Frequenti prelievi di punta della coda in topi per la valutazione della secrezione Pulsatile dell'ormone luteinizzante
4 luglio 2018
Qui presentiamo un protocollo di campionamento di sangue punta della coda per la raccolta del campione di frequente nei topi sfrenati. Questo metodo è utile per la valutazione dei modelli di secrezione pulsatile dell'ormone luteinizzante e potrebbe essere adattato per l'analisi di altri fattori circolanti.
L'obiettivo generale del campionamento frequente del sangue sulla punta della coda è quello di ottenere campioni di sangue intero per la misurazione della secrezione pulsatile dell'ormone luteinizzante denominata LH in topi svegli non anestetizzati e con un comportamento normale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neuroendocrinologia riproduttiva, fornendo un protocollo affidabile per valutare la secrezione pulsatile dell'ormone luteinizzante nei topi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la manipolazione e l'assuefazione frequenti garantiscono misurazioni robuste e affidabili del polso dell'ormone luteinizzante dopo trattamenti sperimentali acuti o cronici.
Per cinque settimane prima del prelievo di sangue, maneggiare i topi su base giornaliera dal lunedì al venerdì. Nelle ultime due settimane, maneggia i topi anche sabato e domenica. Eseguire il regime di manipolazione dei topi in una cabina di biosicurezza.
Rimuovi il primo mouse dalla sua gabbia e posizionalo su una superficie adatta all'interno dell'armadio. Trattieni delicatamente il mouse su questa superficie tenendo la base della coda. Quindi con l'altra mano accarezza con decisione la superficie ventrale della coda dalla base alla punta.
Fallo per un totale di sei volte e poi rimetti il topo nella sua gabbia. Si tratta di un set di gestione. A questo punto, attendere sei minuti ed eseguire un'altra serie di gestione.
Continuando questo modello con intervalli tra i set, eseguire quattro set di gestione per sessione di gestione. In totale, questo fornisce ventiquattro colpi di coda per sessione. Se i trattamenti sperimentali durante il periodo di campionamento includeranno metodi di manipolazione aggiuntivi come la collottola o un'iniezione intraperitoneale, acclimatare anche i topi a tale attività di manipolazione durante le sessioni di manipolazione.
Due settimane prima del giorno previsto per la raccolta del sangue, alloggiare i topi in coppia per ridurre al minimo la loro interruzione durante il periodo di campionamento. Per la raccolta del sangue preparare provette da microcentrifuga da 0,6 millilitri per la conservazione del sangue. Etichettare le provette e per i prelievi di sangue da tre microlitri aliquotare cinquantasette microlitri di tampone ACES in ciascuna provetta.
Una volta preparati, conservare i tubi a quattro gradi Celsius. Nell'armadio di biosicurezza tieni pronti i seguenti oggetti: puntali per pipette, un cestino dei rifiuti, un timer, un registro sperimentale, un secchiello per il ghiaccio contenente le provette per la raccolta del sangue, forbici affilate e sterili, un pennarello indelebile e una piccola garza. Quarantacinque minuti prima di iniziare il prelievo di sangue, rimuovere il primo topo dalla sua gabbia e posizionarlo su una superficie idonea.
Quindi segna la coda per identificare rapidamente questo topo dal suo partner nella gabbia. Ora usa le forbici per rimuovere uno o due millimetri della punta della coda. Dopo aver tagliato la coda, accarezza con cura la coda fino a formare una goccia di sangue sulla punta.
Quindi raccogli tre microlitri di sangue e getta sia il sangue che la punta nel cestino dei rifiuti. Quindi assicurarsi che il flusso sanguigno si sia fermato. Se necessario, esercitare una leggera pressione con una garza sterile.
Quindi rimetti il topo nella sua gabbia per sei minuti. Ora a intervalli di sei minuti su quarantacinque minuti, accarezzare con decisione la coda per prelevare ulteriori campioni di sangue dal topo. Se non si forma una gocciolina di sangue, tamponare la coda con una garza imbevuta di soluzione fisiologica per aiutare a eliminare il coagulo di sangue.
