Name: Modello di ratto di demielinizzazione corticale cerebrale diffusa indotta da uniniezione intracerebrale di citochine pro-infiammatorie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Impara a generare demielinizzazione corticale diffusa in ratti Dark Agouti mediante immunizzazione subclinica contro MOG e iniezione intracerebrale di citochine. Questo metodo consente di studiare i meccanismi della sclerosi multipla progressiva senza lesioni della sostanza bianca.

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Gli autori desiderano ringraziare tutto il personale dell'Istituto di ricerca biomedica dell'Università di Medicina di Graz per il loro aiuto e la loro cooperazione, così come Christopher John Wrighton per la correzione di bozze del manoscritto.

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dalle autorità locali (Bundesministerium für Wissenschaft und Forschung (Ministero austriaco della scienza e della ricerca); Numero di licenza: 66.010/0132-WF/V/3b/2014). I ratti MASCHI ADULTI DI DA (10 - 12 settimane di età) sono stati alloggiati in un ciclo luce/buio di 12/12 ore con libero accesso a cibo e acqua.
1. Preparazione del materiale NOTA: L'intervento chirurgico è condotto in condizioni asettiche. Prima di iniziare, assicurarsi che tutti gli strumenti chirurgici, comprese le punte del trapano, siano puliti con un disinfettante appropriato.
<ol><li>Preparare una miscela anestetica: 0,02 mg/mL di fentanil, 0,4 mg/mL di midazolam e 0,2 mg/mL di medetomidina (concentrazioni finali nella miscela). NOTA: Vedere la rispettiva sezione Discussione per gli anestetici alternativi.</li>
	<li>Preparare una miscela di antidoto: 0,07 mg/mL di flumazenil e 0,42 mg/mL di atipamezolo (concentrazioni finali nella miscela).</li>
	<li>Assemblare il catetere e il tappo del catetere con l'ingresso e la vite. Tagliare il catetere ad una lunghezza di 2 mm con un bisturi (Figura 1). NOTA: non utilizzare forbici per questo, poiché spremono e distorcono la forma circolare della sezione trasversale della punta del catetere.</li>
</ol>2. Preparazione chirurgica
<ol><li>Anestetizzare il ratto mediante somministrazione intraperitoneale (p.i.) della miscela anestetica (1,5 ml/kg di peso corporeo).</li>
	<li>Radere la testa del topo tra le orecchie usando il rasoio elettrico. Posizionare una coperta omeotermica sul telaio stereotassico prima di posizionare l'animale, per evitare l'ipotermia durante l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Immobilizzare la testa del ratto nella cornice stereotassica usando le barre auricolari e la piastra del morso, assicurandosi che la testa sia orizzontale e stabile. Controllare la stabilità applicando pressione al cranio con dito o pinica. NOTA: una fissazione allentata e un posizionamento non orizzontale all'interno del fotogramma stereotassico possono causare una deviazione dalle coordinate previste.</li>
	<li>Applicare colliri lubrificanti per prevenire la secchezza della cornea durante l'intervento chirurgico. Coprire gli occhi con un materiale opaco per prevenire qualsiasi esposizione chirurgica alla luce.</li>
	<li>Pulire l'area rasata alternando l'applicazione del 70% di etanolo e del 10% di complesso povidone-iodio. NOTA: Seguire tutte le misure precauzionali durante l'intervento chirurgico per evitare l'infezione. L'intervento chirurgico è condotto in condizioni asettiche. Se l'asepsi è rotta, il materiale contaminato deve essere sostituito.</li>
</ol>3. Impianto del catetere
<ol><li>Fare un'incisione longitudinale di circa 2 cm di lunghezza nel mezzo della pelle della testa. Usa morsetti bulldog per tenere la pelle ai lati. Per una panoramica di questi passaggi, vedere la Figura 2.</li>
	<li>Rimuovere il sangue utilizzando un applicatore con punta di cotone.</li>
	<li>Rimuovere il periosteo del cranio. Pulire il tessuto con l'applicatore a punta di cotone ed esporre l'osso del cranio. Lasciare asciugare il cranio per circa 1 minuto.</li>
	<li>Identificare i punti di riferimento anatomici, Lambda, Bregma e sutura mediale. Con il trapano installato sul telaio stereotassico, posizionare la punta del trapano sul Bregma come punto di partenza. Spostare 2 mm posteriormente dal Bregma e spostare ~ 2,4 mm lateralmente verso la sutura mediale.</li>
	<li>Praticare un foro di 0,5 mm di diametro per il catetere in questa posizione. Sbuffare delicatamente via la polvere ossea. NOTA: È importante che la dura madre rimanga intatta durante la perforazione. Per garantire ciò, 1) utilizzare un trapano che può essere installato sul telaio stereotassico, 2) ispezionare frequentemente il foro durante la perforazione e 3) perforare a piccoli passi: se viene applicata troppa pressione al cranio, la punta del trapano continuerà e danneggerà il cervello quando il cranio è completamente penetrato.</li>
	<li>Praticare altri 3 fori (~ 1,3 mm di diametro) per le viti di ancoraggio a pochi millimetri di distanza dal primo foro. Soffia delicatamente via la polvere ossea. NOTA: selezionare le posizioni delle viti di ancoraggio che forniscono spazio sufficiente per la parte superiore del catetere (~ 2 mm di diametro) e le parti superiori delle viti di ancoraggio (~ 1 mm).</li>
	<li>Rimuovere la polvere ossea mediante irrigazione con circa 1 - 2 ml di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) o soluzione salina fisiologica utilizzando una siringa. Pulisci il cranio. Stringere le viti di ancoraggio di 2 - 3 giri completi. NOTA: Le viti di ancoraggio sono necessarie per stabilizzare il set-up tenendo in posizione il cemento dentale e, quindi, il catetere. Mentre si stringe una vite di ancoraggio, assicurarsi che non sia facilmente rimovibile sollevandola delicatamente verso l'alto con una pinza. Poiché l'impianto del catetere stesso provoca traumi tissutali, ulteriori lesioni di dura durante la perforazione o il serraggio delle viti di ancoraggio porteranno a lesioni traumatiche multiple e probabilmente ostacoleranno la comparabilità all'interno di un gruppo. Stringere prima le viti di ancoraggio e inserire per ultimo il catetere.</li>
	<li>Inserire il catetere di 2 mm di lunghezza attraverso il primo foro, perpendicolare alla superficie del cranio. Mentre si tiene ancora il catetere, applicare un po 'di cemento dentale e lasciarlo polimerizzare con una breve esposizione (~ 5 s) alla luce di polimerizzazione dentale per stabilizzare il catetere, consentendo l'uso di entrambe le mani nella fase successiva. ATTENZIONE: Mentre si lavora con una luce di polimerizzazione dentale, evitare di guardare direttamente la punta o la luce riflessa dall'area di applicazione, poiché l'alta intensità di questa luce può causare danni alla retina. Utilizzare occhiali protettivi appropriati.</li>
	<li>Applicare più cemento dentale attorno al catetere, ancorare le viti e solidificare il cemento dentale con la luce di polimerizzazione dentale (~ 15 - 30 s). Confermare l'indurimento del cemento con la punta di una pinna.</li>
</ol>4. Chiusura della ferita e antagonizzazione dell'anestesia
<ol><li>Chiudere la pelle della testa con suture riassorbibili, anteriori e posteriori al catetere. NOTA: Poiché ci sarà un set-up irregolare sopra il cranio alla fine dell'impianto, eseguire la chiusura della ferita di conseguenza. Sollevare troppo la pelle comporterà disagio per l'animale.</li>
	<li>Iniettare la miscela di antidoto per via sottocutanea (1,5 ml/kg di peso corporeo) utilizzando una siringa da 1 mL con un ago da 26 G.</li>
	<li>Somministrare enrofloxacina (2,5%) mediante iniezione sottocutanea (7,5 mg/kg di peso corporeo) per trattamento antibiotico profilattico. Somministrare carprofene (1 mg/ml; 5 mg/kg di peso corporeo) e buprenorfina (1,2 mg/kg) per alleviare il dolore mediante iniezione sottocutanea.</li>
</ol>5. Cure post-operatorie e farmaci
<ol><li>Riportare l'animale nella gabbia modificata e tenerlo sotto osservazione per 1 - 3 ore, con un'applicazione di luce infrarossa per evitare l'ipotermia. Osservare e riposizionare costantemente l'animale ogni 5-10 minuti fino al recupero post-operatorio. Prestare particolare attenzione per evitare l'esposizione costante alla luce agli occhi fino al recupero.</li>
	<li>Ripetere le somministrazioni di enrofloxacina (7,5 mg/kg di peso corporeo) e carprofene (1 mg/ml; 5 mg/kg di peso corporeo) mediante iniezioni sottocutanee il giorno successivo all'intervento chirurgico. La buprenorfina non è necessaria per essere rinfrescata poiché il trattamento precedente è efficace per 72 ore.</li>
</ol>6. Preparazione della miscela di immunizzazione (al più presto 14 giorni dopo l'impianto del catetere)
Nota: Posizionare le siringhe su ghiaccio durante la procedura di preparazione.
