Somministrazione esogena di microsomi-collegato dell'alfa-synuclein aggregati di neuroni primari come un modello potente delle cellule di formazione di fibrille

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'alfa-sinucleina, come chiarire il meccanismo di diffusione dell'aggregazione e la tossicità dell'alfa-sinucleina in vivo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non richiede la purificazione dispendiosa in termini di tempo delle fibrille preformate dell'alfa-sinucleina. A dimostrare la procedura sarà Lucia Rota, una studentessa laureata del COLA Lab.

Per iniziare la procedura, preparare il tampone di omogeneizzazione e tenerlo in ghiaccio. Successivamente, omogeneizzare il tessuto fresco o congelato in un volume da uno a 10 di tampone di omogeneizzazione ghiacciato utilizzando un omogeneizzatore a pestello in teflon con 10-15 colpi. Successivamente, trasferire tutto l'omogeneizzato iniziale in una provetta da microcentrifuga e centrifugare a 1.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere i nuclei e le cellule integre nel pellet risultante.

Successivamente, scartare il pellet risultante. Quindi, trasferire il surnatante in una provetta da microcentrifuga pulita e centrifugarlo a 10.000 volte G per 20 minuti a quattro gradi Celsius utilizzando una centrifuga refrigerata per ottenere il secondo surnatante e il pellet. Quindi trasferire questo surnatante in una bottiglia di policarbonato e centrifugarlo a 100.000 volte G per un'ora a quattro gradi Celsius utilizzando un'ultracentrifuga e un rotore ad angolo fisso.

Risospendere il pellet greggio P100 con 500 microlitri di tampone di omogeneizzazione. Trasferire il pellet grezzo P100 in una provetta da microcentrifuga pulita e centrifugare a 10.000 volte G per 20 minuti a quattro gradi Celsius in una centrifuga refrigerata. Dopo 20 minuti, scartare il surnatante e risospendere P100 con 100 microlitri di tampone di omogeneizzazione.

Quindi, sonicare il campione per due secondi sul ghiaccio e conservarlo a meno 80 gradi Celsius. Per eseguire il Western Blot, lanciare un gel di poliacrilammide tris-glicina dal 4 al 20% su un apparecchio per elettroforesi verticale. Sciogliere un microgrammo di frazioni di alfa-sinucleina associate ai microsomi nel tampone denaturante del campione e caricarlo sul gel.

In un pozzetto diverso, caricare cinque microlitri di marcatore proteico-standard. Far scorrere il gel a 100 volt in un tampone di corsa SDS di tris-glicina fino a quando il marcatore proteico raggiunge la fine del gel. Quindi, trasferire le proteine su una membrana di nitrocellulosa utilizzando un tampone carbonato basico.

Conservare il campione per una notte nella cella frigorifera con una potenza costante impostata a 200 milliampere. Il giorno successivo, bloccare la membrana con PBS-T con il 5% di latte scremato in polvere su uno shaker orbitale per 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, sciacquare brevemente la membrana con PBS-T.

Incubare la membrana con SIN-1 a 5.000 o l'anticorpo P-Ser129 alfa-sinucleina a 5.000 in latte secco scremato al 2,5% in PBS-T durante la notte in cella frigorifera o in frigorifero a quattro gradi Celsius su uno shaker orbitale. Il giorno successivo, lavare la membrana per 10 minuti a temperatura ambiente con PBS-T su uno shaker orbitale. Incubare la membrana con anticorpo secondario coniugato HRP anti-topo o anti-coniglio a una dose da uno a 3.000 in latte secco scremato al 2,5% in PBS-T per un'ora a temperatura ambiente su un agitatore orbitale.