Durante il periodo di precampionamento, scartare tutte le aliquote di sangue. Dopo quarantacinque minuti inizia il periodo di campionamento. Quando si prelevano i campioni, trasferire tre microlitri di sangue in una provetta di raccolta, mescolare la provetta per inversione e rimetterla in ghiaccio.
Procedete ora con il campionamento per tutto il tempo necessario. Una volta terminato, sopprimere i topi o assicurarsi che il flusso sanguigno della coda si sia completamente fermato, quindi fornire ai topi una gabbia pulita. Successivamente, trasferire i campioni di sangue in una scatola di conservazione e conservare i campioni a meno venti gradi Celsius fino a quando non possono essere analizzati.
L'ormone luteinizzante o LH è stato misurato in frequenti campioni di sangue per determinare la risposta a una sfida acuta da stress psicosociale. Sei topi neri femmina adulta C57 sono stati ovariectomizzati e sono stati raccolti campioni di sangue per novanta minuti per stabilire una linea di base pretrattamento della secrezione pulsatile di LH. Per il trattamento dello stress durante il campionamento di novanta minuti, gli animali sperimentali sono stati inseriti in dispositivi di ritenuta per roditori e spostati in una nuova gabbia, mentre i controlli sono rimasti nelle loro gabbie domestiche e non sono stati trattenuti.
L'analisi ha mostrato che gli animali di controllo avevano impulsi LH chiari e inequivocabili durante l'intero periodo di campionamento. Al contrario, lo stress psicosociale della contenzione ha soppresso rapidamente e inequivocabilmente la secrezione pulsatile di LH nel gruppo sperimentale. Quando ci si prepara a utilizzare questa tecnica, è importante ricordare di ridurre al minimo i disturbi ambientali come il rumore o le interruzioni da parte di altri ricercatori che potrebbero stressare i topi e interrompere la secrezione pulsatile di LH.
Da quando è stata sviluppata dal Dr. Stein e da altri nel laboratorio Chen, questa tecnica ha iniziato a spianare la strada ai ricercatori nel campo della neuroendocrinologia per esplorare la regolazione del polso LH in una specie in cui sono pratici e disponibili strumenti molecolari e genetici complessi.
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Panoramica
Questo studio descrive un protocollo di prelievo ematico dalla punta della coda per la raccolta di campioni di sangue in topi non immobilizzati, concentrandosi sulla misurazione della secrezione pulsatile dell'ormone luteinizzante (LH). Il metodo è stato ideato per consentire valutazioni affidabili della secrezione pulsatile dell'LH, contribuendo alla ricerca in neuroendocrinologia riproduttiva.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroendocrinologia
- Biologia della riproduzione
- Comportamento animale
Contesto
- La secrezione pulsatile dell'ormone luteinizzante è fondamentale nella fisiologia riproduttiva.
- Tecniche affidabili di campionamento del sangue sono essenziali per misurare con precisione le fluttuazioni ormonali.
- I metodi esistenti potrebbero non tenere adeguatamente conto degli effetti dello stress negli animali.
- Questo protocollo ha lo scopo di ridurre al minimo lo stress nei topi durante il prelievo di sangue.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo affidabile per il prelievo di sangue dalla punta della coda in topi non immobilizzati.
- Valutare la secrezione pulsatile di LH in risposta a trattamenti sia acuti che cronici.
- Migliorare l'accuratezza dei metodi di ricerca neuroendocrinologica.
Metodi Utilizzati
- Il protocollo prevede la manipolazione quotidiana e l'abituazione dei topi prima del prelievo di sangue.
- Sono stati utilizzati topi adulti di sesso femminile C57BL/6, da cui è stato raccolto sangue dalla punta della coda per la misurazione dell'LH.
- Sedute frequenti di manipolazione hanno contribuito a creare un ambiente privo di stress.
- I campioni di sangue sono stati raccolti entro un periodo di tempo stabilito per stabilire i livelli ormonali di base.
Risultati principali
- La tecnica ha permesso il corretto prelievo dei livelli di LH negli animali di controllo.
- Lo stress psicosociale indotto dal blocco ha significativamente soppresso la secrezione di LH nei gruppi sperimentali.
