Name: Cultura e transfezione di cellule primarie di Zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Impara a isolare e trasfettare cellule primarie da embrioni e cervello adulto di Danio rerio. Questo protocollo consente l'imaging cellulare in vivo con alta risoluzione per studiare le dinamiche intercellulari.

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Ringraziamo T. Fritsch, A. Wolf-Asseburg, I. Linde e S.-M. Tokarski per eccellente cura degli animali e supporto tecnico. Siamo grati a tutti i membri del laboratorio Köster per discussioni intense e utili. Noi riconosciamo con gratitudine il finanziamento da parte del Deutsche Forschungsgemeinschaft (KO 1949/5-1) e lo stato federale della Bassa Sassonia, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).

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<li>Badakov, R., Jaźwińska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transfection+of+primary+zebrafish+fibroblasts+by+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient transfection of primary zebrafish fibroblasts by nucleofection.</a> Cytotechnology. 51, 105-110 (2006).</li>
<li>Senghaas, N., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+transfecting+zebrafish+PAC2+fibroblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culturing and transfecting zebrafish PAC2 fibroblast cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).</li>
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<li>Barden, J. A., Miki, M., Hambly, B. D., Dos Remedios, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+phalloidin+and+nucleotide-binding+sites+on+actin%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Localization of the phalloidin and nucleotide-binding sites on actin.</a> European Journal of Biochemistry. 162 (3), 583-588 (1987).</li>
<li>Kapuscinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAPI%3A+a+DNA-specific+fluorescent+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">DAPI: a DNA-specific fluorescent probe.</a> Biotechnic & Histochemistry. 70 (5), 220-233 (1995).</li>
<li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+organs+from+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of organs from the adult zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. 37, E1717(2010).</li>
<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li>
<li>Stornaiuolo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KDEL+and+KKXX+retrieval+signals+appended+to+the+same+reporter+protein+determine+different+trafficking+between+endoplasmic+reticulum%2C+intermediate+compartment%2C+and+Golgi+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">KDEL and KKXX retrieval signals appended to the same reporter protein determine different trafficking between endoplasmic reticulum, intermediate compartment, and Golgi complex.</a> Molecular Biology of the Cell. 14, 889-902 (2003).</li>
<li>Lithgow, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+proteins+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Targeting of proteins to mitochondria.</a> FEBS Letters. 476, 22-26 (2000).</li>
<li>Nagai, T., Ibata, K., Park, E. S., Kubota, M., Mikoshiba, K., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nature Biotechnology. 20, 87-90 (2002).</li>
<li>Sassen, W. A., Lehne, F., Russo, G., Wargenau, S., Dübel, S., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+zebrafish+primary+cell+culture+for+transfection+and+live+cellular+and+subcellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryonic zebrafish primary cell culture for transfection and live cellular and subcellular imaging.</a> Developmental Biology. 430, 18-31 (2017).</li>
<li>Horesh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doublecortin%2C+a+stabilizer+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Doublecortin, a stabilizer of microtubules.</a> Human Molecular Genetics. 8, 1599-1610 (1999).</li>
<li>Shaner, N. C., Campbell, R. E., Steinbach, P. A., Giepmans, B. N. G., Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22, 1567-1572 (2004).</li>
<li>Distel, M., Hocking, J. C., Volkmann, K., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+centrosome+neither+persistently+leads+migration+nor+determines+the+site+of+axonogenesis+in+migrating+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The centrosome neither persistently leads migration nor determines the site of axonogenesis in migrating neurons in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 191, 875-890 (2010).</li>
<li>Matsuda, T., Miyawaki, A., Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+protein+dynamics+inside+cells+using+a+rationally+designed+photoconvertible+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of protein dynamics inside cells using a rationally designed photoconvertible protein.</a> Nature Methods. 5, 339-345 (2008).</li>
<li>Archer, B. T., Ozçelik, T., Jahn, R., Francke, U., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+and+chromosomal+localizations+of+two+human+genes+encoding+synaptobrevins+1+and+2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structures and chromosomal localizations of two human genes encoding synaptobrevins 1 and 2.</a> Journal of Biological Chemistry. 265, 17267-17273 (1990).</li>
<li>Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+the+environmental+sensitivity+of+yellow+fluorescent+protein.+Mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+monomeric+green+fluorescent+protein+derived+from+Branchiostoma+lanceolatum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum.</a> Nature Methods. 10, 407-409 (2013).</li>
<li>Campbell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monomeric+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Procedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A monomeric red fluorescent protein.</a> Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 7877-7882 (2002).</li>
<li>Peri, F., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuronal+degradation+by+microglia+reveals+a+role+for+v0-ATPase+a1+in+phagosomal+fusion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo.</a> Cell. 133, 916-927 (2008).</li>
<li>Godinho, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+amacrine+cell+neurites+to+appropriate+synaptic+laminae+in+the+developing+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina.</a> Development. 132, 5069-5079 (2005).</li>
<li>Jusuf, P. R., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ptf1a+is+expressed+transiently+in+all+types+of+amacrine+cells+in+the+embryonic+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Ptf1a is expressed transiently in all types of amacrine cells in the embryonic zebrafish retina.</a> Neural Development. 4, 34(2009).</li>
<li>Kani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proneural+gene-linked+neurogenesis+in+zebrafish+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Proneural gene-linked neurogenesis in zebrafish cerebellum.</a> Developmental Biology. 343, 1-17 (2010).</li>
<li>Distel, M., Wullimann, M. F., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Gal4+genetics+for+permanent+gene+expression+mapping+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Procedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish.</a> Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13365-13370 (2009).</li>
<li>Choorapoikayil, S., Overvoorde, J., den Hertog, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+cell+lines+from+zebrafish+embryos+and+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Deriving cell lines from zebrafish embryos and tumors.</a> Zebrafish. 10, 316-332 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui, presentiamo due differenti protocolli di cellule di coltura primaria da 2 embrioni di zebrafish dpf o cervello adulto zebrafish.
La preparazione di colture cellulari primarie da 2 dpf zebrafish è relativamente facile da eseguire per qualcuno con esperienza in tecniche di coltura cellulare di base. Tuttavia, per ottenere risultati buoni e riproducibili, è cruciale un numero sufficiente di embrioni come materiale di partenza (100 è il minimo). Durante la raccolta degli embrioni, tutte le po...

