Name: Una misura quantitativa di specie reattive dellossigeno e senescenza-collegata di fenotipo secretivo in fibroblasti umani normali durante la senescenza indotta da Oncogene (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: Scopri come misurare quantitativamente le specie reattive dell'ossigeno e il fenotipo secretivo associato alla senescenza in fibroblasti umani WI-38 durante la senescenza indotta da H-Ras. Questi metodi utilizzano coloranti fluorescenti, citometria a flusso, PCR in tempo reale ed ELISA per analizzare i livelli di ROS e i fattori SASP come IL-6 e IL-8.

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Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione della Fondazione ricerca nazionale di Corea (2015R1D1A1A01060839) (a Young Yeon Kim) e da una sovvenzione del National Research Foundation di Corea (NRF) finanziata dal governo di Corea (MSIT) (No. 2016R1A2B2008887, no. 2016R1A5A2007009) (a Jeanho Yun).

<ol><li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).</li>
<li>Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+cellular+senescence%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Aging, cellular senescence, and cancer.</a> Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).</li>
<li>Braig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene-induced+senescence+as+an+initial+barrier+in+lymphoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oncogene-induced senescence as an initial barrier in lymphoma development.</a> Nature. 436 (7051), 660-665 (2005).</li>
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<li>Collado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+biology%3A+senescence+in+premalignant+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour biology: senescence in premalignant tumours.</a> Nature. 436 (7051), 642(2005).</li>
<li>Malaquin, N., Martinez, A., Rodier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+the+senescence+secretome+under+control%3A+Molecular+reins+on+the+senescence-associated+secretory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Keeping the senescence secretome under control: Molecular reins on the senescence-associated secretory phenotype.</a> Experimental Gerontology. 82, 39-49 (2016).</li>
<li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essence+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The essence of senescence.</a> Genes & Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li>
<li>Lu, T., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Free radicals and senescence.</a> Experimental Cell Research. 314 (9), 1918-1922 (2008).</li>
<li>Furumoto, K., Inoue, E., Nagao, N., Hiyama, E., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+telomere+shortening+is+slowed+down+by+enrichment+of+intracellular+vitamin+C+via+suppression+of+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Age-dependent telomere shortening is slowed down by enrichment of intracellular vitamin C via suppression of oxidative stress.</a> Life Sciences. 63 (11), 935-948 (1998).</li>
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<li>Chen, Q., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-like+growth+arrest+induced+by+hydrogen+peroxide+in+human+diploid+fibroblast+F65+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Senescence-like growth arrest induced by hydrogen peroxide in human diploid fibroblast F65 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4130-4134 (1994).</li>
<li>Dumont, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+replicative+senescence+biomarkers+by+sublethal+oxidative+stresses+in+normal+human+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast.</a> Free Radical Biology & Medicine. 28 (3), 361-373 (2000).</li>
<li>Blander, G., de Oliveira, R. M., Conboy, C. M., Haigis, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+dismutase+1+knock-down+induces+senescence+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Superoxide dismutase 1 knock-down induces senescence in human fibroblasts.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 38966-38969 (2003).</li>
<li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).</li>
<li>Serra, V., von Zglinicki, T., Lorenz, M., Saretzki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+superoxide+dismutase+is+a+major+antioxidant+in+human+fibroblasts+and+slows+telomere+shortening%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Extracellular superoxide dismutase is a major antioxidant in human fibroblasts and slows telomere shortening.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6824-6830 (2003).</li>
<li>Rodier, F., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+faces+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Four faces of cellular senescence.</a> The Journal of Cell Biology. 192 (4), 547-556 (2011).</li>
<li>Munoz-Espin, D., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence%3A+from+physiology+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence: from physiology to pathology.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (7), 482-496 (2014).</li>
