Monitoraggio a lungo termine In Vivo della cellula infiammatoria dinamica all'interno della drosofila pupe

Sfruttando il potenziale di imaging a lungo termine di questo nuovo modello di pupa, insieme alla trattabilità genetica di Drosophila, questo metodo può aiutarci a rispondere a domande chiave nel campo della guarigione delle ferite e dell'immunità innata. Lo stadio pupale offre alcuni vantaggi distinti per l'imaging dal vivo rispetto ai modelli più tradizionali di guarigione delle ferite di Drosophila. Ad esempio, le pupe possono essere visualizzate per periodi di tempo molto più lunghi, è disponibile una maggiore area di tessuto per la manipolazione sperimentale e in questa fase sono presenti più emociti.

Inoltre, l'efficienza dell'inattivazione genica mediata dall'RNAi è notevolmente migliorata durante questi stadi pupali, consentendo a molti geni di essere abbattuti in modo specifico per i tessuti o nel tempo. Per allestire la raccolta delle pupe allestire fiale con 20 femmine vergini e 20 maschi. Quindi, 18 ore prima della sessione di imaging, raccogliere almeno 10 pre-pupe bianche di nuova formazione dalle fiale.

Per raccogliere una pupa, utilizzare una pinza o un pennello per vernice fine per rimuoverla dalla superficie interna della fiala e trasferirla con cura sul lato di una nuova fiala di mosca. Dopo che le pupe si sono sviluppate fino al punto temporale desiderato, trasferiscile su un pezzo di nastro biadesivo montato su un vetrino. Ora, sotto un microscopio da dissezione a campo chiaro, rimuovere con cura le pupe dai loro involucri.

Posiziona le pupe in modo che i loro lati ventrali siano saldamente attaccati al nastro. Praticare la prima incisione nella regione più anteriore del pupario utilizzando il forcipe. Assicurati che la custodia della pupa in quest'area sia cava e priva di tessuto pupale perché le pupe si saranno ristrette all'interno della custodia durante lo sviluppo precoce della pupa.

Quindi, strappare o tagliare con cura l'involucro della pupa in direzione anteriore o posteriore usando una pinza o microforbici fino a quando la pupa non è completamente libera dall'involucro marrone opaco e fragile. Attenzione, queste pupe sono molto fragili. Ora è fondamentale che le pinze e le microforbici non forino la superficie pupale durante questo passaggio.

Cerca di evitare di toccare la pupa stessa mentre rimuovi la custodia circostante. Ora monta le pupe non danneggiate in un piatto con fondo di vetro usando la colla eptanica. Per prima cosa depositare una linea di colla eptanica preparata da un'aliquota da 10 microlitri.

Quindi, dopo cinque secondi di asciugatura, utilizzare una pinza per trasferire con cura le pupe sezionate sulla colla. Durante l'apprendimento, allinea fino a cinque pupe. Con l'esperienza acquisita si può preparare di più.

Arrotolare le pupe usando una pinza per montare le pupe in modo che l'ala sia piatta sul vetro di copertura con la maggior parte della superficie dell'ala a diretto contatto con il vetro di copertura. Infine, per evitare la disidratazione, aggiungere un pezzo di carta da filtro assorbente imbevuta di acqua distillata sul lato del piatto con fondo in vetro. Quindi coprire il piatto e procedere con la procedura di ferita indotta dal laser.

Trasferire le pupe montate su un microscopio ad ampio campo dotato di un sistema di ablazione laser sintonizzabile. Sintonizzare il laser di ablazione ad azoto pulsato UV raffreddato ad aria sulla lunghezza d'onda desiderata utilizzando la cella di colorante appropriata. Per una carica ottimale, impostare la frequenza di ripetizione dell'impulso a 40 hertz.

Ora, utilizzando obiettivi 40 volte o 63 volte e campo chiaro, regolare i controlli del tavolino del microscopio per localizzare l'ala pupale della prima pupa da ferire. Concentrati sul piano dell'epitelio dell'ala pupale più vicino al vetrino. Allineare l'area da ferire con l'area target nota del laser di ablazione.

A tale scopo, sfruttare il puntatore a croce all'interno dell'oculare del microscopio. Quindi regola la potenza del laser regolando il vetrino dell'attenuatore di densità di energia nel microscopio. Sfrutta i fermi a scatto per rendere l'impostazione riproducibile.

Ora per fare una ferita attivare il laser di ablazione con un rapido clic di controllo manuale. Quindi verificare la comparsa della bolla d'aria transitoria nel sito di ablazione, che è normale con le ferite. Se la ferita non riesce, provare a variare il piano focale.

