza dello stelo 8 mm, lunghezza della membrana 2 mm)</td><td>Eicom per microdialisi</td><td>PEP-8-02</td><td>La lunghezza dello stelo di una sonda, una guida, una sonda dumy e un adattatore stereotassico deve essere identica.</td></tr><tr><td>Guida per microdialisi (lunghezza stelo 8 mm)</td><td>Eicom microdialisi</td><td>PEG-8</td><td></td></tr><tr><td>Sonda fittizia per microdialisi (lunghezza stelo 8 mm)</td><td>Eicom microdialisi</td><td>PED-8</td><td></td></tr><tr><td>Vite ossea</td><td>BASi</td><td>MD-1310</td><td></td></tr><tr><td>Super bond C& B set</td><td>Sunmedical</td><td></td><td>Cemento dentale</td></tr><tr><td>Strumento stereotassico per piccoli animali con console di visualizzazione digitale</td><td>Kopf</td><td>Modello 940</td><td>Apparecchio stereotassico</td></tr><tr><td>Adattatore per topo e ratto neonatale</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>Barre auricolari standard e punte in gomma per topo Stoelting stereotassico</td><td></td><td>51648</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di albumina da siero bovino</td><td>Sigma</td><td>A7284-50ML</td><td>Soluzione BSA al 30%</td></tr><tr><td>Tubo FEP (70 cm)</td><td>Microdialisi Eicom</td><td>JF-10-70</td><td>Volume interno = 0,5 &micro; L/cm</td></tr><tr><td>Tubo in teflon (50 cm)</td><td>Microdialisi Eicom</td><td>JT-10-50</td><td>Volume interno = 0,08 &micro; L/cm</td></tr><tr><td>Tubo Byton</td><td>Microdialisi Eicom</td><td>JB-30</td><td></td></tr><tr><td>Adattatore Luer Stab Intramedic 23G</td><td>BD</td><td>427565</td><td>Ago con estremità smussata</td></tr><tr><td>Tubo a rullo</td><td>Microdialisi Eicom</td><td>RT-5S</td><td>Volume interno = 4 &micro; L</td></tr><tr><td>Dado cieco</td><td>Eicom microdialisi</td><td>AC-5</td><td></td></tr><tr><td>0,25 mL provetta per microcentrifuga con tappo</td><td>QSP</td><td>503-Q</td><td>Provette per collettore di frazioni</td></tr><tr><td>Adattatore sterotassico (lunghezza stelo 8 mm)</td><td>Eicom microdialisi</td><td>PESG-8</td><td></td></tr><tr><td>Ago di collegamento</td><td>Eicom microdialisi</td><td>RTJ</td><td></td></tr><tr><td>Collare per animali topi</td><td>BASi</td><td>MD-1365</td><td></td></tr><tr><td>Kit micromotore rotante ad alta velocità</td><td>FOREDOM</td><td>K.1070</td><td>Trapano</td></tr><tr><td>Picrotoxin</td><td>Sigma</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>Cacciavite per viti</td><td></td><td></td><td></td>ossee</tr><tr><td>Bisturi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotton fioc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tagliacapelli</td><td></td><td></td><td></td> chirurgico</tr></tbody></table>

in vivo sonde di microdialysis metodo di raccogliere grandi proteine extracellulari dal cervello liquido interstiziale con cut-off di alto peso molecolare

In Vivo Microdialysis Method to Collect Large Extracellular Proteins from Brain Interstitial Fluid with High-molecular Weight Cut-off Probes