<li>Tchkonia, T., Zhu, Y., van Deursen, J., Campisi, J., Kirkland, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+and+the+senescent+secretory+phenotype%3A+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence and the senescent secretory phenotype: therapeutic opportunities.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 966-972 (2013).</li>
<li>van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+senescent+cells+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of senescent cells in ageing.</a> Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Kim, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+between+p21+and+Akt+is+required+for+p53-dependent+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Cooperation between p21 and Akt is required for p53-dependent cellular senescence.</a> Aging Cell. 16 (5), 1094-1103 (2017).</li>
<li>Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+ras+provokes+premature+cell+senescence+associated+with+accumulation+of+p53+and+p16INK4a%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a.</a> Cell. 88 (5), 593-602 (1997).</li>
<li>Wu, D., Yotnda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+detection+of+reactive+oxygen+species+%28ROS%29+in+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).</li>
<li>Wojtala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+monitor+ROS+production+by+fluorescence+microscopy+and+fluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods to monitor ROS production by fluorescence microscopy and fluorometry.</a> Methods in Enzymology. 542, 243-262 (2014).</li>
<li>Duncan, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+dysregulation+of+protein+metabolism+in+the+mammalian+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Age-associated dysregulation of protein metabolism in the mammalian oocyte.</a> Aging Cell. 16 (6), 1381-1393 (2017).</li>
<li>Yang, L., Song, T., Chen, L., Soliman, H., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleolar+repression+facilitates+initiation+and+maintenance+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Nucleolar repression facilitates initiation and maintenance of senescence.</a> Cell Cycle. 14 (22), 3613-3623 (2015).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li>
<li>Kosar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+heterochromatin+foci+are+dispensable+for+cellular+senescence%2C+occur+in+a+cell+type-+and+insult-dependent+manner+and+follow+expression+of+p16%28ink4a%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a).</a> Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).</li>
<li>Sharpless, N. E., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forging+a+signature+of+in+vivo+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Forging a signature of in vivo senescence.</a> Nature Reviews. Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+roles+for+p16Ink4a+and+p19Arf+in+senescence+and+ageing+caused+by+BubR1+insufficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Opposing roles for p16Ink4a and p19Arf in senescence and ageing caused by BubR1 insufficiency.</a> Nature Cell Biology. 10 (7), 825-836 (2008).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+p16Ink4a-positive+senescent+cells+delays+ageing-associated+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders.</a> Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).</li>
<li>Baar, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Apoptosis+of+Senescent+Cells+Restores+Tissue+Homeostasis+in+Response+to+Chemotoxicity+and+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging.</a> Cell. 169 (1), 132-147 (2017).</li>
<li>Farr, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cellular+senescence+prevents+age-related+bone+loss+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting cellular senescence prevents age-related bone loss in mice.</a> Nature Medicine. 23 (9), 1072-1079 (2017).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+senescent+cells+by+ABT263+rejuvenates+aged+hematopoietic+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice.</a> Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).</li>
<li>Yosef, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+elimination+of+senescent+cells+by+inhibition+of+BCL-W+and+BCL-XL%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL.</a> Nature Communications. 7, 11190(2016).</li>
<li>Jeon, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+clearance+of+senescent+cells+attenuates+the+development+of+post-traumatic+osteoarthritis+and+creates+a+pro-regenerative+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment.</a> Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui, abbiamo presentato metodi per il monitoraggio dei livelli intracellulari di ROS durante H-Ras-indotta senescenza in fibroblasti umani normali WI-38. I livelli intracellulari di ROS in cellule vive, che possono essere misurati quantitativamente utilizzando il reagente cellula-permeabile DCF-DA e citometria a flusso. Al momento l'assorbimento cellulare, DCF-DA è viene desacetilato agli acidi dalle esterasi intracellulari e, successivamente, ossidato dai ROS per formare altamente fluorescente 2', 7'-diclorofluorescina ...