<ol><li>Collegare due siringhe di vetro Luer lock da 10 mL ai bracci corti di un rubinetto a 3 vie e chiudere la terza uscita con il braccio lungo.</li>
	<li>Assicurarsi che le connessioni siano sicure e prive di perdite: aggiungere circa 4 ml di PBS sterile alla siringa aperta tenendo premuto il pistone 2. Inserire il pistone 1 e spingere entrambi i pistoni avanti e indietro controllando la presenza di perdite. Se non si verifica alcuna perdita, scartare il PBS e rimuovere nuovamente il pistone 1.</li>
	<li>Pipettare 1 mL di IFA e 50 μg di rMOG1-125 insieme e regolare la miscela ad un volume finale di 2 mL con PBS sterile (pH 7,4) in un tubo adatto. NOTA: A causa di perdite di emulsione sulle punte o sulle pareti delle siringhe durante la preparazione, preparare un volume maggiore di quello previsto per la somministrazione. Allo stesso modo è più pratico prepararsi per più di 1 animale contemporaneamente.</li>
	<li>Posizionare la miscela diluita di IFA e rMOG1-125 nella siringa aperta. Inserire delicatamente il pistone mantenendo una pressione allentata sul pistone opposto (Figura 3A).</li>
	<li>Emulsionare l'inoculo guidandolo da una siringa all'altra spingendo i pistoni avanti e indietro, fino a renderlo bianco e viscoso (Figura 3B).</li>
	<li>Fissare una siringa Luer lock da 1 mL al braccio corto aperto del rubinetto a 3 vie e riempirlo di inoculo (Figura 3C). Distribuire tutto l'inoculo su siringhe da 1 mL. Tenerlo sul ghiaccio fino all'iniezione. Somministrare la miscela il giorno della preparazione.</li>
</ol>7. Immunizzazione
<ol><li>Anestetizzare il ratto con isofluorano in una camera (~2 min, miscelato con ossigeno 2 L/min) e quindi sostenere l'anestesia attraverso una maschera (miscelata con ossigeno 1,5 L/min).</li>
	<li>Iniettare 200 μL di inoculo per via sottocutanea alla base della coda utilizzando un ago da 21 G. NOTA: Somministrare l'iniezione lentamente poiché la soluzione è viscosa.</li>
</ol>8. Determinazione dei titoli anticorpali
<ol><li>Prelevare ~ 200 μL di sangue 4 settimane dopo l'immunizzazione al fine di determinare i titoli anticorpali anti-MOG.</li>
	<li>Rivestire i pozzetti di una piastra a 96 pozzetti con MOG (5 μg/mL in PBS) e incubarli per 1 ora a 37 °C.</li>
	<li>Bloccare la piastra con l'1% di albumina sierica bovina (BSA) in PBS per 1 ora a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubare la piastra con siero di ratto (1:50) e standardirla per 2 ore a 37 °C. Lavare la piastra 3x con 200 μL di PBS/Polisorbato 20.</li>
	<li>Incubare la piastra con anticorpo secondario anti-ratto coniugato con perossidasi di rafano (1:10.000). Lavare la piastra 3x con 200 μL di PBS/Polisorbato 20.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di soluzione di substrato di perossidasi per pozzo e incubarlo per 20 - 30 minuti al buio a temperatura ambiente.</li>
	<li>Misurare la densità ottica a una lunghezza d'onda di 405 nm e calcolare il titolo anticorpale dalla densità ottica utilizzando una curva standard.</li>
</ol>9. Iniezione intracerebrale di citochine
<ol><li>Regolare la lunghezza della cannula del connettore (2 mm). Vedere la Figura 4 per le fasi di preparazione.</li>
	<li>Riempire una siringa da 1 mL con la miscela di citochine (500 ng/μL di TNF-alfa, 300 U/μL di IFN-gamma di ratto ricombinante in PBS sterile). Collegare la siringa a una cannula del connettore. Riempire la cannula con la miscela di citochine. Evitare eventuali bolle.</li>
	<li>Montare la siringa sulla pompa a siringa programmabile e programmarla per iniettare 0,2 μL/min (Figura 5A). Avviare la pompa e mantenerla in servizio per evitare la formazione di bolle d'aria sulla punta della cannula. NOTA: la velocità di iniezione deve tener conto del diametro interno della siringa specifica utilizzata; in tal modo, il diametro della siringa deve essere registrato durante l'affisso della pompa.</li>
	<li>Anestetizzare il ratto con isoflurano in una camera (~2 min, miscelato con 2 L/min di ossigeno) e quindi sostenere l'anestesia attraverso una maschera (miscelata con 1,5 L/min di ossigeno) (Figure 5B e 5C). Applicare colliri lubrificanti poiché l'animale verrà anestetizzato per almeno 30 minuti.</li>
	<li>Rimuovere il cappuccio del catetere con l'ingresso. Inserire la cannula del connettore nel catetere e avvitarla e serrarla (Figure 5D e 5E). NOTA: non tenerlo troppo, in quanto ciò distruggerà la punta superiore del catetere.</li>
	<li>Lasciare che l'iniezione proceda per 10 minuti (il volume totale dell'iniezione è di 2 μL). Arrestare la pompa. Lasciare la cannula all'interno del catetere per 20 minuti per consentire al volume iniettato di diffondersi completamente.</li>
	<li>Svitare la cannula del connettore e rimuoverla lentamente per evitare un effetto vuoto.</li>
	<li>Ricollegare il cappuccio del catetere con l'ingresso e avvitarlo. Lascia che l'animale si riprenda dall'anestesia in una gabbia.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il nostro metodo utilizza ratti DA. L'adattamento ai topi richiederà probabilmente l'uso di un catetere più piccolo e viti. Va anche tenuto presente che il decorso della malattia, la risposta infiammatoria e l'entità della demielinizzazione potrebbero differire da ciò che viene presentato qui se viene utilizzata una specie / ceppo diverso. Tali differenze sono state osservate con modelli EAE classici che utilizzano diversi ceppi di topi. MOG92-106 di origine ratto, ad esempio, ha provocato EAE progressivo primario o secondario progressivo nei topi A.SW, mentre ha indotto EAE recidivante-remittente nei topi SJL/J46. Dovrebbero quindi essere utilizzati animali dello stesso ceppo. Differenze di genere nella manifestazione EAE sono state riportate anche in vari studi precedenti24. Il verificarsi di tali effetti di genere potrebbe essere previsto per il protocollo qui descritto, ma rimane da convalidare in ulteriori esperimenti.