Il pesce zebra (Danio rerio, d. rerio) è un modello popolare vertebrato per numerosi campi della ricerca biomedica di base1. Embrioni di zebrafish ex uterosi sviluppano rapidamente, sono trasparenti e si adattano al microscopio, fornendo così eccellenti prerequisiti per lo studio di sviluppo vertebrato in un organismo vivente. A causa della genetica trattabilità di zebrafish2, molte linee di reporter transgenici stabile con espressione di tipo specifico delle cellule di vari marcatori fluorescenti sono state stabilite consentendo l'osservazione di popolazioni cellulari specifici. La comunità di zebrafish offre un'ampia varietà di cosiddette linee Gal4-driver che trasportano un transgene esprimendo il Kal4TA4 sintetico (o il GalFF di KalTA3-equivalente) gene con il dominio di legame del DNA, Gal4 di lievito fusa per attivazione trascrizionale virale domini sotto il controllo di rinforzatori di tipo specifico di cellule. Queste linee di driver sono incrociate alle linee dell'effettore che trasportano transgeni che consiste di una sequenza d'attivazione a Monte definita (UAS) fusa a un gene reporter. La proteina Kal4TA4 si lega all'elemento UAS, attivando così l'espressione di tipo selettivo delle cellule del reporter gene3,4. Questo approccio consente studi altamente diversificati combinatoriali di quasi tutti gli elementi disponibili enhancer e reporter in animali transgenici doppio.
Tuttavia, approfondita formazione immagine dal vivo con focus su singole celle o del loro contenuto subcellulare è limitata in un embrione intero e in costante evoluzione. Per rispondere a domande biologiche cellulari specifici con risoluzione più alta, l'uso di colture cellulari è spesso preferibile. Alcune linee di cellule di zebrafish esistono, ma sono considerati come fortemente selezionato5,6,7 e la loro propagazione è spesso richiede molto tempo. Inoltre, tutte le linee cellulari disponibili sono dei fibroblasti derivati, limitando esperimenti utilizzando colture cellulari per un tipo di cellule. Quindi, abbiamo stabilito un protocollo sia efficiente e facile da usare per preparare cellule primarie direttamente da embrioni di zebrafish e cervello di zebrafish adulto, insieme ad approcci per aumentare la longevità della cultura e di ampliare la diversità di coltivato tipi di cellule. Inoltre, presentiamo una procedura per transfect cellule embrionali primari con costrutti di espressione per i marcatori fluorescenti organello. Così, cellulari morfologie e strutture subcellulari possono essere analizzati con elevata risoluzione spaziale e temporale in tipi distinti delle cellule che mantengono le loro caratteristiche chiave.