Più di 50 anni fa, Hayflick e Moorhead ha rivelato che le cellule normali immettere arresto di crescita irreversibile salvo l'esaurimento della loro potenziale proliferativo dopo un certo numero di divisioni cellulari1. Questo fenomeno è ora conosciuto come senescenza replicativa e si crede per correlare fortemente con invecchiamento organismal2. Anche se la progressiva erosione dei telomeri è considerata delle principali cause di senescenza replicativa, vari sforzi cellulari, come il danno del DNA, l'attivazione oncogenica e stress ossidativo, sono stati segnalati per indurre un altro tipo di senescenza cellulare chiamato "la senescenza prematura" o "stress-indotta senescenza". Interessante, la senescenza prematura svolge un ruolo di tumore-soppressiva potente al momento dell'attivazione di oncogeni come H-Ras e BRAF. Studi di modelli murini e tessuti umani hanno prodotto la prova ben fondata che biomarcatori di senescenza cellulare erano principalmente presenti nelle lesioni premaligne dove oncogeni Ras e BRAF sono attivati ma sono stati diminuiti nei tumori maligni che si è sviluppato da Queste lesioni3,4,5. Oltre il suo ruolo nell'invecchiamento e nella soppressione del tumore, senescenza cellulare ha dimostrata in studi precedenti di svolgere un ruolo in vari processi fisiologici, tra cui la guarigione della ferita, riparazione dei tessuti, sorveglianza immune e sviluppo embrionale6.
Anche se l'arresto di crescita è stato ampiamente studiato come un segno distintivo della senescenza cellulare7, un corpo significativo di prova suggerisce che le specie reattive intracellulari dell'ossigeno (ROS) contribuiscono anche alla senescenza cellulare8. L'elevazione dei livelli di ROS durante vari tipi di senescenza cellulare, tra cui senescenza replicativa e senescenza indotta da oncogene (OIS), è stato segnalato originariamente decenni fa9,10. Più direttamente, il trattamento esogeno con una dose subletale di H2O2 induce senescenza11,12. L'inibizione di enzimi di ROS-lavaggio, come SOD1, causa anche la senescenza prematura13. Al contrario, basse condizioni di ossigeno ambientale e aumentando il ritardo ROS scavenging l'insorgenza della senescenza10,14,15. Questi risultati indicano senza dubbio che i ROS sono mediatori importanti o determinanti dell'induzione della senescenza cellulare. Tuttavia, come ROS contribuiscono all'induzione della senescenza cellulare e come i livelli di ROS sono elevati durante la senescenza cellulare richiedono ulteriori indagini.
Recenti studi hanno rivelato che le cellule senescenti hanno attività paracrina potente sulle vicine cellule e tessuti attraverso un' SASP16,17. In tessuto invecchiato, cellule senescenti promuovono tessuto senile disfunzioni attraverso molte vie attraverso SASP oltre uno svuotamento autonoma di cellule proliferative. Vari fattori proinflammatory, quali IL-6, IL-8, TGFβ e metalloproteinasi di matrice (MMP), secernute dalle cellule senescenti, causano disfunzioni relative all'età del tessuto attraverso la compromissione dell'omeostasi tissutale, distruzione dell'architettura del tessuto, senescenza delle cellule vicine e infiammazione sterile18,19. Tuttavia, SASPs può avere effetti benefici a seconda del contesto biologico. Inoltre, la natura di heterogenetic di SASPs dipende il tipo delle cellule senescenti e la fase delle cellule, dante risalto all'esigenza di ulteriore ricerca19.
Qui, descriviamo le tecniche basate su cytometry veloce e sensibile per la valutazione dei livelli intracellulari di ROS durante OIS. Inoltre, vengono presentati i metodi per l'analisi dei fattori SASP usando reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qPCR) ed ELISA.