Per l'intervento chirurgico viene utilizzata la somministrazione intraperitoneale (IP) di una miscela di anestetici comprendente 0,02 mg/mL di fentanil, 0,4 mg/mL di midazolam e 0,2 mg/mL di medetomidina. I ratti DA maschi adulti di peso compreso tra 270 e 300 g richiedono circa 0,4 - 0,6 ml di questa miscela(cioè~ 1,5 ml / kg) per indurre un'anestesia della durata di 60 - 90 minuti. Dopo l'intervento chirurgico, l'anestesia viene antagonizzata mediante iniezione sottocutanea di un antidoto comprendente 0,07 mg/mL di flumazenil e 0,42 mg/mL di atipamezolo in soluzione salina fisiologica (0,9% NaCl). Una dose di 1 - 1,5 ml/kg antagonizza l'anestesia entro 5 minuti. In alternativa, gli animali possono essere autorizzati a svegliarsi spontaneamente dopo un lavaggio fisiologico degli anestetici, ma in tal caso, gli animali dovrebbero essere tenuti sotto osservazione fino a quando non sono pienamente coscienti.
Altre opzioni di anestesia frequentemente utilizzate per interventi chirurgici sugli animali, come un'iniezione IP di ketamina e xilazina47 o pentobarbitaldi sodio 48, o un'inalazione di anestetici volatili come isofluorano49 e alotano50, possono anche essere considerati per l'intervento chirurgico presentato qui. È fondamentale, tuttavia, scegliere un agente anestetico che non interferisca con gli interventi a valle previsti.
Durante l'immunizzazione e l'iniezione intracerebrale di citochine, il 5% di isoflurano viene utilizzato per l'anestesia. Il modello qui descritto è stato stabilito utilizzando ratti e i dettagli sperimentali elencati sono, quindi, specificamente applicabili al ratto. Le coordinate di impianto del catetere sono state selezionate per consentire l'analisi simultanea di possibili cambiamenti della sostanza bianca (la punta del catetere nel corpo calloso). Mentre il sito di inserimento del catetere può essere variato rispetto alla posizione anteroposteriore e laterale, la selezione del solco centrale richiede l'evitamento di danni al seno sagittale superiore.
Un'ulteriore caratteristica del metodo descritto è la demielinizzazione equivalente di entrambi gli emisferi ipsi- e controlaterale, possibilmente risultante dal trasporto della miscela di citochine iniettata nello spazio subaracnoideo dal flusso fisiologico del liquido interstiziale dalle regioni corticali51. La modalità di iniezione, e non la posizione del catetere, quindi, provoca demielinizzazione in tutta la corteccia cerebrale, e la scelta della corteccia parietale destra o sinistra dovrebbe, quindi, essere irrilevante a questo proposito.
Il protocollo utilizza un catetere da 26 G, che è abbastanza piccolo da evitare lesioni traumatiche estese e abbastanza grande da evitare un aumento del tasso di intasamento della punta del catetere nel lungo corso dell'esperimento. Certamente, l'impianto e la presenza del catetere stesso provocano un'attivazione astrocitica e microgliale, anche negli animali di controllo che ricevono solo l'impianto del catetere; tuttavia, questo è minore rispetto agli animali iniettati con citochine. 43 Per evitare qualsiasi interferenza con le analisi successive, abbiamo utilizzato cateteri compatibili con la risonanza magnetica in poli-etere-etere-chetone (PEEK).
Una simile profondità di demielinizzazione è, infatti, creata sia nelle regioni ipsi- che controlaterali con il metodo presentato. Ciò implica che la profondità / lunghezza del catetere potrebbe non svolgere un ruolo importante nel modello e nell'estensione della demielinizzazione nella corteccia. Pertanto, potrebbe essere presa in considerazione una modifica della lunghezza del catetere al fine di ridurre le dimensioni della lesione indotta dal catetere. Tuttavia, una lunghezza del catetere significativamente più breve potrebbe causare una demielinizzazione corticale leggermente meno pronunciata, mentre una risposta conclusiva sarebbe ottenuta solo da esperimenti che testano specificamente la lunghezza del catetere.
Un vantaggio del modello è che il catetere impiantato consente il test di potenziali terapie somministrate alla corteccia tramite il catetere per consentire la rimielinizzazione al picco della demielinizzazione corticale istologicamente rilevabile (giorno 15 o successivo), mentre in un ambiente di pretrattamento questo sarebbe dopo l'immunizzazione ma prima dell'iniezione di citochine. La decisione sul periodo di tempo in cui le terapie sarebbero state somministrate, quindi, dipenderà dalla particolare domanda di ricerca e dal farmaco di interesse.
Dopo l'impianto del catetere, è importante ospitare gli animali singoli nelle gabbie modificate (preferibilmente alte) per evitare la rimozione del catetere fino alla fine dello studio (Figura 8). Gli animali potrebbero anche svitare il cappuccio del catetere con l'ingresso, anche se questo accade raramente. Gli animali devono essere osservati quotidianamente e i tappi rimossi devono essere sostituiti con quelli freschi, per evitare il blocco della punta del catetere in assenza di un'entrata e per garantire una consegna accurata nel parenchima dopo l'iniezione intracerebrale. Gli animali vengono immunizzati al più presto 2 settimane dopo l'impianto del catetere per consentire la guarigione e la chiusura della barriera emato-encefalica.
I titoli anticorpali anti-MOG sierici devono essere misurati dopo l'immunizzazione. Un esperimento dose-risposta ha mostrato che 5 μg di MOG1-125 (in IFA) hanno fornito un'immunizzazione sufficiente entro 4 settimane nei ratti MASCHI ADULTI DA. Un titolo di 5.000 μg/mL e superiore sarebbe sufficiente, ma dipenderà certamente da diversi fattori, tra cui la preparazione MOG e il ceppo animale e, quindi, dovrà essere determinato individualmente. È importante evitare dosi di antigene eccessivamente elevate che potrebbero portare a un fenotipo EAE classico con arti posteriori paralizzati anche prima dell'iniezione di citochine.
Ogni animale è immunizzato con 5 μg di glicoproteina oligodendrocitaria mielina ricombinante (rMOG1-125) emulsionata in 200 μL di Coadiuvante di Freund incompleto (IFA). Poiché parte dell'emulsione viene persa all'interno della siringa durante la preparazione, è consigliabile preparare più di questa quantità per ciascun animale. Abbiamo usato MOG ricombinante (1-125 dal N-terminus del RAT MOG), che è stato espresso in Escherichia coli ed è stato poi purificato per omogeneità mediante cromatografia chelata, disciolto in 6 M urea, e dializzato contro PBS per ottenere una preparazione fisiologica52,53. Tuttavia, possono essere utilizzati anche MOG disponibili in commercio.
Altri preparati di antigene, come MOG1-116, MOG35-55 o PLP139-151 sono utilizzati in vari modelli EAE e le differenze di antigene e ceppo animale sono note per indurre fenotipi di malattia distinti in questi modelli20. Questi preparati di antigene non sono stati testati nei ratti DA e, se usati in preferenza a rMOG1-125, potrebbero indurre un fenotipo di malattia o risultati istologici diversi da quelli presentati qui.