<table><tbody><tr><td>Fish lines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AB (wild-type)</td><td></td><td></td><td>stabilito da Streisinger e colleghi, disponibile presso la</td></tr> <tr>linea transgenica stabile <td>Tg(ptf1a:eGFP)jh1</td><td></td><td></td><td>in cui l'enhancer del gene zebrafish ptf1a guida l'espressione della proteina fluorescente EGFP (Parsons et al., 2007)</td></tr><tr><td>Tg(XITubb:DsRed)zf148</td><td></td><td></td><td>linea transgenica stabile in cui il promotore della beta tubulina Xenopus neural-specific guida l'espressione della proteina fluorescente DsRed&nbsp; (Peri e N&uuml; sslein-Volhard, 2008)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>modello 5804 R</td></tr><tr><td>ChemiDoc MP sistema di imaging</td><td>BioRad</td><td></td><td>modello XRS+, utilizzato per acquisire immagini in bianco e nero di piastre di Petri contenenti 1 embrione da</td></tr><tr><td>microscopio a scansione laser confocale</td> Leica <td>microsystems</td><td></td><td>modello SP8, dotato di 28 &deg; C e un microscopio epifluorescente obiettivo 63X</td></tr><tr><td></td> Leica <td>microsystems</td><td></td><td>modello DM5500B, dotato di 28 &deg; C e un obiettivo 40X</td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell con estensore di capacità</td><td>BioRad</td><td>1652661</td><td>dispositivo di elettroporazione</td></tr><tr><td>Agitatore orizzontale</td><td>GFL</td><td></td><td>modello 3011</td></tr><tr><td>incubatore per colture cellulari (28 ° ... C)</td><td>Incubatrice modello</td> <td>Memmert</td><td></td> I</tr><tr><td>incubatrice per embrioni (28 &deg; C)</td><td>Microscopio ottico Heraeus</td><td></td><td>tipo B6120</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td></td><td>modello TELAVAL 31</td></tr><tr><td>micro pipette Banco</td> da lavoro sterile <td>Gilson</td><td></td><td></td></tr> Bio <tr><td></td><td>Base</td><td></td><td>con flusso laminare e pinzette a luce UV</td></tr><tr><td></td><td>Dumont</td><td></td><td>Style 5, rotatore verticale per tubi in acciaio inox</td></tr><tr><td></td><td>Labinco B.V.</td><td></td><td>modello LD-79</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Lab Software</td><td>BioRad</td><td></td><td>per il sistema di imaging ChemiDoc MP di BioRad</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Salute</td><td></td><td>utilizzato per contare 1 embrione dpf applicando lo strumento Conta particelle alle rispettive immagini in bianco e nero; Rasband, W.S., ImageJ, Istituti Nazionali di Sanità degli Stati Uniti, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/. (1997-2016).</td></tr><tr><td>LAS X</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>per microscopi confocali ed epifluorescenti di Leica Microsystems</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Plasmidi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCS-DCX-tdTomato</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 1599</td><td>basato sulla dorsale pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-eGFP</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 7</td><td>basato sulla dorsale pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-H2B-mseCFP</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 2379</td><td>basato sulla dorsale pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-mClover</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 3865</td><td>basato sulla dorsale pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-MitoTag-YFP</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 2199</td><td>basato sulla dorsale pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-ss-RFP-KDEL</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 4330</td><td>basato sulla dorsale pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-VAMP1-mCitrine</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 2291</td><td>basato sulla dorsale pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pSK-UAS:mCherry</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 1062</td><td>basato sulla spina dorsale pBluescript di Stratagene</td></tr><tr><td>I numeri dei plasmidi si riferiscono alle voci del database del K&ouml; Ster. I plasmidi sono disponibili su richiesta.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Articoli in plastica e vetro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Filtro per celle Falcon (40 &; m)</td><td>FALCON</td><td>REF 352340</td><td>distribuito da BD Bioscience, utilizzato come " guadino" immergere gli embrioni deyolked nell'etanolo e trasferirli rapidamente in un terreno di coltura cellulare fresco</td></tr><tr><td>Provette di reazione da 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72690550</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 24 pozzetti</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>provetta falconica da 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 96 pozzetti</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924.005</td><td></td></tr><tr><td>EasyStrainer (40 &; micro; m)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>542 040</td><td>con fessure di sfiato; utilizzato per filtrare le cellule dopo la cuvetta per elettroporazione per dissociazione mediata da collagenasi</td></tr><tr><td>(0,4 cm)</td><td>Kisker</td><td>4905022</td><td></td></tr><tr><td>vetrini coprioggetti</td><td>Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH</td><td>1051201</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Thermo Fisher Scientific (Menzel Gl&auml; ser)</td><td>631-0845</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer chamber</td><td>Henneberg-Sander GmbH</td><td>9020-01</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur (plastica; 3 mL)</td><td>A. Hartenstein</td><td>PP05</td><td></td></tr><tr><td>Piastre Petri (plastica; diametro 10 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>821473</td><td>per embrioni di zebrafish puntali</td></tr><tr>per<td>pipette</td><td>Sarstedt</td><td>Blue (1000 &micro; l): 70762; Giallo (200 &micro; l): 70760002; Bianco (10 & micro; L): 701116</td><td></td></tr><tr><td>piastre sterili per colture cellulari (plastica; diametro 3 cm)</td>Piastre sterili per colture cellulari <td>TPP Techno Plastic Products AG</td><td>93040</td><td></td></tr><tr><td>(plastica; diametro 6 cm)</td>Piastre di Petri sterili <td>Sarstedt</td><td>72690550</td><td></td></tr><tr><td>(plastica; diametro 10 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td>per dissezione cerebrale</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Chemicals and Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodium chloride</td><td>Roth</td><td>0601.1</td><td></td></tr><tr><td>4 % paraformaldeide in 1x PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>nitrato di calcio tetraidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>etanolo p.a. 100%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46139</td><td></td></tr><tr><td>capra &alfa;-topo IgG (Fc specifico) FITC coniugato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31547</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Roth</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>grasso per alto vuoto</td><td>DOW CORNING</td><td>3826-50</td><td>grasso siliconico utilizzato per piatti con fondo in vetro autocostruiti</td></tr><tr><td>solfato di magnesio eptaidrato</td><td>Merck</td><td>105886</td><td></td></tr><tr><td>blu di metilene</td><td>Serva</td><td>29198.01</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tubulina monoclonale, anticorpo acetilato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td><td></td></tr><tr><td>Aqua-Poly/Mount (mezzo di montaggio)</td><td>Polyscience</td><td>18606</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lisina</td><td>Biochrom</td><td>L 7240</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di potassio</td><td>Merck</td><td>104938</td><td></td></tr><tr><td>latte scremato</td><td>Roth</td><td>68514-61-4</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-X Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T7471</td><td></td></tr><tr><td>Tricaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>Sinonimo: Etile 3-amminobenzoato metanosolfonato</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BioRad</td><td>1610407</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Gibco di Life Technologies</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Enzimi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>collagenasi (Tipo 2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101015</td><td>sciogliere la polvere in un terreno di coltura cellulare (8 mg/mL) e filtrare sterile-la soluzione, conservare le aliquote a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>pronasi (da Streptomyces griseus)</td><td>Roche</td><td>11459643001</td><td>distribuito da Sigma-Aldrich, si scioglie in Danieau al 30% (10 mg/mL) e conserva aliquote a -20 gradi; C</td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Medium e soluzioni per colture cellulari</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS (soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco)</td><td>Gibco di Life Technologies</td><td>14190-169</td><td>distribuito da Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Terreno CO2-indipendente</td><td>Gibco di Life Technologies</td><td>18045054</td><td>distribuito da Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>siero bovino filtrato (FBS)</td><td>PAN-Biotech</td><td></td><td>singolo lotto di</td></tr><tr><td>glutammina 100x</td><td>Gibco di Life Technologies</td><td>25030081</td><td>distribuito da Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Terreno L-15 di Leibovitz</td><td>Gibco di Life Tecnologie</td><td>11415049</td><td>distribuito da Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>PenStrep (10.000 U/mL)</td><td>Gibco da Life Technologies</td><td>15140148</td><td>distribuito da Thermo Fisher Scientific</td></tr></tbody></table>