<table><tbody><tr><td><forte>REAGENTI</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>BOSC 23</td><td>ATCC</td><td>CRL-11269</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>penicillina/streptomicina</td><td>wellgene</td><td>LS202-02</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30013.02</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12800-082</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>pBabe puro-H-RasV12&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>1768</td><td></td></tr><tr><td>pGAG/pol</td><td>Addgene</td><td>14887</td><td></td></tr><tr><td>pVSVG</td><td>Addgene</td><td>1733</td><td></td></tr><tr><td>Turbofect</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>polibrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>8 mg/mL</td></tr><tr><td>puromicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>2 mg/mL&nbsp;</td></tr><tr><td>formaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-4-cloro-3-indolil &beta; D-galattopiranoside (X-gal)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>ferrocianuro di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>ferricianuro di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>tripsina-EDTA</td><td>wellgene</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>DCF-DA</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D6883</td><td>10 mM&nbsp;</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>MMLV Trascrittasi inversa</td><td>Promega</td><td>M1701</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR master 2x mix</td><td>Takara</td><td>PR820A</td><td></td></tr><tr><td>Random Primer</td><td>Promega</td><td>C118A</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Acqua distillata ultrapura</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Saggio ELISA IL-6 umano</td><td>PeproTech</td><td>#900-TM16</td><td></td></tr><tr><td>Saggio ELISA IL-8 umano</td><td>PeproTech</td><td>#900_TM18<</td><td></td></tr><tr><td>strong>EQUIPMENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu; m filtro per siringhe</td><td>sartorius</td><td>16555</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>BEMIS&nbsp;</td><td>Microscopio PM-996</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Citometro a flusso NIKON</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD Bioscience</td><td>LSR Fortessa</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4ml</td><td>Merk Millipore</td><td>UFC800324</td><td></td></tr><tr><td>spettrofotometro NanoDrop</td><td>BioDrop</td><td>80-3006-61</td><td></td></tr><tr><td>Sistema PCR in tempo reale</td><td>Applied Biosystems</td><td>ABI Prism 7500</td><td></td></tr><tr><td>ELISA Lettore</td><td>Molecular Devices</td><td>Lettore</td><td></td> di micropiastre EMax</tr></tbody></table>

una misura quantitativa di specie reattive dell'ossigeno e senescenza-collegata di fenotipo secretivo in fibroblasti umani normali durante la senescenza indotta da oncogene

A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence

La senescenza cellulare è stata considerata uno stato di arresto di crescita irreversibile salvo esaurimento della capacità proliferativa o l'esposizione a varie sollecitazioni. Studi recenti hanno esteso il ruolo della senescenza cellulare ai vari processi fisiologici, tra cui lo sviluppo, la guarigione della ferita, sorveglianza immune e disfunzione del tessuto senile. Anche se l'arresto del ciclo cellulare è una caratteristica fondamentale della senescenza cellulare, una produzione di ossigeno reattivo intracellulare aumentato specie (ROS) è stata dimostrata anche a giocare un ruolo importante nell'induzione della senescenza cellulare. Inoltre, studi recenti hanno rivelato che le cellule senescenti esibiscono le attività paracrina potente sulle vicine cellule e tessuti attraverso un fenotipo secretivo senescenza-collegata (SASP). Il forte aumento di interesse per quanto riguarda le strategie terapeutiche contro la senescenza cellulare dà risalto all'esigenza di una precisa comprensione dei meccanismi di senescenza, compreso ROS intracellulari e la SASP. Qui, descriviamo protocolli per valutare quantitativamente i livelli intracellulari di ROS durante la senescenza cellulare indotta da H-Ras usando la tintura fluorescente ROS sensibile e citometria a flusso. Inoltre, vi presentiamo le tecniche sensibili per l'analisi dell'induzione dell'espressione del mRNA e la secrezione di fattori SASP. Questi protocolli possono essere applicati a vari modelli di senescenza cellulare.

Nella Figura 1è riportato un esempio di H-Ras-indotta senescenza. Un'infezione di fibroblasti umani normali WI-38 con il retrovirus di H-RasV12 indotto da drammatici cambiamenti morfologici (Figura 1B). Inoltre, come illustrato nella Figura 1, attività di colorazione β-gallone SA è stata aumentata notevolmente sull'espressione di H-RasV12. Oltre il 70% delle cellule ha mostrato SA β-gallone macchiatu...