Microdialisi in vivo sono una tecnica potente per raccogliere ISF da animali svegli, comportarsi liberamente basati su un principio di dialisi. Mentre microdialisi sono un metodo collaudato che misura relativamente piccole molecole, tra cui gli aminoacidi o neurotrasmettitori, è stato recentemente utilizzato per valutare anche dinamiche di più grandi molecole in ISF utilizzando sonde ad alto peso molecolare, tagliato fuori membrane. Al momento utilizzando tali sonde, microdialisi deve essere eseguito in una modalità push-pull per evitare pressione accumulata all'interno delle sonde. Questo articolo fornisce dettagliate protocolli tra cui chirurgia stereotassica e come impostare linee di microdialysis per raccogliere proteine da ISF. Durante microdialisi, i farmaci possono essere somministrati sistemica o mediante infusione diretta in ISF. Microdialisi inversa sono una tecnica per infondere direttamente composti in ISF. L'inclusione di farmaci nel buffer di aspersione di microdialysis permette loro di diffondere in ISF attraverso le sonde mentre simultaneamente raccolta ISF. Misurando la proteina tau come un esempio, l'autore Mostra come i suoi livelli sono alterati all'attività di stimolazione di un neurone di microdialysis inverso di picrotoxin. Vantaggi e limiti di microdialysis sono descritte con l'applicazione estesa combinando altri metodi in vivo .

Per stimolare o inibire l'attività neuronale in inversa microdialysis11,12,13, picrotoxin, antagonista del recettore GABAA o tetrodotossina, antagonista di Na+ sono stati usati. È stato dimostrato che rilascio di tau è stimolato dall'aumento dell'attività neuronale13,14. Coerente con queste osservazioni precedenti, q...

Microdialisi in vivo ha permesso la raccolta di molecole presenti nel fluido interstiziale cerebrale (ISF) da animali svegli, comportarsi liberamente. Al fine di analizzare molecole relativamente grandi in ISF, l'attuale articolo si concentra in particolare sul protocollo microdialysis utilizzando sonde ad alto peso molecolare, tagliata le membrane.

In Vivo Sonde di microdialysis metodo di raccogliere grandi proteine extracellulari dal cervello liquido interstiziale con cut-off di alto peso molecolare