cultura e transfezione di cellule primarie di zebrafish

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Embrioni di zebrafish sono trasparenti e sviluppano rapidamente di fuori della madre, consentendo in tal modo eccellente in vivo imaging dei processi biologici dinamici in un vertebrato intatto e in via di sviluppo. Tuttavia, le immagini dettagliate delle morfologie di tipi distinti delle cellule e strutture subcellulari sono limitato in tutto monta. Quindi, abbiamo stabilito un protocollo efficiente e facile da usare per coltura primaria di cellule vive da embrioni di zebrafish e tessuto adulto.
In breve, di 2 embrioni di zebrafish dpf sono dechorionated, deyolked, sterilizzato e dissociato di singole cellule con collagenasi. Dopo una fase di filtrazione, cellule primarie sono piastrate su piatti di vetro inferiore e coltivate per diversi giorni. Colture fresche, per quanto a lungo termine differenziata quelli, possono essere utilizzati per studi di imaging confocale ad alta risoluzione. La cultura contiene diversi tipi di cellule, con miociti striati e neuroni essendo prominente sul rivestimento di poli-L-lisina. A label specificamente le strutture subcellulari di proteine marker fluorescente, abbiamo anche stabilito un protocollo di elettroporazione che permette la transfezione del DNA del plasmide in tipi differenti delle cellule, compresi i neuroni. Così, in presenza di operatore stimoli definiti, comportamento delle cellule complesse e dinamiche intracellulare delle cellule zebrafish primario può essere valutata con elevata risoluzione spaziale e temporale. Inoltre, utilizzando il cervello adulto zebrafish, dimostriamo che la tecnica descritta dissociazione, come pure le condizioni di coltura di base, funzionano anche per il tessuto di zebrafish adulto.

Figura 1 Mostra un'immagine di luce trasmessa di una cultura tipica derivata da embrioni di tipo selvaggio con miociti striati e mazzi delle cellule del neurone-come essere più abbondante. Per identificare più facilmente alcuni tipi di cellule, una linea transgenica con espressione di tipo specifico delle cellule di una proteina fluorescente può essere utilizzato (Figura 1 H).
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Vi presentiamo un protocollo efficiente e facile da usare per la preparazione di colture cellulari primarie di embrioni di zebrafish per la transfezione e live cell imaging nonché un protocollo per preparare cellule primarie dal cervello di zebrafish adulto.

Cultura e transfezione di cellule primarie di Zebrafish

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Questo metodo fornisce alla comunità del pesce zebra uno strumento per l'analisi delle dinamiche intercellulari con una risoluzione irraggiungibile in vivo. E permette anche di compensare la mancanza di linee cellulari di zebrafish. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si isolano e si trasfettano quelle cellule primarie direttamente dal tessuto originale, in modo da non dover mantenere le linee cellulari.Per iniziare il protocollo, prepara gli embrioni di zebrafish due giorni dopo la fecondazione, o dpf. Il primo giorno sono stati allestiti diversi incroci del ceppo di pesce zebra preferito. Il secondo giorno accoppia il pesce e raccogli le uova subito dopo la deposizione delle uova in una capsula di Petri di plastica di 10 centimetri.Rimuovere le uova morte e contaminate con una pipetta di plastica Pasteur. Lavare le uova una volta con Danieau 30% con 0,0001% peso per volume di blu di metilene. Quindi sostituire il terreno con Danieau fresco al 30% senza blu di metilene e incubare le uova per una notte a 28 gradi Celsius.Il terzo giorno rimuovere gli embrioni morti e contaminati e scambiare il terreno con Danieau al 30%, quindi incubare gli embrioni per una notte a 28 g

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Il video dimostra un metodo per coltivare cellule gangliari retiniche primarie da embrioni di pesce zebra. Gli embrioni in fase iniziale vengono sottoposti a dissezione per isolare gli occhi, che vengono successivamente dissociati meccanicamente in una sospensione di cellule gangliari retiniche. Questa sospensione cellulare viene coltivata su vetrini coprioggetti rivestiti con proteine adesive per facilitare lo sviluppo degli assoni.