ROS intracellulari è stato indicato per svolgere un ruolo importante nell'induzione della senescenza cellulare. Qui, descriviamo un test sensibile per quantificare i livelli di ROS durante la senescenza cellulare. Forniamo anche i protocolli per la valutazione del fenotipo secretivo senescenza-collegata, che secondo come riferito contribuisce a varie disfunzioni relative all'età.

Una misura quantitativa di specie reattive dell'ossigeno e senescenza-collegata di fenotipo secretivo in fibroblasti umani normali durante la senescenza indotta da Oncogene

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fornire tecniche sensibili per il monitoraggio dei livelli intracellulari di ROS e del fenotipo secretorio associato alla senescenza, o SASP, durante la senescenza cellulare. Qui, dimostriamo che questi metodi rivelano con successo l'aumento dei livelli di ROS intracellulari e dei fattori SASP IL-6 e IL-8 durante la senescenza indotta da H-Ras nei fibroblasti umani normali WI-38. Queste tecniche consentono di monitorare le variazioni dei livelli intracellulari di ROS durante la senescenza cellulare e l'analisi dell'espressione dei fattori SASP.Il vantaggio principale di questo metodo è che possono essere applicati a molti modelli diversi di senescenza cellulare. Pertanto, questo metodo può aiutarci a comprendere il ruolo di ROS e SASP nella senescenza cellulare e a studiare i meccanismi regolatori sottostanti. A dimostrare la procedura saranno i giovani Yeon Kim e Jee-Hyun Um del mio laboratorio.Inizia questa procedura preparando il retrovirus H-Ras. In primo luogo, seminare le cellule BOSC ecotropiche in un piatto di coltura rivestito di poli-L-lisina e coltivare a 37 gradi Celsius in un incubatore di coltura tissutale per un giorno. Il giorno successivo, trasfettare le cellule BOSC con DNA retrovirale H-Ras e confezionare il DNA utilizzando il reagente di trasfezione secondo le istruzioni del produttore.Dopo otto ore di trasfezione, rimuovere il terreno di trasfezione e aggiungere otto millilitri di terreno fresco. Raccogliere i terreni contenenti particelle virali 48 ore dopo e rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione. Quindi, filtrare il terreno contenente il virus con un filtro per siringa da 0,45 micrometri.Piastra le cellule WI-38 in una piastra di coltura da 60 millimetri un giorno prima del prelievo del retrovirus H-Ras e coltura per un giorno a 37 gradi Celsius in un incubatore. Il giorno successivo, rimuovere il terreno di coltura e aggiungere un millilitro di terreno virale H-Ras. Aggiungere un ulteriore millilitro di terreno di coltura contenente due microlitri di soluzione madre di polibrene e incubare per un giorno in un incubatore a CO2.A 24 ore dall'infezione, rimuovere il terreno virale, lavare le cellule due volte con PBS e aggiungere il terreno di crescita. Per rimuovere le cellule non infette, trattare le cellule per due giorni con due microgrammi per millilitro di puromicina. Preparare una soluzione colorante fresca di SA beta-gal diluendo la soluzione madre.Rimuovere i terreni di coltura e lavare le cellule una volta con PBS. Aggiungere la soluzione di fissazione contenente formaldeide e incubare per cinque minuti. Rimuovere la soluzione di fissaggio dalle celle e lavare con PBS.Aggiungere la soluzione colorante SA beta-gal appena preparata per coprire il piatto. Sigillare la capsula con Parafilm per evitare di seccare il campione e incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore senza CO2. Controllare lo stato di colorazione delle cellule al microscopio il giorno successivo.Le cellule beta-gal-positive di SA appariranno blu nella regione perinucleare. Acquisire un'immagine della colorazione SA beta-gal con una telecamera CCD e calcolare la percentuale di cellule SA beta-gal colorate contando il numero di cellule SA beta-gal-positive su almeno 200 cellule totali. Piastra due volte da 10 a 5 cellule WI-38 su un piatto di coltura da 60 millimetri e induce la senescenza infettando le cellule con il retrovirus H-Ras come descritto in precedenza.Al momento desiderato per la misurazione dei ROS, rimuovere il terreno di coltura e lavare una volta con PBS. Staccare le cellule mediante trattamento con soluzione di tripsina/EDTA e determinare la conta cellulare. Trasferire una volta da 10 alla quinta cellula in una provetta conica da 15 millilitri e raccogliere le cellule mediante centrifugazione.Rimuovere con cura il terreno di coltura e aggiungere un millilitro di terreno colorante DCF-DA appena preparato. Risospendere con cura il pellet cellulare e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti al buio. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e lavare una volta con PBS.Risospendere le cellule con un millilitro di PBS e trasferire i campioni in una provetta FACS. Il segnale di fluorescenza DCF-DA può essere misurato utilizzando un citometro a flusso dotato di un laser blu a 488 nanometri. Innanzitutto, eseguire un campione di cellule di controllo non colorato.Nel grafico a punti della dispersione diretta rispetto alla dispersione laterale, selezionare le cellule vive ed eliminare le cellule morte e i detriti cellulari utilizzando uno strumento di gating. Successivamente, nell'istogramma che visualizza il segnale di fluorescenza DCF-DA, regolare la tensione del laser blu per posizionare il picco dalle celle di controllo sul bordo sinistro. Ora, eseguire ogni campione colorato con DCF-DA e registrare almeno 10.000 eventi.Indurre la senescenza infettando le cellule con il retrovirus H-Ras come descritto in precedenza. Un giorno prima del raccolto, lavare le cellule due volte con PBS. Aggiungere tre millilitri di DMEM senza FBS e coltivare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore di coltura tissutale per un giorno.Dopo 24 ore, raccogliere il terreno condizionato e conservarlo a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per il successivo ELISA. Tripsinizzare le cellule e raccogliere le cellule in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri mediante centrifugazione. Preparare l'RNA totale utilizzando il metodo di estrazione dell'RNA convenzionale e generare cDNA da due microgrammi di RNA totale attraverso una reazione di trascrizione inversa.Per la PCR in tempo reale, preparare SYBR Green PCR Master Mix per tutte le reazioni contenenti i primer diretti e inversi per IL-6 o IL-8. Preparare la miscela di reazione per ogni campione contenente primer di actina come controllo interno. Aggiungere 48 microlitri di Master Mix e due microlitri di prodotti a base di cDNA diluiti da uno a tre in ciascun pozzetto in una piastra qPCR ottica a 96 pozzetti.Esegui ogni reazione in triplice copia. Impostare il programma di reazione PCR in tempo reale sul termociclatore ed eseguire la PCR in tempo reale. Al termine della corsa, raccogliere i valori del ciclo di soglia, o valori CT, e calcolare i livelli di mRNA di IL-6 o IL-8 dopo la normalizzazione ai livelli di actina.Terreni condizionati allo scongelamento raccolti in precedenza da cellule senescenti WI-38. Rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione a 500 g per cinque minuti. Concentrare il mezzo condizionato per 10 volte utilizzando un filtro centrifugo con una dimensione dei pori di 3.000 dalton.Eseguire l'ELISA con l'apposito kit ELISA IL-6 o IL-8. Innanzitutto, rivestire bene la piastra ELISA con anticorpi IL-6 o IL-8 diluiti incubando la piastra per una notte a temperatura ambiente. Dopo aver lavato ogni pozzetto quattro volte, aggiungere un tampone bloccante a ciascun pozzetto e incubare per un'ora.Lavare la piastra quattro volte. Aggiungere standard ELISA diluiti in serie o campioni di terreno condizionato concentrato e incubare per due ore. Dopo aver lavato la piastra, incubare i campioni con un anticorpo secondario e coniugare streptavidina-HRP in sequenza.Aggiungere 100 microlitri di soluzione di substrato TMB a ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti per consentire lo sviluppo del colore. Arrestare la reazione aggiungendo la soluzione di arresto. Leggere l'assorbanza di ogni pozzetto con un lettore ELISA a 450 nanometri.Tracciare la curva standard per gli standard generati. Calcolare le concentrazioni di IL-6 e IL-8 nel mezzo condizionato secondo le curve standard. Tracciare i risultati dopo la normalizzazione al conteggio delle celle.L'infezione di fibroblasti umani normali WI-38 con il retrovirus H-Ras ha indotto cambiamenti drammatici nella morfologia cellulare. L'attività di colorazione di SA beta-gal è stata osservata in oltre il 70% delle cellule, indicando che l'espressione di H-Ras induce la senescenza cellulare nelle cellule WI-38 entro sei giorni. L'analisi della colorazione DCF-DA rivela che l'espressione di H-Ras induce anche un aumento significativo dei livelli intracellulari di ROS.L'aumento dei livelli intracellulari di ROS si osserva già due giorni dopo l'espressione di H-Ras e si mantiene fino al punto temporale di sei giorni. L'analisi PCR in tempo reale dei fattori secretori rappresentativi associati alla senescenza IL-6 e IL-8 rivela che l'espressione dell'mRNA di IL-6 e IL-8 è notevolmente aumentata nelle cellule WI-38 senescenti. Gli ELISA di terreno condizionato hanno confermato che la secrezione di IL-6 e IL-8 è aumentata anche nelle cellule senescenti indotte da H-Ras.L'induzione della senescenza cellulare attraverso l'espressione dell'oncogene, il danno al DNA o lo stress ossidativo richiede solitamente dai sei agli otto giorni. Una volta che le celle sono pronte, la misurazione dei ROS può essere eseguita entro due ore se eseguita correttamente. Dopo la padronanza di queste tecniche, l'analisi dell'mRNA e dei livelli proteici dei fattori SASP può essere completata in un giorno.Quando si analizzano i livelli di ROS e l'induzione di SASP, è importante confermare la senescenza cellulare attraverso la colorazione SA beta-gal e, se necessario, un metodo aggiuntivo. Inoltre, è fondamentale ricordare che l'aumento dei ROS si verifica nella fase iniziale della senescenza, mentre lo sviluppo di SASP è rilevabile solo dopo che la senescenza è completamente stabilita. Queste tecniche possono essere applicate a un'ampia varietà di modelli di senescenza cellulare.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare i livelli di ROS e l'induzione di SASP durante la senescenza cellulare.