Una cannula del connettore della stessa lunghezza del catetere viene preparata prima dell'iniezione intracerebrale. Questo può essere fatto assemblandolo con un catetere modello e tagliandolo alla stessa dimensione (2 mm di lunghezza) (Figura 4). È importante che la cannula del connettore sia priva di bolle d'aria durante l'iniezione di citochine, poiché il volume di iniezione è di soli 2 μL, anche una piccola bolla d'aria sulla punta della cannula ridurrà significativamente il volume del liquido consegnato con successo nel cervello. Ciò si ottiene mantenendo la pompa in funzione e inserendo la cannula solo quando una goccia crescente di liquido di iniezione è presente sulla punta. Dopo l'inserimento della cannula, il connettore viene avvitato al catetere evitando un eccessivo scolpiamento in modo da non danneggiare la punta superiore del catetere, il che renderà difficile il riepilogo dopo l'iniezione. Una velocità di iniezione di 0,2 μL / min viene utilizzata per evitare traumi indotti dall'iniezione. Inoltre, un'iniezione lenta, combinata con un periodo di attesa di 20 minuti dopo l'iniezione, assicura la diffusione del liquido iniettato nel liquido interstiziale e un efficace drenaggio nel liquido cerebrospinale. La cannula viene quindi rimossa lentamente per evitare un effetto vuoto.
Il metodo riportato include l'intervento chirurgico e, pertanto, richiede personale in grado di eseguire interventi chirurgici di sopravvivenza stereotassica. Il personale a diretto contatto con gli animali avrebbe dovuto aver seguito gli opportuni corsi di sperimentazione animale. Il resto del protocollo può essere eseguito da membri di laboratorio competenti.
Il metodo ha lo scopo di produrre demielinizzazione innescata dall'infiammazione della corteccia cerebrale e non riproduce tutte le caratteristiche della SM umana(ad esempio,l'insorgenza di lesioni infiammatorie focali della sostanza bianca, che è un segno distintivo della SM umana).

La SM è una malattia infiammatoria immuno-mediata del SNC, che danneggia principalmente i fogli di mielina, ma alla fine porta alla perdita assonale e al danno neuronale permanente. La SM è la più comune malattia immuno-mediata del SNC con una prevalenza stimata di circa 2,3 milioni di persone in tutto il mondo, secondo la National MS Society1, e rappresenta un importante onere personale e socioeconomico. L'età media di insorgenza della malattia è di 30 anni e porta alla perdita di anni produttivi causando gravi disabilità. La SM è attualmente incurabile e le attuali modalità di trattamento mirano a gestire i sintomi durante una ricaduta acuta nella SM recidivante-remittente e a modificare il decorso della malattia per diminuire la frequenza delle recidive mediante terapia immunomodulatoria2,3. Nessuna opzione di trattamento si è ancora dimostrata efficace per i tipi progressivi4, ad eccezione di un recente studio clinico sulla terapia di deplezione delle cellule B, che si è dimostrato efficace in un sottogruppo di pazienti con SM progressiva primaria (PPMS) con infiammazione attiva5. Mentre sono stati identificati diversi potenziali fattori di rischio genetici6 e ambientali7, l'eziologia della SM, tuttavia, rimane sconosciuta.
La SM è caratterizzata da grandi placche demielinari infiammatorie e lesioni diffuse alla sostanza bianca8,9. Le lesioni focali sono state associate a un esteso attacco mediato da cellule T, distruzione di oligodendrociti, astrogliosi reattiva e degenerazione assonale, portando a un declino del motoneurone. La demielinizzazione e l'atrofia della materia grigia hanno ottenuto il riconoscimento come caratteristiche istopatologiche aggiuntive della malattia9,10,11. Quest'ultimo è stato suggerito per contribuire alla disfunzione neurologica e al declino cognitivo neipazienti 12,13. Sono stati distinti tre modelli di demielinizzazione corticale, vale a dire i) leucocorticale, contigua alle lesioni della sostanza bianca (34%), ii) piccole, perivascolari (16%) e iii) subpiali (50%). A differenza delle lesioni focali della sostanza bianca, queste lesioni della materia grigia sono state segnalate per mancare di un attacco mediato dalle cellule T e sono invece caratterizzate da una maggiore attivazione microgliale, apoptosi e perdita neuronale12.
Ad oggi, non è stato possibile ricapitolare la SM umana in un singolo modello animale, in gran parte a causa della complessità della malattia. Una varietà di modelli animali di SM, ognuno dei quali simula diversi aspetti della patogenesi e della progressione della malattia, sono stati invece sviluppati14,15. Gli attuali modelli animali imitano tre diversi processi patologici: i) lesioni infiammatorie focali, ii) danno diffuso della sostanza bianca e iii) patologia diffusa della materia grigia.
Studi su animali sulle placche della sostanza bianca della SM sono stati condotti principalmente in modelli di encefalomielite da roditori (EAE). Gli animali da esperimento sono attivamente immunizzati con un'emulsione contenente un antigene mielinico [di solito glicoproteina oligodendrocitaria mielinica (MOG)16,17,proteina basica mielinica (MBP)18o proteina proteolipidica (PLP)19],insieme a un coadiuvante completo di Freund (CFA)20. La malattia può anche essere indotta passivamente da un trasferimento adottivo di cellule T mieliniche specifiche21. Il decorso della malattia dipende dalla combinazione antigene/ceppo di topo che viene utilizzata. MOG35-55 in C57BL/6, ad esempio, provoca una malattia cronica monofasica22, mentre PLP139-151 nei topi svizzeri Jim Lambert (SJL) porta a un decorso della malattia recidivante-remittente23 in modo specifico per genere24. Rat MOG35-55, inoltre, induce una risposta encefalitegena delle cellule T, mentre il MOG35-55 umano induce l'infiammazione dipendente dalle cellule B nei topi C57BL/625. Vari modelli EAE forniscono uno strumento eccellente per studiare l'infiammazione cello-mediata principalmente nel midollo spinale e nel cervelletto, ma le strutture del proencefalo come la corteccia, il corpo calloso e le strutture sottocorticali rimangono in gran parte risparmiate26. Né la lesione diffusa della sostanza bianca né la demielinizzazione della materia grigia sono, inoltre, adeguatamente replicate nei modelli EAE26,27. La demielinizzazione corticale associata all'induzione attiva di EAE è stata riportata negli uistitì28,29 e in alcuni sottopro ceppi di ratto di Lewis, in quest'ultimo caso attribuiti alle combinazioni prevalenti di isotipi e alleli di classe IHC di classe I e di classe II30.
Il cuprizone modello31 è uno strumento utile per studiare la demielinizzazione diffusa della sostanza bianca e la patologia della materia grigia con un'estesa demielinizzazione delle regioni corticale, subcorticale32e ippocampale33, nonché del corpo calloso34 e del putamen caudato35. L'intossicazione da cuprizone, che, in linea di principio, provoca l'apoptosi indotta da stress metabolico degli oligodendrociti, imita alcune caratteristiche delle lesioni demielinanti corticali del cervello della SM come l'attivazione di una microglia, l'astrogliosi e una relativa mancanza di cellule immunitarie periferiche infiltranti. La mancanza di apoptosi neuronale e atrofia talammica, così come la completa risoluzione della demielinizzazione con una robusta rimielinizzazione osservata alla cessazione della supplementazione dietetica di cuprizone32,tuttavia, limitano l'uso dell'intossicazione da cuprizone come modello preclinico di SM. La demielinizzazione tossica può anche essere indotta da un'iniezione focale di lisolecitina o bromuro di etidio nei tratti della sostanza bianca36,37, ma questi metodi sono usati raramente. I modelli di demielinizzazione tossica sono particolarmente adatti per l'analisi dei complessi meccanismi della rimielinizzazione, come il requisito per le cellule progenitrici degli oligodendrociti e gli astrociti38,39. Informazioni dettagliate su EAE e modelli di intossicazione sono fornite in due recenti recensioni15,40.