Generazione di colture cellulari primarie di ganglio retinico da embrioni di zebrafish

Qui forniamo un metodo riproducibile per esaminare neurogenesi adulta usando un test neurosfere derivato dal cervello intero o sia dal telencefalica, tectal o nelle regioni del cervelletto del cervello zebrafish adulto. Inoltre, si descrive la procedura per manipolare l'espressione genica in neurosfere zebrafish.

Isolamento e la coltura di Neurosfere Zebrafish adulti Brain-derived

Questo protocollo descrive un metodo per isolare singole cellule da embrioni di zebrafish, arricchimento per cellule di interesse, catturare cellule di zebrafish in sistemi multiplex a singola cellula basati su microfluidica e valutare l'espressione genica da singole cellule.

Isolamento e caratterizzazione di singole cellule da embrioni di zebrafish

la rigenerazione della retina zebrafish è stato per lo più studiata utilizzando retine fissi. Tuttavia, i processi dinamici come la migrazione nucleare interkinetic si verificano durante la risposta rigenerativa e richiedono live-cell imaging per studiare i meccanismi alla base. Qui, descriviamo condizioni di coltura e di imaging per monitorare Interkinetic migrazione nucleare (INM) in tempo reale utilizzando la microscopia multiphoton.

Cultura di adulti transgenici Zebrafish retina espianti per live-cell imaging per Multiphoton Microscopia

Qui, descriviamo modelli zebrafish xenotrapianto utilizzando due differenti siti di iniezione, vale a dire, lo spazio perivitellino e condotto di Cuvier, per studiare il comportamento invasivo e per valutare l'intravasation e stravaso potenziale delle cellule umane di cancro al seno, rispettivamente.

Invasiva comportamento delle cellule cancro al seno umano in Zebrafish embrionali

Qui vi mostriamo il processo di creazione di una linea di zebrafish del reporter di tensione elettrica cellulare per visualizzare lo sviluppo embrionale, il movimento, e cellule di pesce del tumore in vivo.

Visualizzazione dell'attività elettrica cellulare in Zebrafish embrioni in anticipo e tumori

Le manipolazioni embriologiche come l'estirpazione e il trapianto di cellule sono strumenti importanti per studiare lo sviluppo precoce. Questo protocollo descrive un dispositivo di trapianto semplice ed efficace per eseguire queste manipolazioni in embrioni di zebrafish.

Un dispositivo di trapianto semplice ed efficace per embrioni di zebrafish

Questo lavoro descrive un protocollo per il sistema modulare di transgenesi Tol2, un metodo di clonazione basato su gateway per creare e iniettare costrutti transgenici in embrioni di zebrafish.

Il sistema Zebrafish Tol2: un approccio di transgenesi modulare e flessibile basato su gateway

Qui, presentiamo un protocollo di coltura 3D efficace, facile e veloce per la formazione di sferoidi di due linee cellulari di zebrafish (Danio rerio): ZEM2S (embrione) e ZFL (epatocita normale).

Un metodo di coltura 3D di sferoidi di linee cellulari embrionali e epatiche di zebrafish

Qui presentiamo un protocollo per trapiantare cellule con un'elevata risoluzione spaziale e temporale in embrioni e larve di zebrafish in qualsiasi fase tra almeno 1 e 7 giorni dopo la fecondazione.

Trapianto di cellule ad alta risoluzione in zebrafish embrionale e larvale

Impara a isolare e trasfettare cellule primarie da embrioni e cervello adulto di Danio rerio. Questo protocollo consente l'imaging cellulare in vivo con alta risoluzione per studiare le dinamiche intercellulari.

Cultura e transfezione di cellule primarie di Zebrafish

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