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Questo video illustra un test basato sulla citometria a flusso per quantificare le cellule tumorali senescenti indotte dalla terapia con doppi marcatori di senescenza. La rilevazione e la quantificazione delle cellule senescenti comportano l'utilizzo di un substrato β-galattosidasi. Il substrato viene scisso dalla β-galattosidasi lisosomiale attiva all'interno delle cellule senescenti, producendo un prodotto fluorescente che, in combinazione con granuli di lipofuscina autofluorescenti, marcare...

Quantificazione basata sulla citometria a flusso di cellule tumorali senescenti indotte da terapia

Sia senescenza impedisce o promuove la tumorigenesi rimane controverso. Poiché i farmaci chemioterapici possono indurre le cellule tumorali a senesce, studiando la senescenza è essenziale per proporre nuove terapie. Tuttavia, il dosaggio standard di β-galattosidasi e ampiamente utilizzato presenta gravi inconvenienti. Proponiamo qui un saggio di citometria di flusso basato rapido e sensibile per quantificare senescenza.

Un metodo sensibile per quantificare le cellule tumorali senescenti

senescenza cellulare, lo stato irreversibile di arresto del ciclo cellulare, può essere indotta da vari stress cellulari. Qui, descriviamo i protocolli per indurre la senescenza e metodi per valutare cellulare marcatori di senescenza.