La demielinizzazione indotta da citochine è stata inizialmente sviluppata per studiare le lesioni spinali della sostanza bianca in EAE41. Successivamente, è stato modificato per studiare le patologie corticali della materia grigia nella SM. I ratti Dark Agouti (DA) o Lewis sono prima innescati da un'immunizzazione sub-clinica con MOG1-12542,43 o MOG1-11644 in un adiuvante di Freund incompleto (IFA). A differenza dei modelli EAE classici, questi animali innescati non presentano sintomi clinici di lesioni infiammatorie focali nel midollo spinale. Invece, una risposta infiammatoria e demielinizzazione nel cervello sono successivamente ottenute da una somministrazione intracerebrale di una miscela di citochine pro-infiammatorie [fattore di necrosi tumorale alfa (TNFα) e interferone gamma (IFNγ)] una volta che gli animali hanno raggiunto un titolo stabile di anticorpi anti-MOG nel sangue.
Studi di Merkler et al. 42 e Gardner et al. 44 hanno dimostrato l'efficacia di un'induzione della demielinizzazione corticale subpiale mediante un'immunizzazione MOG subclinica e un'iniezione di citochine intracerebrali o subaracnoidali. La durata riportata della demielinizzazione era, tuttavia, troppo breve: una rimielinizzazione completa si è verificata in 14 giorni o meno, limitando così la finestra per qualsiasi test di intervento farmacologico. Entrambi i modelli, inoltre, utilizzano un modus di iniezione traumatico, che potrebbe di per sé causare un trauma da iniezione e una rottura della barriera emato-encefalica (BBB) e quindi portare a un reclutamento incontrollato di cellule infiammatorie nel parenchima. Entrambi gli studi, inoltre, hanno dimostrato una demielinizzazione limitata a un'area limitata, nella corteccia ipsilaterale o nelle immediate vicinanze del sito di iniezione delle citochine.
Per superare queste limitazioni, abbiamo impiantato un catetere nella corteccia parietale destra dei ratti DA, con la punta del catetere situata appena sopra il corpo calloso. Per consentire un pieno recupero dell'integrità della BBB, agli animali è stato concesso un periodo di riposo di 2 settimane dopo l'impianto del catetere. Successivamente, i ratti sono stati immunizzati sub-clinicamente con 5 μg di MOG1-125 ricombinante in IFA. Dopo il raggiungimento di un titolo anticorpale anti-MOG stabile dopo circa 4 settimane, 2 μL di miscela di citochine sono stati iniettati tramite il catetere entro 10 minuti utilizzando una pompa a siringa programmabile. Questa procedura ha provocato una diffusa demielinizzazione corticale sia dell'emisfero cerebrale ipsi- che del controlaterale in 15 giorni, con una parziale rimielinizzazione intorno ai 30 giorni dopo l'iniezione di citochine43. Molteplici fasi di demielinizzazione potrebbero, inoltre, essere indotte dalla somministrazione ripetuta di citochine pro-infiammatorie attraverso il catetere, e l'atrofia cerebrale globale, caratteristica comune dei sottotipi di SM progressiva45,potrebbe essere indotta già dopo la seconda fase di demielinizzazione43. È importante sottolineare che il catetere impiantato potrebbe anche essere utilizzato per testare interventi farmacologici.
Il protocollo descritto di seguito fornisce una spiegazione dettagliata delle fasi sperimentali per una generazione riproducibile di demielinizzazione corticale diffusa in entrambi gli emisferi cerebrali di ratti DA utilizzando un catetere intracerebrale.

<table><tbody><tr><td>Ratti Agouti scuri maschi adulti (300 &plusmn; 25 g)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fentanyl</td><td>Hameln pharma plus, Germania</td><td></td><td>&nbsp; come Fentanyl-Citrate, 50 &5; g/ml</td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>ERWO Pharma, Austria</td><td>50039017</td><td>5 mg/ml</td></tr><tr><td>di Medetomidina&nbsp;</td><td>Orion Pharma, Finlandia</td><td></td><td>come Medetomidin cloridrato, 1mg/ml</td></tr><tr><td>Flumazenil&nbsp;</td><td>Roche, Svizzera</td><td></td><td>0,1 mg/ml</td></tr><tr><td>Atipamezol&nbsp;</td><td>Orion Pharma, Finlandia</td><td></td><td>come Atipamezol cloridrato, 5 mg/ml</td></tr><tr><td>10% complesso di iodio povidone&nbsp;</td><td>Mundipharma, Austria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cemento dentale&nbsp;</td><td>Heraeus Kulzer, Germania</td><td>6603 7633</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina fisiologica&nbsp;</td><td>Fresenius Kabi, Austria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td> NaCl allo 0,9% (PBS)<td>Sigma-Aldrich, Germania</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorano&nbsp;</td><td>AbbVie, Austria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collirio lubrificante&nbsp;</td><td>Thea Pharma, Austria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% EtOH</td><td>Merck, Germania</td> 1070172511 <td>L'etanolo assoluto è stato diluito in ddH2O per la preparazione di</td><td></td></tr><tr><td>enrofloxacina</td> al 70% v/v 2,5% <td>Bayer, Germania</td><td></td><td>Antibiotici profilattici&nbsp;</td></tr><tr><td>carprofene</td><td>Pfizer, USA</td><td></td><td>Antidolorifici, 50 mg/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Interpolazione-20&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Germania</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital&nbsp;</td><td>Richter Pharma, Austria</td><td></td><td>pentobarbital sodico, 400 mg/ml</td></tr><tr><td>Interferone gamma</td><td>PeproTech, Stati Uniti</td><td> 400-20</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di necrosi tumorale alfa</td><td>R& D Systems, USA</td><td>510-RT-050/CF</td><td></td></tr><tr><td>rMOG1-125</td><td>own prodotto presso il Centro di Medicina Molecolare, Karolinska Institute, Svezia</td><td></td><td>Glicoproteina oligodendrocitaria mielina di ratto ricombinante, aminoacidi 1-125 dall'N-terminale, disponibile anche in commercio: AnaSpec, AS-55152-500,</td></tr><tr><td>USA Anti-MOG antibody&nbsp;</td><td>Ana Spec/Kaneka Corporation, Giappone</td><td>Standard AS-555157</td><td>da ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka &nbsp;</td></tr><tr><td>Freund incompleto' s adiuvante&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Germania</td><td>&nbsp; F5506</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario IgG coniugato anti-ratto perossidasi di rafano&nbsp;</td><td>Ana Spec/Kaneka Corporation, Giappone</td><td>AS-555157</td><td>Anticorpo secondario da ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka Corporation</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich, Germania</td><td>A9576</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di substrato di perossidasi</td><td>Vector Laboratories, USA</td><td>SK-45000</td><td></td></tr><tr><td>Telaio stereotassico&nbsp;</td><td>David Kopf Instruments, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cateteri, adatto