- Lo stress ha ridotto al minimo le misurazioni affidabili della secrezione pulsatile di LH, evidenziando l'efficacia del metodo.
- È stato riscontrato che le perturbazioni ambientali influenzano le misurazioni ormonali.
Conclusioni
- Questo studio stabilisce un nuovo metodo per ottenere misurazioni ormonali accurate nei topi.
- Il protocollo consente ai ricercatori di esplorare efficacemente la regolazione dell'LH negli studi di neuroendocrinologia.
- Comprendere l'impatto dello stress sulla secrezione ormonale contribuisce a una visione più ampia della fisiologia riproduttiva e del comportamento animale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Il prelievo frequente di sangue dalla punta della coda nei topi consente una valutazione ad alta risoluzione della secrezione pulsatile dell'ormone luteinizzante (LH), colmando una lacuna fondamentale nella validazione degli obiettivi neuroendocrini. Questo approccio aumenta la fiducia predittiva nell'analisi dei percorsi mediati da ormoni e orienta le decisioni in fase iniziale del portafoglio progettuale fornendo letture endocrine quantitative e robuste. La capacità del metodo di rilevare i modelli ormonali dinamici in topi liberamente attivi migliora la continuità traslazionale dalla scoperta alla ricerca preclinica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi dei percorsi di segnalazione neuroendocrina attraverso la misurazione diretta della secrezione pulsatile di LH.
- Supporta la riduzione del rischio biologico distinguendo le fluttuazioni ormonali fisiologiche da quelle indotte dallo stress.
- Fornisce dati di validazione funzionale del bersaglio per programmi di ricerca in ambito riproduttivo e neuroendocrino.
- Facilita una previsione affidabile negli studi meccanicistici della regolazione ormonale.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara modelli animali validati per saggi endocrini e di neurobiologia successivi.
- Fornisce misurazioni ormonali standardizzate, riproducibili e quantitative, adatte allo sviluppo di saggi.
- Consente lo screening di interventi sperimentali che influenzano la dinamica della secrezione ormonale.
- Permette una valutazione affidabile di perturbazioni chimiche o genetiche in vivo.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli rilevanti per lo studio delle alterazioni endocrine e delle risposte allo stress.
- Garantisce la continuità dai risultati della fase di scoperta alla validazione preclinica di interventi che modulano gli ormoni.
- Fornisce dati aggiustati per il rischio per lo sviluppo di bersagli neuroendocrini nel processo di sviluppo.
- Migliora la riduzione del rischio predittiva per lo sviluppo di biomarcatori traslazionali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo la misurazione dinamica degli ormoni in modelli animali vivi, sostenendo sia studi meccanicistici che ricerche traslazionali.
- Biologia della Scoperta: Facilita la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi nei sistemi neuroendocrini.
- Screening: Fornisce letture quantitative e riproducibili di LH per la prontezza del saggio e lo screening di interventi.
- Analisi: Fornisce dati sugli ormoni risolti nel tempo, supportando il confronto statistico tra condizioni sperimentali.
- Ricerca Traduzione: Collega i risultati della scoperta a modelli preclinici di funzione endocrina e risposta allo stress.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la valutazione dinamica degli ormoni in diversi programmi di ricerca.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione dei bersagli neuroendocrini.
- Valore operativo: Standardizza il prelievo degli ormoni, garantendo riproducibilità e scalabilità tra diversi studi.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dei progetti e l'efficienza nell'uso del capitale fornendo dati endocrini robusti e quantitativi.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione, corretta in base al rischio, di bersagli e interventi che modulano gli ormoni.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle procedure di manipolazione degli animali e di campionamento neuroendocrino.
- Necessita dell'accesso a saggi ormonali ad alta sensibilità e a un'adeguata infrastruttura analitica.
- Richiede una rigorosa standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per minimizzare gli stress ambientali e quelli legati alla manipolazione.
- È adattabile a diversi modelli murini, ma potrebbe richiedere un'ottimizzazione del protocollo per ceppi o parametri diversi.
- I limiti pratici includono la necessità di un prolungato periodo di ambientamento e un accurato controllo ambientale per garantire l'integrità dei dati.