Quindi, lavare la membrana per 10 minuti a temperatura ambiente con PBS-T su uno shaker orbitale per tre volte. Ottenere il segnale attraverso il normale kit di chemiluminescenza. Per trattare i neuroni, estrarre gli aggregati di alfa-sinucleina associati ai microsomi ottenuti dal midollo spinale di tre diversi topi transgenici malati per avere una soluzione di un microgrammo per microlitro diluita con il tampone di omogeneizzazione originale.

Quindi, rimuovi un terzo del terreno e sostituiscilo delicatamente con un mezzo di neuroni fresco. Aggiungere un microgrammo di aggregati alfa-s associati a microsomi aggregati al mezzo cellulare. Rimetti i neuroni nell'incubatrice a 37 gradi Celsius.

Aggiungere un terzo del terreno fresco al campione senza sostituirlo una volta ogni tre giorni per una settimana. Dopo una settimana di trattamento, rimuovere un terzo del terreno e sostituirlo delicatamente con un terreno fresco contenente il 2% di B27, 10 microgrammi per millilitro di gentamicina e due millimolari di glutammina. Ripetere ogni tre giorni per una settimana prima di fissare le cellule.

Per eseguire l'immunofluorescenza, in una cappa chimica fissare i neuroni con paraformaldeide al 2% e PBS in soluzione di saccarosio al 5% per 15 minuti a temperatura ambiente senza agitare. Dopo 15 minuti, rimuovere la soluzione fissante e lavare brevemente i neuroni con PBS tre volte. Successivamente, permeabilizzare i neuroni con lo 0,3% di surfactina non ionica in PBS per cinque minuti a temperatura ambiente.

Quindi, lavare brevemente i neuroni con PBS tre volte. Incubare i neuroni con FBS e PBS al 3% per 30 minuti a temperatura ambiente su uno shaker orbitale per bloccare i siti di legame non specifici. Successivamente, incubare i neuroni con un anticorpo primario appropriato disciolto in FBS e PBS al 3% per una notte nella cella frigorifera o in frigorifero per una notte a quattro gradi Celsius su uno shaker orbitale.

Il giorno successivo, rimuovere la soluzione anticorpale e lavare brevemente le cellule con PBS per tre volte. Quindi, incubare i neuroni con l'anticorpo secondario fluorescente appropriato disciolto in FBS al 3% e PBS per un'ora a temperatura ambiente al buio su un agitatore orbitale. Rimuovere la soluzione anticorpale e lavare brevemente con PBS per tre volte.

Quindi, colorare i neuroni con la soluzione DAPI per 15 minuti a temperatura ambiente al buio su uno shaker orbitale. Dopo 15 minuti, rimuovere la soluzione anticorpale e lavare brevemente con PBS per tre volte. Montare i vetrini coprioggetti sul vetrino utilizzando un mezzo di montaggio anti-sbiadimento.

In questo studio, la somministrazione di un microgrammo di aggregati di alfa-sinucleina associati a microsomi raggruppati da topi transgenici A53T malati al terreno di coltura di neuroni corticali o ippocampali induce una formazione tempo-dipendente di inclusioni di alfa-sinucleina, positiva per gli anticorpi alfa-sinucleina aggregati-specifici. Dopo due giorni di trattamento, questi aggregati appaiono come piccoli puncta sparsi che diventeranno più abbondanti nei momenti successivi. Dopo due settimane, le inclusioni di alfa-sinucleina assomigliano a strutture lunghe e mature simili a perline fortemente diffuse in tutte le colture neuronali seguendo un pattern neuritico e parzialmente colocalizzate con marcatori presinaptici e neuriti.

Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di regolare il rapporto tra i microgrammi di aggregati di alfa-sinucleina associati a microsomi e la densità dei neuroni placcati e di isolare gli aggregati di alfa-sinucleina associati a microsomi da tessuti ricchi di inclusioni di alfa-sinucleina. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come purificare gli aggregati di alfa-sinucleina associati ai microsomi da topi transgenici malati, da utilizzare come trattamento per i neuroni primari per indurre la formazione di inclusioni di alfa-sinucleina.