In vivo microdialysis is a powerful technique to collect ISF from awake, freely-behaving animals based on a dialysis principle. While microdialysis is an ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sulle neuroscienze su come il trasporto del substrato di trasduzione del segnale e una clearance dei rifiuti si verificano negli spazi extracellulari cerebrali. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente il campionamento e la quantificazione di grandi molecole extracellulari nel fluido interstiziale o ISF di animali svegli che si muovono liberamente. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piedi, rimuovere i capelli dal cranio di un topo anestetizzato e utilizzare le barre dell'orecchio e un morsetto per fissare saldamente l'animale su un adattatore.Applicare un unguento agli occhi dell'animale e posizionare l'adattatore sull'apparato stereotassico. Utilizzare un bisturi per fare un'incisione cutanea sul cranio e attaccare un trapano al manipolatore del telaio stereotassico. Abbassare il trapano fino a toccare delicatamente lambda e ripristinare a zero la coordinata DV del trapano.Quindi, spostare il trapano in bregma per ripristinare le coordinate AP e ML su zero. Spostate il trapano dal bregma alla coordinata verticale. Abbassate il trapano al cranio e impostate nuovamente la coordinata DV su zero.Dopo aver ripetuto la procedura per una terza coordinata, praticare attentamente un foro di bava alla coordinata bersaglio, seguito da un secondo foro sul lato conlaterale dell'osso parietale. Inserire una vite ossea nel secondo foro e posizionare il pezzo di bloccaggio da un coperchio del tubo a microcentrifugo da 1,5 millilitri sul cranio in modo che i fori di bava siano all'interno del cerchio. Quindi, posizionare una cannula guida sul braccio più corto dell'adattatore stereotassico e fissare la cannula con un dado del cappuccio.Impostare il braccio più lungo dell'adattatore stereotassico sul morsetto dell'elettrodo e fissare il braccio sul manipolatore dell'apparato stereotassico. Ruotare l'assieme stereotassico DV sul braccio del manipolatore di 12 gradi e spostare la cannula guida nel foro di bava. Quindi, abbassare lentamente la cannula guida di 1,2 millimetri nel cervello.Aggiungere il cemento dentale alla corona fino a quando la parte metallica della cannula guida, la vite ossea e qualsiasi cranio esposto sono coperti e fissati e consentono al cemento di asciugarsi. Dopo 12-20 minuti, rimuovere l'adattatore stereotassico dal morsetto dell'elettrodo, rimuovere il dado del cappuccio e sostituire l'adattatore stereotassico con una sonda fittizia. Quindi, affinare il dado del cappuccio, rilasciare il mouse dall'apparato stereotassico e ospitare il mouse da solo in una singola gabbia.Prima di impostare la microdialisi, riempire una siringa usa e getta da un millilitro con acqua distillata e utilizzare un tubo viton per collegare la siringa all'uscita di una sonda di microdialisi. Coprire manualmente i fori di sfiato e deprimere delicatamente lo stantuffo della siringa per infondere acqua alla sonda. Verificare che l'acqua appaia nell'ingresso della sonda e che vi sia una perdita sulla superficie della membrana di microdialisi.Per attivare la sonda, immergere le membrane della sonda nel 70-100% di etanolo per due secondi, seguite da una seconda infusione di acqua distillata. Collegare un ago di connessione a una linea di ingresso e una linea di uscita e caricare una siringa monouso da tre millilitri con tampone perfusione preparato al momento. Collegare una siringa dotata di un ago con estremità smussata all'estremità di ingresso del tubo e utilizzare una pompa per siringhe per riempire l'intero tubo con tampone perfusione.Quando il tubo è pieno, sostituire l'ago di connessione tra le linee di ingresso e uscita con la sonda di microdialisi attivata e il dado del cappuccio e montare un tubo a rulli nei tubi di uscita su una pompa a rulli. Avviare la pompa della siringa a 10 microlitri al minuto e la pompa a rulli a 9,5-9,8 microlitri al minuto. Ora posiziona il collare intorno al collo dell'animale impiantato di cannula guida anestetizzato e rimuovi il dado del cappuccio e la sonda fittizia.Inserire lentamente la sonda di microdialisi attraverso la cannula guida e fissare il dado del cappuccio. Quindi, posizionare il mouse in una gabbia collegata a un sistema in movimento libero e collegare il mouse con il colletto. Dopo almeno un'ora, arrestare in sequenza la pompa a rulli e la pompa della siringa, riavviando le pompe con la pompa della siringa impostata al 20% più velocemente della pompa a rulli e posizionare l'estremità libera dei tubi di uscita su un raccoglitore di frazioni refrigerate per raccogliere l'ISF cerebrale.Una volta ottenuto il volume sperimentale appropriato, rimuovere la sonda e gestire il recupero del mouse come appena dimostrato. Coerentemente con le osservazioni precedenti, quando la picrotossine micromolare viene somministrata tramite microdialisi inversa, come dimostrato nei topi C57B6J svegli, si osserva un aumento dei livelli di tau endogeni interstiziali rispetto ai livelli misurati negli animali trattati con un controllo del veicolo. Oltre alle somministrazioni di farmaci, la microdialisi può essere combinata con altri metodi in vivo come la registrazione EEG o l'optogenetica per rispondere a domande aggiuntive su come l'attività neuronale influenza la concentrazione del substrato in ISF.

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Il monitoraggio dei livelli del neurotrasmettitore extracellulare nelle regioni cerebrali distinte di muoversi liberamente animali offre approfondimenti sul legame tra il rilascio dei neurotrasmettitori e comportamento. In microdialisi in vivo accoppiato con rilevazione elettrochimica fornisce anatomica eccellente e la risoluzione chimici e informazioni su come neurotrasmissione basale è alterato da manipolazioni farmacologiche o fisiologiche.

Survivable Chirurgia Stereotassica in roditori

Modulazione di hippocampally-dipendente memoria spaziale di lavoro diretto microiniezione intrahippocampal, accompagnato e seguito...