per risonanza magnetica&nbsp;</td><td>PlasticsOne, USA</td><td>8IC315GPKXXC</td><td></td></tr><tr><td>Cannule fittizie&nbsp;</td><td>PlasticsOne, USA</td><td>8IC315DCNSPC</td><td></td></tr><tr><td>Viti in plastica, adatte per la risonanza magnetica&nbsp;</td><td>PlasticsOne, USA</td><td>8L080X093N01</td><td></td></tr><tr><td>Cannula per connettore&nbsp;</td><td>PlasticsOne, USA</td><td>8IC313CXSPCC</td><td></td></tr><tr><td>Cacciavite con punta</td><td></td><td></td><td></td>da 2 mm</tr><tr><td>Trapano con prolunga flessibile dell'albero&nbsp;</td><td>Proxxon, Germania</td><td>NO 28 472, NO 28 706, NO 28 620,&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Punta da trapano, rotonda, 0,5 mm&nbsp;</td><td>Hager & Meisinger, Germania&nbsp;</td><td>REF310 104 001 001 009</td><td></td></tr><tr><td>Punta da trapano, tortuosa, 1,3 mm&nbsp;</td><td>Hager & Meisinger, Germania&nbsp;</td><td>REF350 104 417 364 013</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi&nbsp;</td><td>Braun, Germania</td><td>BB510</td><td></td></tr><tr><td>Manico per bisturi&nbsp;</td><td>Fine Science Tools, Germania</td><td>91003-12</td><td></td></tr><tr><td>Applicatore con punta in cotone&nbsp;</td><td>Henry Schein Medical, Austria</td><td>900-3155</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche</td><td>Fine Science Tools, Germania</td><td>14101-14, 14088-10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pinze chirurgiche</td><td>Fine Science Tools, Germania</td><td>11002-12, 11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Morsetti per bulldog&nbsp;</td><td>Fine Science Tools, Germania</td><td>18050-35</td><td></td></tr><tr><td>Coperta omeotermica&nbsp;</td><td>Sistemi TSE, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lampada a infrarossi</td><td>Beurer, Germania</td><td>616.51</td><td></td></tr><tr><td>Lampada polimerizzante dentale&nbsp;</td><td>Guilin Woodpecker Medical, Cina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutura assorbibile&nbsp;</td><td>Johnson & Johnson, Belgio</td><td>V792E</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a siringa programmabile&nbsp;</td><td>World Precision Instruments, USA</td><td>AL-1000</td><td></td></tr><tr><td>Guanti</td><td></td><td></td><td></td>da esame</tr><tr><td>Camice</td><td></td><td></td><td></td>chirurgico</tr><tr><td>Rasoio elettrico</td><td>Aesculap, Germania</td><td>GT420</td><td></td></tr><tr><td>Vaporizzatore anestetico volatile&nbsp;</td><td>Rothacher Medical, Svizzera</td><td>CV 30-301-D</td><td></td></tr><tr><td>Fonte di ossigeno per vaporizzatore per anestetico volatile</td><td>Air Liquide, Austria</td><td>19.113</td><td></td></tr><tr><td>Camera per anestesia volatile&nbsp;</td><td>Rothacher Medical, Svizzera</td><td>PS-0347</td><td></td></tr><tr><td>Maschera per anestesia per ratti&nbsp;</td><td>Rothacher Medical, Svizzera</td><td>PS-0307-A</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml&nbsp;</td><td>Codan, Danimarca</td><td>REF 62.1612</td><td></td></tr><tr><td>Ago da 26 gauge per iniezione&nbsp;</td><td>Braun, Germania</td><td>4657683</td><td></td></tr><tr><td>Ago calibro 20 per iniezione e immunizzazione di citochine&nbsp;</td><td>Braun, Germania</td><td>4657519</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe in vetro con punta Luer lock&nbsp;</td><td>Poulten & Graf, Germania</td><td>7.140-37</td><td></td></tr><tr><td>Rubinetto a 3 vie</td><td>Becton Dickinson, Svezia</td><td>394600</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>442404</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di piastre&nbsp;</td><td>Cole-Parmer, Stati Uniti</td><td>EW-1396-00</td><td></td></tr><tr><td>37&deg; C incubatore</td><td>Kendro, Germania</td><td>50042301</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette&nbsp;</td><td>Gilson, Stati Uniti</td><td>F167350</td><td></td></tr></tbody></table>

modello di ratto di demielinizzazione corticale cerebrale diffusa indotta da un'iniezione intracerebrale di citochine pro-infiammatorie

Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines

La sclerosi multipla (SM) è la più comune malattia immuno-mediata del sistema nervoso centrale (SNC) e porta progressivamente a disabilità fisica e morte, causate da lesioni della sostanza bianca nel midollo spinale e nel cervelletto, nonché da demielinizzazione nella materia grigia. Mentre i modelli convenzionali di encefalomielite allergica sperimentale sono adatti per lo studio dell'infiammazione cellulo-mediata nella sostanza bianca spinale e cerebellare, non riescono ad affrontare le patologie della materia grigia. Qui presentiamo il protocollo sperimentale per un nuovo modello di demielinizzazione corticale di ratto che consente lo studio dei meccanismi patologici e molecolari che portano alle lesioni corticali. La demielinizzazione è indotta da un'immunizzazione con glicoproteina oligodendrocitaria a basso dosaggio di mielina (MOG) in un adiuvante di Freund incompleto seguito da una somministrazione intracerebrale mediata da catetere di citochine pro-infiammatorie. Il catetere, inoltre, consente cicli multipli di demielinizzazione senza causare traumi indotti dall'iniezione, nonché la somministrazione intracerebrale di potenziali farmaci terapeutici sottoposti a un'indagine preclinica. Il metodo è anche eticamente favorevole in quanto il dolore e l'angoscia o la disabilità degli animali sono controllati e relativamente minimi. Il periodo di tempo previsto per l'implementazione dell'intero protocollo è di circa 8 - 10 settimane.

La demielinizzazione corticale potrebbe essere valutata in diversi punti temporali dopo un'iniezione di citochine mediante immunoistochimica per la proteina proteolipidica (PLP) (Figura 6). La Figura 6A mostra l'immunoreattività PLP intatta al giorno 15 in un animale di controllo immunizzato con MOG che ha ricevuto solo PBS sterile attraverso il catetere impiantato. Il giorno 1 dopo l'iniezione di citochine, la demielinizzazione poteva già essere rilevata in animali innescati da MOG, anche se solo nelle immediate vicinanze dell'area cateterizzata (Figura 6B). L'immunoreattività PLP rimane intatta nella corteccia controlaterale 1 giorno dopo l'iniezione di citochine. Il giorno 3, si è potuto osservare un graduale aumento della perdita dell'immunoreattività PLP, che si diffonde nella corteccia ipsilaterale (Figura 6C). La demielinizzazione corticale controlaterale potrebbe anche essere rilevata al giorno 3 (Figura 6D), ma è piuttosto limitata all'area sotto le viti di ancoraggio, probabilmente a causa di un'area a basso flusso di liquido interstiziale causata dalle viti di ancoraggio43. L'assenza di un'osservazione simile negli animali di controllo iniettati da PBS esclude la possibilità di demielinizzazione indotta da traumi derivante dalla vite di ancoraggio.
