In Vitro Allevamento di api solitarie: uno strumento per valutare i fattori di rischio larvale

Le specie di api solitarie rappresentano il gruppo più diversificato di api del pianeta, ma può essere abbastanza difficile allevare con successo le larve in condizioni altamente controllate. Abbiamo creato un metodo per la coltura in vitro di specie di api solitarie, che ci consente di isolare e misurare i fattori di rischio associati ai loro simbionti microbici. Tra alcune specie di api solitarie che nidificano nello stelo, è fondamentale che le tecniche di coltura si rivolgano alle giovani larve e ai loro simbionti microbici nati dal polline.

Qui abbiamo messo in luce gli effetti principali e interattivi di molteplici fattori di stress, permettendoci di discernere se i fattori di stress agiscono in gran parte da soli o di concerto. A dimostrare la procedura saranno Molly Bidwell e Prarthana Dharampal, entrambe del mio laboratorio. Usando un bisturi sterilizzato, seziona le canne di nidificazione di Osmia appena tappate.

Dividere le canne in due parti nel senso della lunghezza per esporre le singole camere. I nidi contengono in genere da 8 a 14 camere con un uovo per camera. Identificare le uova maschili utilizzando il metodo standard.

In questo esperimento vengono utilizzate solo uova maschili a causa del pregiudizio sessuale nelle dimensioni della fornitura di polline. Le disposizioni maschili sono in genere più piccole di quelle femminili. Quindi, con uno strumento sterilizzato, rimuovere ogni riserva di polline insieme all'uovo associato e metterli in una barca di pesatura pulita.

Nella barca di pesatura, separare delicatamente l'uovo dalla provvista. Quindi pesare separatamente la provvista di polline e l'uovo. Lavora rapidamente con le uova di Osmia per ridurre al minimo il loro tempo lontano dal polline.

Per i preparati per la fornitura di polline ospite, ispezionare prima visivamente il polline della pianta ospite raccolto dalla madre scavato dalle camere di nidificazione alla ricerca di parassiti. Quindi, per ridurre qualsiasi potenziale pregiudizio materno, combinare le disposizioni di polline in un'unica massa e mescolarle utilizzando un ago sterilizzato. Successivamente, dividere il polline dell'ospite in nuove disposizioni di massa standard.

Per preparare le disposizioni di polline delle piante non ospiti, polverizzare il polline raccolto dalle api mellifere acquistato in commercio in una polvere fine utilizzando un mulino per ossa da laboratorio standard. Quindi, in base al contenuto di umidità delle riserve di polline dell'ospite, idratare la polvere di polline utilizzando una soluzione di zucchero sterilizzata al 40%. Mescola questo fino a ottenere una consistenza simile a un impasto.

Quindi fai disposizioni per il polline non ospite che abbiano lo stesso peso delle provviste raccolte dalla madre. Per la piastra di trattamento, rivestire i singoli pozzetti di una piastra di coltura a 48 pozzetti con tazze di latta autoclavate. Preparare piastre separate per i gruppi di trattamento e di controllo.

Quindi, utilizzando una pinza sterile, svasare delicatamente il bordo superiore delle coppette in modo che possano accogliere l'apporto di polline. Quindi, caricare le singole provviste di polline nelle tazze di latta. Ora all'interno di ogni massa di polline fare una depressione posizionata centralmente usando un bastoncino di legno sterile.

Usa un nuovo bastoncino per ogni fornitura di polline. Nella depressione, aggiungere i volumi appropriati di soluzione di trattamento come fungicida e acqua sterile per i controlli. Dopo ogni aggiunta, pizzicare la depressione con una pinza sterile pulita.

Per iniziare, caricare bene ogni piastra di trattamento con un uovo maschio selezionato casualmente. Posizionalo sopra la fornitura di polline usando un pennello fine pulito. Una volta posizionate le uova, fissare il coperchio sul piatto con del nastro adesivo agli angoli.

Quindi, posizionare ogni piatto preparato in un'incubatrice mantenuta a temperatura ambiente. Include una piastra a sei pozzetti caricata con acqua sterile per evitare l'essiccazione. Lasciare indisturbate le piastre all'interno dell'incubatrice.

Controllare quotidianamente la piastra al microscopio da dissezione senza rimuovere il coperchio. Se le larve sono vive, si muoveranno. Se non viene rilevato alcun movimento, gettare la tazza di latta contenente le larve morte e la riserva di polline rimanente.

Quando una larva raggiunge lo stadio prepupale, rimuovila dalla tazza di latta e usa una spazzola per pulire il bozzolo di seta. Quindi, utilizzando un microscopio da dissezione, tagliare con cura il bozzolo di seta ed estrarre la prepupa utilizzando una pinza dal peso piuma. Maneggiare delicatamente la prepupa per evitare danni al suo corpo.

Ora registra la massa della prepupa e il tempo di sviluppo dall'uovo allo stadio prepupale. La fitness larvale è stata quantificata utilizzando il tempo di sviluppo larvale e la biomassa prepupale. C'era una significativa correlazione negativa tra il tempo di sviluppo larvale e la biomassa prepupale tra i gruppi trattati con fungicidi e non trattati.

Sebbene vi fosse una significativa correlazione negativa per le larve allevate con polline non ospite, tale relazione non è stata osservata per le larve allevate con polline ospite. La fonte di polline ha avuto un effetto principale significativo sulla fitness delle api. Quando allevati su polline non ospite, il tempo di sviluppo larvale è aumentato in modo significativo, mentre la biomassa prepupale è diminuita significativamente sia tra i gruppi trattati con fungicidi che tra quelli non trattati rispetto alle larve allevate con polline ospite.

L'esposizione ai fungicidi non ha avuto un effetto principale significativo sulla forma fisica. Non c'era alcuna differenza statisticamente significativa nel tempo di sviluppo e nella biomassa prepupale per i trattamenti allevati su polline ospite e non ospite tra i gruppi trattati con fungicidi e non trattati. Non c'è stato alcun effetto interattivo significativo dell'esposizione ai fungicidi e della fonte di polline sul tempo di sviluppo larvale e sulla biomassa prepupale.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come allevare con successo larve di api solitarie in condizioni in vitro. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per allevare le api in condizioni di vitro, dall'uovo allo stadio di pupa, causando una mortalità minima dovuta allo stress da manipolazione. Durante l'utilizzo di questa procedura, è importante ricordarsi di utilizzare uova o larve molto giovani.

Ciò garantisce che le larve vengano allevate quasi interamente sulla base della manipolazione intenzionale dei trattamenti dietetici. Questo protocollo può essere esteso a diverse altre specie di api e vespe solitarie e può essere facilmente modificato per testare gli effetti principali e interattivi di molteplici fattori di rischio che influiscono sulla salute degli impollinatori. Fornendo un mezzo per la coltura in vitro di larve di api solitarie, questa tecnica può aiutare a identificare fattori di rischio precedentemente sconosciuti tra le popolazioni di api vulnerabili.

Ad esempio, alcuni dei loro esperimenti basati su questo protocollo possono aiutare ad accertare il ruolo del microbioma pollinico nel conferire vari gradi di resistenza ai fattori di stress xenobiotici. Essendo una tecnica accessibile ed economica, questo protocollo rappresenta uno strumento versatile per la verifica di ipotesi che può essere facilmente modificato dai ricercatori per raggiungere i propri obiettivi di ricerca.