In alternativa, aumentare gradualmente la potenza del laser utilizzando la slitta attenuatrice fino a raggiungere le dimensioni della ferita desiderate. Dopo aver ferito i margini dell'ala pupale, trasferire rapidamente il piatto con fondo di vetro su un microscopio appropriato per l'imaging time lapse. Quindi aprire il software di acquisizione delle immagini appropriato.

Nel software accendere i laser appropriati e regolarne la potenza e il guadagno/offset per ottenere un segnale fluorescente sufficiente senza saturazione dei pixel. In generale, la potenza laser più bassa possibile nell'intervallo da cinque a 20% funziona meglio per ridurre al minimo il fotosbiancamento. Concentrati sull'intera ala pupale a basso ingrandimento o concentrati sulla ferita ad alto ingrandimento per studiare la riparazione della ferita.

Per catturare sia l'epitelio riparatore che il reclutamento delle cellule infiammatorie, impostare prima il microscopio per registrare uno z-stack utilizzando la regolazione fine della messa a fuoco sul pannello di controllo. Scansiona dall'epitelio ferito fino allo spazio extracellulare sottostante contenente gli emociti migratori. Quindi imposta il software per registrare le fette z attraverso l'ala pupale ogni tre micron o a intervalli ancora più stretti.

Per l'imaging time lapse, registrare z-stack almeno ogni 30 secondi per almeno un'ora. Quando si utilizzano le sonde fotoconvertibili per fotoconvertire ed etichettare selettivamente un sottoinsieme di cellule durante l'imaging, aprire i moduli appropriati all'interno del software di imaging per eseguire la conversione fotografica e attivare il laser a 405 nanometri. Quindi seleziona le celle da fotoconvertire all'interno del software FRAP utilizzando uno strumento di selezione.

Successivamente, imposta l'andamento temporale per la conversione delle foto in un singolo fotogramma di iterazione e imposta il laser a 405 nanometri al 20% di potenza laser. Quindi fare clic su Avvia l'esperimento per eseguire la conversione delle foto. Una volta completato, uscire dal modulo FRAP e tornare alla schermata di imaging originale.

Lì sintonizzare i laser sui fluorofori in uso e visualizzare le cellule fotoconvertite e non fotoconvertite utilizzando registrazioni time lapse. Le ali ferite delle pupe di Drosophila a 18 ore dalla formazione del pupario sono state visualizzate utilizzando la microscopia confocale time lapse. La lesione indotta dal laser all'epitelio dell'ala pupale ha stimolato una rapida migrazione delle cellule immunitarie innate di Drosophila chiamate emociti verso il sito della ferita.

Gli emociti sono stati marcati sia con un marcatore nucleare che con un marcatore citoplasmatico o citoscheletrico per consentire rispettivamente il tracciamento e una visione della loro morfologia. Il monitoraggio delle traiettorie nucleari degli emociti dimostra la complessa dinamica spazio-temporale della risposta infiammatoria. Entro 30 minuti dalla ferita, gli emociti situati più vicino al sito della lesione hanno iniziato la migrazione diretta verso la ferita.

Alla fine, gli emociti situati progressivamente più lontano dalla lesione iniziano a migrare verso la ferita. Utilizzando il fluoroforo Kaede fotoconvertibile, le sottopopolazioni di questi emociti alari migratori sono state marcate selettivamente. Questo metodo è stato utilizzato per dimostrare che gli emociti reclutati in una ferita iniziale sono temporaneamente desensibilizzati a una seconda ferita generata 90 minuti dopo.

Marcando l'E-caderina all'interno delle giunzioni cellulari aderenti con GFP, il bordo della ferita è facilmente identificabile e questo consente l'analisi delle dinamiche di guarigione della ferita. La maggior parte delle ferite inizia a riepitelizzarsi entro un'ora dalla lesione. Il bordo della ferita avanza verso l'interno e le ferite guariscono entro tre ore.

Una volta padroneggiata questa tecnica, è possibile preparare più pupe per l'imaging dal vivo in soli 10 minuti, ma mentre si tenta questa procedura è importante ricordare che una volta sezionate dal loro involucro pupale, le pupe di Drosophila sono estremamente vulnerabili ai danni e alla disidratazione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunità innata per collaborare con biologi computazionali e applicare modelli matematici più sofisticati per esplorare il comportamento dei segnali attrattivi delle ferite che sono responsabili del reclutamento delle cellule infiammatorie. E ancora più recentemente sono stati etichettati tipi di cellule alternative per seguire la loro risposta alle lesioni indotte dal laser e questo ha rivelato che le cellule degli adipociti, le cellule del corpo adiposo della Drosophila, rispondono anche alle ferite all'interno di questo sistema.