Tra i giorni 9 - 15, la demielinizzazione colpisce gran parte della corteccia di entrambi gli emisferi (Figure 6E, 6Fe 6G). Ciò coincide con un'osservazione del comportamento lento, anche se senza una diminuzione statisticamente significativa delle capacità motorie in un test rotarod43. La demielinizzazione corticale è sostenuta fino a 30 giorni dopo l'iniezione di citochine in entrambi gli emisferi (Figure 6H e 6I) con solo una parziale rimielinizzazione. La Figura 6J mostra una quantificazione della perdita di PLP nella materia grigia corticale dopo l'iniezione intracerebrale di citochine. Va notato che l'immunoreattività PLP non è stata ancora valutata dopo periodi superiori a 30 giorni; in tal modo, la risoluzione istantanea della rimielinizzazione, se presente, rimane da valutare mediante ulteriori sperimentazioni. Una seconda somministrazione di miscela di citochine attraverso il catetere impiantato 30 giorni dopo la prima iniezione provoca una marcata atrofia cerebrale al giorno 15 (Figura 7).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig1.jpg"> Figura 1: Preparazione del catetere. (A e B) La cannula guida e la cannula fittizia (cappuccio del catetere con ingresso) sono assemblate e avvitate. (C) Quindi il catetere viene tagliato a 2 mm di dimensione con l'aiuto di un bisturi. L'osservazione microscopica ha dimostrato che l'uso delle forbici a tale scopo distorce la forma circolare della punta della cannula e, quindi, deve essere evitato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig2.jpg"> Figura 2: L'impianto del catetere. (A) L'intervento inizia con un'incisione longitudinale e la rimozione del periosteo. (B, C) Questo pannello mostra la marcatura del luogo per il catetere a 2 mm posteriori da Bregma e 2,4 mm laterali a destra dalla sutura sagittale; così come i posti per i fori destinati alle tre viti di ancoraggio con una distanza appropriata dal catetere e lambda. (D) Dopo aver praticato il foro del catetere (un diametro di 0,5 mm, con una punta rotonda) e i fori per le viti di ancoraggio (1,3 mm di diametro con una punta di trapano attorcigliata), le viti di ancoraggio vengono serrate. (E, F) Quindi viene inserito il catetere e l'intera configurazione viene stabilizzata con cemento dentale polimerizzante. (G) La ferita è cucita con due o tre nodi anteriori e posteriori al catetere. B = Bregma; L = Lambda; C = Catetere; S1, S2 e S3 = posti per i fori per le tre viti di ancoraggio. Le barre della scala = 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig3.jpg"> Figura 3: Preparazione dell'emulsione rMOG/IFA. (A) La miscela di rMOG, PBS e IFA viene emulsionata premendo l'inoculo da una siringa all'altra spingendo i pistoni avanti e indietro, (B) fino a quando non è bianca e viscosa. (C) Successivamente, l'inoculo viene distribuito a siringhe da 1 mL per l'iniezione. 5 μg di rMOG sono utilizzati in 200 μL di miscela PBS/IFA per immunizzare clinicamente un ratto; tuttavia, a causa delle perdite sulle punte e sulle pareti delle siringhe durante la preparazione, è necessario preparare un volume maggiore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig4.jpg"> Figura 4: Preparazione della cannula del connettore. (A - D) Questi pannelli mostrano come un connettore e un interno sono assemblati con una cannula di guida modello di 2 mm. (E) L'interno viene tagliato alla stessa dimensione della cannula guida con l'aiuto di un bisturi (F) e la guida del modello viene quindi svitata. (G) L'altra estremità della cannula del connettore è fissata a una siringa da 1 mL, che contiene la miscela per iniezione, con un ago da 20 G. Le barre della scala = 3 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig5.jpg"> Figura 5: Iniezione intracerebrale. (A) Una pompa a siringa programmabile viene regolata per una velocità di iniezione di 2 μL/min e la siringa da 1 mL riempita con miscela di citochine (o PBS sterile per i controlli) è montata sulla pompa. (B) L'animale viene prima anestetizzato in camera utilizzando il 5% di isoflurano con un flusso di ossigeno di 2 L/min e poi(C)l'anestesia viene sostenuta attraverso la maschera utilizzando il 2,5% di isoflurano con un flusso di ossigeno di 1,5 L/min. (D) Il cappuccio del catetere con l'ingresso (la cannula fittizia) viene avvitato e la cannula di iniezione viene inserita attraverso il catetere impiantato. Poiché il volume dell'iniezione è molto piccolo, lo sperimentatore deve essere cauto per evitare bolle d'aria sulla punta della cannula. Per questo motivo, è importante avviare l'inserimento mentre la pompa è in funzione e solo quando c'è una bolla liquida in crescita sulla punta. Il volume extra non andrà comunque nel cervello, poiché si rompe sulla parte superiore del catetere prima dell'inserimento. (E) Quindi la cannula del connettore viene serrata e la pompa viene lasciata funzionare per 10 minuti. Dopo 10 minuti di iniezione, la pompa viene arrestata e la cannula viene lasciata all'interno per 15 - 20 minuti per consentire la diffusione del volume iniettato al fluido interstiziale. Le barre della scala = 5 cm, salvo diversa indicazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig5large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig6.jpg"> Figura 6: Immunoreattività PLP nelle sezioni cerebrali coronali. (A) Questo pannello mostra un cervello di controllo (innescato da MOG) con un'iniezione di PBS (giorno 15), che non provoca una demielinizzazione corticale. (B)Già al giorno 1 dopo l'iniezione di citochine, la demielinizzazione è evidente nell'area del catetere. (C) Una più ampia perdita di immunoreattività PLP si osserva nella corteccia ipsilaterale al giorno 3, (D) e sul lato controlaterale. La perdita diffusa di immunoreattività PLP è osservata in entrambi gli emisferi al giorno 15, poiché (E) questo pannello mostra la corteccia ipsilaterale e (F) questo pannello mostra la corteccia controlaterale. (G)Viene fornita una panoramica di entrambi gli emisferi mostrando la diffusa perdita di PLP al giorno 15. Al giorno 30, come (H) questo pannello mostra la corteccia ipsilaterale e (I) questo pannello mostra per la corteccia controlaterale, c'è ancora una notevole demielinizzazione, ma anche alcune aree rimielinate potrebbero essere osservate. (J) Questo pannello mostra la quantificazione della demielinizzazione (perdita PLP in mm2/emisfero). Sezioni cerebrali coronali da 1,5 - 2 μm sono state utilizzate per il rilevamento PLP con MS anti-PLP con un fattore di diluizione di 1:500. Le sezioni sono state controbattete con ematossilina per i nuclei cellulari. Per informazioni dettagliate sull'immunoistochimica, vedere Ucal et al. 43. I pannelli G e J sono stati modificati da Ucal et al. 43. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig6large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig7.jpg"> Figura 7: Atrofia cerebrale dopo la seconda iniezione di citochine. (A) Questo pannello mostra un cervello di controllo (innescato da MOG) con un'iniezione di PBS (giorno 15). (B) Al giorno 15 dopo la prima iniezione di citochine, una seconda iniezione porta all'atrofia cerebrale entro 15 giorni. Sezioni cerebrali coronali da 1,5 - 2 μm sono state utilizzate per il rilevamento PLP con MS anti-PLP con un fattore di diluizione di 1:500. Le sezioni sono state controbattete con ematossilina per i nuclei cellulari. Per informazioni dettagliate sull'immunoistochimica, vedere Blakemore37. Le barre della scala = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig7large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57879/57879fig8.jpg"> Figura 8: Gabbie modificate per impedire la rimozione del catetere da parte dell'animale. Nelle gabbie standard, lo spazio del porta cibo sulla griglia si trova più vicino al fondo della gabbia, creando uno spazio stretto rischioso che aumenta la possibilità che il catetere si aggrovigli con la griglia e, quindi, la sua rimozione. Per evitare ciò, la gabbia deve essere modificata. Questo spazio stretto era bloccato con un piano trasparente, consentendo l'osservanza dell'animale. Il cibo deve essere somministrato all'interno della gabbia in queste gabbie modificate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57879/57879fig8large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Il protocollo qui presentato consente la riproduzione di una diffusa demielinizzazione della materia grigia di entrambi gli emisferi corticali nei ratti Dark Agouti maschi adulti. Il metodo comprende l'impianto intracerebrale di un catetere, l'immunizzazione subclinica contro la glicoproteina degli oligodendrociti mielinici e l'iniezione intracerebrale di una miscela di citochine pro-infiammatorie attraverso il catetere impiantato.