Insulina Microiniezione ippocampale e<em&gt; In vivo</emMicrodialisi&gt; Durante il test di memoria spaziale

Il video mostra il processo di utilizzo di una sonda di microdialisi per raccogliere proteine extracellulari dal liquido interstiziale (ISF) del cervello di un topo. Una sonda per microdialisi, dotata di una membrana semipermeabile cut-off ad alto peso molecolare, viene inserita nel cervello di un topo anestetizzato tramite una cannula guida impiantata. La sonda, collegata a pompe, consente a un tampone fisiologico di perfondere il tessuto cerebrale e mescolarsi con l'ISF. Le proteine nell'ISF...

Microdialisi del liquido interstiziale da un cervello di topo per isolare le proteine extracellulari

Un protocollo di estrazione proteina comune con tampone di urea / tiourea / SDS per il tessuto cerebrale umano e topi permette indentification delle proteine ​​da 2D-DIGE e la loro successiva caratterizzazione mediante mini 2DE immunoblotting. Questo metodo permette di ottenere risultati più riproducibili e affidabili da biopsie umane e modelli sperimentali.

Protein Consenso Brain-derived, estrazione protocollo per lo studio dei diritti dell&#39;uomo e murini Cervello Proteome Uso Sia 2D-DIGE e Mini 2DE Immunoblotting

Microdialisi è una tecnica comunemente usata nella ricerca delle neuroscienze. Pertanto sonde commerciali sono in gran demand.In questo lavoro un gruppo sonda è spiegato in dettaglio per costruire una concentrica, sonda di microdialisi affidabile, su misura per meno di $ 10.

Su ordine Microdialisi Probe design

Qui, è descritto un metodo per l'isolamento dei microvasi cerebrali di ratto e per la preparazione di campioni di membrana. Questo protocollo ha il chiaro vantaggio di produrre arricchito del microvessel campioni con proteina accettabile resa da singoli animali. Campioni possono quindi essere utilizzati per analisi di robusta proteina presso l'endotelio microvascolare cerebrale.

Un metodo semplice e riproducibile per preparare campioni di membrana da microvasi cerebrali appena isolati del ratto

Qui, descriviamo un metodo per microdialisi in vivo analizzare il rilascio del glutammato e aspartato nell'ippocampo ventrale dei ratti epilettici e non-epilettici, in combinazione con le registrazioni di EEG. Concentrazioni extracellulari di aspartato e glutammato possono essere correlate con le diverse fasi della malattia.

Microdialisi degli aminoacidi eccitanti durante le registrazioni di EEG in liberi di muoversi

Il protocollo qui fornisce un campionamento dinamico dettagliato in tempo reale del fluido extracellulare dall'ippocampo di ratti svegli utilizzando un sistema di microdialisi.

Raccolta dinamica in tempo reale di liquido extracellulare ippocampale da ratti coscienti utilizzando un sistema di microdialisi

In vivo, le comunicazioni intercellulari alla base di molte malattie del sistema nervoso centrale, come il glioblastoma (GBM), sono notoriamente difficili da misurare e caratterizzare. Qui descriviamo procedure di microperfusione cerebrale a flusso aperto (cOFM) che possono essere impiegate per campionare componenti del liquido interstiziale in un modello animale longitudinale della GBM.

Uso della microperfusione cerebrale a flusso aperto per la raccolta longitudinale di liquido interstiziale in un modello animale di glioblastoma

Registrazioni extracellulari di attività neuronale con sonde silicio nel ratto anestetizzato saranno descritti. Questa tecnica permette di ottenere informazioni attraverso aree cerebrali multiple da più di 100 neuroni contemporaneamente. Esso fornisce informazioni sulla risoluzione singola cellula neuronale dinamiche ensemble in più circuiti locali.

Registrazione Ensembles neuronali su larga scala con sonde di silicio sotto Rat anestetizzati

Impara la microdialisi in vivo con sonde ad alto peso molecolare per raccogliere grandi proteine dal liquido interstiziale cerebrale in topi svegli. Questo metodo consente di studiare il trasporto di substrati e la clearance dei rifiuti nel cervello.

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