Le tecniche per indurre e Quantificare cellulare senescenza

Andremo a discutere una serie di protocolli per l'induzione e la convalida della senescenza cellulare in cellule coltivate. Ci concentriamo sui diversi stimoli che inducono la senescenza e descrivere la quantificazione degli indicatori comuni di senescenza-collegata. Forniamo dettagli tecnici usando i fibroblasti come un modello, ma i protocolli possono essere adattati a vari modelli di cellulari.

Induzione e convalida della senescenza cellulare in cellule umane primarie

La senescenza cellulare è il fattore chiave nello sviluppo di patologie croniche legate all'età. L'identificazione delle terapie che colpisce le cellule senescenti è promettente per estendere l'invecchiamento sano. Qui, presentiamo un nuovo saggio da vagliare per l'identificazione delle senoterapie sulla base della misurazione dell'attività di senescenza associata a z-Galactosidase in singole cellule.

Saggio di screening basato su SA-Galactosidase per l'identificazione dei farmaci senoterapici

Questo protocollo descrive il flusso di lavoro per l'etichettatura metabolica di cellule senescenti e non in divisione con SILAC pulsato, analisi di spettrometria di massa non mirata e un calcolo semplificato delle emivite proteiche.

Misurazione dei tassi di turnover proteico in cellule coltivate senescenti e non in divisione con etichettatura metabolica e spettrometria di massa

Qui presentiamo un metodo basato sulla citometria a flusso per la visualizzazione e la quantificazione di più marcatori associati alla senescenza in singole cellule.

Imaging simultaneo e rilevamento basato sulla citometria a flusso di marcatori di senescenza fluorescenti multipli in cellule tumorali senescenti indotte dalla terapia

Viene presentato un protocollo per la quantificazione fluorescente citometrica a flusso di cellule tumorali senescenti indotte da farmaci chemioterapici in colture cellulari o in modelli tumorali murini. Le procedure opzionali includono la co-immunocolorazione, la fissazione del campione per facilitare l'analisi di grandi lotti o punti temporali e l'arricchimento di cellule senescenti vitali mediante selezione citometrica a flusso.

Sonda β-galattosidasi associata alla senescenza fluorescente Far-Red per l'identificazione e l'arricchimento delle cellule tumorali senescenti mediante citometria a flusso

Questo protocollo presenta una microscopia confocale a luce riflessa per la rilevazione oggettiva e monocellulare dell'attività beta-galactosidasi associata alla senescenza (SA-β-gal) nella frazione stromale vascolare isolata dal tessuto adiposo umano. Il metodo è compatibile con l'immunocitochimica, incorpora controlli del pH per la valutazione quantitativa e offre inoltre un'alternativa più sensibile e meno soggettiva rispetto alla colorazione convenzionale SA-β-gal.

Rilevamento della senescenza utilizzando luce riflessa nella frazione vascolare stromale adiposa

Questo articolo presenta un protocollo LysoTracker per cellule vive per misurare il rimodellamento lisosomico durante la senescenza nei fibroblasti umani IMR-90.

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Nuova combinazione di antiossidanti per ripristinare una comunicazione intercellulare sana in un modello in vitro utilizzando un mezzo condizionato da cellule senescenti

Scopri come misurare quantitativamente le specie reattive dell'ossigeno e il fenotipo secretivo associato alla senescenza in fibroblasti umani WI-38 durante la senescenza indotta da H-Ras. Questi metodi utilizzano coloranti fluorescenti, citometria a flusso, PCR in tempo reale ed ELISA per analizzare i livelli di ROS e i fattori SASP come IL-6 e IL-8.

Una misura quantitativa di specie reattive dellossigeno e senescenza-collegata di fenotipo secretivo in fibroblasti umani normali durante la senescenza indotta da Oncogene (Video) | JoVE Journal

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