Modello di ratto di demielinizzazione corticale cerebrale diffusa indotta da un'iniezione intracerebrale di citochine pro-infiammatorie

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare una demielinizzazione diffusa della corteccia di entrambi gli emisferi cerebrali in un modello di ratto utilizzando l'immunizzazione sub-clinica contro la glicoproteina degli oligodendrociti mielinici, seguita dall'iniezione cerebrale di interesse di citochine attraverso un catetere impiantato. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nelle malattie demielinanti infiammatorie del cervello, come la sclerosi multipla. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può generare demielinizzazione della materia grigia indotta dall'infiammazione nella corteccia di entrambi gli emisferi cerebrali senza portare a tappi di sostanza bianca.Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso una migliore comprensione dei meccanismi della demielinizzazione corticale che si osserva principalmente nei tipi progressivi di sclerosi multipla. Per iniziare questa procedura, assemblare il catetere e il cappuccio del catetere con l'ingresso. Quindi, tagliare il catetere a una lunghezza di due millimetri con un bisturi.Quindi radere la testa di un ratto anestetizzato tra le orecchie usando il rasoio elettrico. Posizionare il ratto nella cornice stereotassica e fissare la testa usando le barre auricolari e la piastra del morso. Assicurarsi che la testa sia orizzontale e verificarne la stabilità applicando una pressione su di essa con le dita o una pinica.Successivamente, applicare colliri lubrificanti per prevenire la secchezza della cornea durante l'intervento chirurgico, coprire gli occhi con un materiale opaco per prevenire qualsiasi esposizione chirurgica alla luce. Quindi, pulire l'area rasata alternando l'applicazione del complesso di iodio al 70% di etanolo e al 10% di povidone. Per impiantare il catetere, fare un'incisione longitudinale di circa due centimetri di lunghezza lungo la linea mediana.Quindi utilizzare morsetti bulldog per tenere la pelle ai lati. Rimuovere il sangue utilizzando un applicatore a punta di cotone. Successivamente, rimuovere il periosteo, pulire il tessuto con l'applicatore della punta di cotone, esporre il cranio e lasciarlo asciugare per circa un minuto.Quindi, identificare i punti di riferimento anatomici, lambda, bregma e sutura mediale. Con il trapano installato sul telaio stereotassico, posizionare la punta della punta del trapano sul bregma come punto di partenza. Spostare due millimetri posteriori dal bregma e 2,4 millimetri lateralmente alla sutura mediale.Quindi, praticare un foro di 0,5 millimetri di diametro per il catetere in questa posizione. Praticare altri tre fori di 1,3 millimetri di diametro per le viti di ancoraggio a pochi millimetri di distanza dal primo foro. Rimuovere la polvere ossea mediante irrigazione con circa uno o due millilitri di PBS sterile e pulire il cranio.Successivamente, stringere le viti di ancoraggio di due o tre giri completi. Inserire un catetere di due millimetri di lunghezza attraverso il primo foro perpendicolare alla superficie del cranio. Mentre si tiene ancora il catetere, applicare un po 'di cemento dentale e lasciarlo polimerizzare con una breve esposizione alla luce di polimerizzazione dentale per stabilizzare il catetere.Quindi applicare più cemento dentale attorno al catetere, ancorare le viti e solidificare il cemento dentale con la luce di polimerizzazione dentale per circa 15-30 secondi, confermare che il cemento è indurito. Dopo l'impianto, chiudere la pelle con suture riassorbibili anteriori e posteriori al catetere. Quindi iniettare la miscela di antidoto per via sottocutanea.Successivamente, somministrare il 2,5% di enrofloxacina mediante iniezione sottocutanea per il trattamento antibiotico profilattico. Riportare l'animale nella gabbia modificata e tenerlo sotto osservazione per una o tre ore con un'applicazione di luce infrarossa per evitare l'ipotermia. Ripetere il trattamento con enrofloxacina e somministrare carprofene a un milligrammo per millilitro per via sottocutanea per alleviare il dolore mediante iniezione il giorno dopo l'intervento chirurgico.Per preparare la miscela di immunizzazione, collegare due siringhe di vetro a punta di blocco inferiore da 10 millilitro ai bracci corti di un rubinetto a tre vie e chiudere la terza uscita con il braccio lungo. Successivamente, pipettare un millilitro di IFA e 50 microgrammi di rMOG insieme. E regolare la miscela su un volume finale di due millilitri con PBS sterile.Posizionare la miscela diluita di IFA e rMOG nella siringa aperta, quindi inserire delicatamente il pistone mantenendo una pressione allentata sul pistone opposto. Emulsionare l'inoculo guidandolo da una siringa all'altra spingendo i pistoni avanti e indietro fino a quando non è bianco e viscoso. Quindi, fissare una siringa di blocco inferiore da un millilitro al braccio corto aperto del rubinetto a tre vie e riempirlo di inoculo.Distribuire tutto l'inoculo su siringhe da un millilitro e tenerle sul ghiaccio fino all'iniezione. Successivamente, iniettare 200 microlitri della miscela IFA e rMOG per via sottocutanea alla base della coda in un'anestesia isoflurano temporanea utilizzando un ago calibro 21. Per l'iniezione intracerebrale di citochine, regolare la lunghezza della cannula del connettore a due millimetri.Riempire una siringa da un millilitro con la miscela di citochine. Quindi, collegare la siringa alla cannula del connettore. Quindi, riempire la cannula con la miscela di citochine, evitare di creare bolle.Quindi, montare la siringa sulla pompa a siringa programmabile e programmarla per iniettare a una velocità di 0,2 microlitri al minuto. Avviare la pompa e mantenerla in servizio per evitare la formazione di bolle d'aria sulla punta della cannula. Successivamente, rimuovere il cappuccio del catetere con l'ingresso.Inserire la cannula del connettore nel catetere, avvitare e stringere. Quindi lasciare procedere l'iniezione per 10 minuti prima di interrompere la pompa. Lasciare la cannula all'interno del catetere per 20 minuti per consentire al volume iniettato di diffondersi completamente.Successivamente, svitare la cannula del connettore e rimuoverla lentamente per evitare un effetto vuoto. Ricollegare il cappuccio del catetere con l'ingresso e avvitarlo. Lascia che l'animale si riprenda dall'anestesia in una gabbia.La demielinizzazione corticale potrebbe essere valutata in diversi momenti dopo un'iniezione di citochine mediante immunoistochimica per PLP. La Figura 6A mostra l'immunoreattività PLP intatta al giorno 15 in un animale di controllo immunizzato moggy che ha ricevuto solo PBS sterile attraverso il catetere impiantato. Il primo giorno dopo l'iniezione di citochine, la demielinizzazione potrebbe già essere rilevata negli animali MOG prime.Anche se, solo nelle immediate vicinanze dell'area cateterizzata. L'immunoreattività PLP rimane intatta nella corteccia controlaterale un giorno dopo l'iniezione di citochine. Il terzo giorno, si è potuto osservare un graduale aumento della perdita dell'immuno reattività PLP, che si diffonde nella corteccia ipsilaterale.La demielinizzazione corticale controlaterale potrebbe anche essere rilevata al terzo giorno, ma è piuttosto limitata all'area sotto le viti di ancoraggio. Tra i giorni nove e 15, la demielinizzazione colpisce gran parte della corteccia di entrambi gli emisferi. La demielinizzazione corticale è sostenuta fino a 30 giorni dopo l'iniezione di citochine in entrambi gli emisferi con solo una rimielinizzazione parziale.La Figura 6J mostra una quantificazione della perdita di PLP nella materia grigia corticale dopo l'iniezione intracerebrale di citochine. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare demielinizzazione della materia grigia usando l'immunizzazione subclinica contro le proteine mieliniche, seguita dall'iniezione intracerebrale di citochine attraverso il catetere impiantato. Questo modello animale potrebbe aiutare i ricercatori nello studio dei tipi progressivi di sclerosi multipla, la demielinizzazione della materia grigia dello strato è un segno completo.Il catetere impiantato consente cicli multipli di demielinizzazione o somministrazione intercerebrale di potenziali farmaci terapeutici sottoposti a indagine preclinica senza causare traumi indotti dall'iniezione.

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Il video dimostra un metodo per generare un modello di ratto con demielinizzazione corticale cerebrale diffusa. Ciò comporta l'interruzione della barriera emato-encefalica iniettando citochine pro-infiammatorie nei topi innescati con la proteina della guaina mielinica ricombinante. Questo processo facilita l'infiltrazione delle cellule immunitarie, con conseguente diffusa demielinizzazione corticale cerebrale.

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Modello di ratto di demielinizzazione corticale cerebrale diffusa indotta da uniniezione intracerebrale di citochine pro-infiammatorie (Video) | JoVE Journal

Modello di ratto di demielinizzazione corticale cerebrale diffusa indotta da un'iniezione intracerebrale di citochine pro-infiammatorie

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