Name: Tastatura meccanica delle cellule con pinzette ottiche senza tallone nellembrione della drosofila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Scopri la misura meccanica delle cellule con pinzette ottiche senza tallone nell'embrione di Drosophila. Questo metodo minimamente invasivo combina microscopia a foglio di luce per analisi in vivo della tensione tissutale.

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Questo lavoro è stato supportato da un FRM Equipe Grant FRM DEQ20130326509, Agence Nationale de la Recherche ANR-Blanc Grant, Morfor ANR-11-BSV5-0008 (a P.-F.L.). Riconosciamo la Francia-bioimmagini infrastruttura supportata dal French National Research Agency (ANR-10-INBS-04-01, «Investimenti per il futuro»). Ringraziamo Detailleur Brice e Claude Moretti dall'infrastruttura PICSL-FBI per l'assistenza tecnica.

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<li>Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+multiple-target+tracing+to+probe+spatiotemporal+cartography+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes.</a> Nature Methods. 5 (8), 687-694 (2008).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Pinzette ottiche permettono di effettuare misure meccaniche assolute direttamente nell'epitelio embrionale in via di sviluppo in maniera non invasiva. In questo senso, presenta vantaggi rispetto ad altri metodi, come l'ablazione laser, che sono invasive e forniscono misure relative, forze magnetiche, che richiedono iniezioni, o forzare l'inferenza, che si basa su ipotesi forte e anche forniscono relativa misurazioni.
Il protocollo comprende alcuni passaggi critici. In primo luogo, come la lent...

Lo sviluppo embrionale è un processo altamente riproducibile, durante il quale le cellule e tessuti deformano per plasmare il futuro animale. Tali deformazioni sono stati indicati per richiedere la generazione attiva delle forze al livello1,cella2. Per comprendere processi morfogenetici, durante il quale le cellule e tessuti cambiano la loro forma, pertanto è chiave per valutare le proprietà meccaniche delle cellule coinvolte e per misurare le forze all'interno del tessuto durante il processo3,4 . Strati epiteliali, soprattutto in Drosophila, ampiamente sono stati studiati a causa della loro geometria quasi-2D e alla loro manipolazione facile.
Una serie di tecniche è state così sviluppata da noi e gli altri per valutare epiteliali meccanica in vivo durante lo sviluppo. Daremo una rapida panoramica delle tre principali tecniche utilizzate in tessuti epiteliali. Ablazione laser, un metodo ampiamente utilizzato, permette di rivelare lo stress meccanico locale a cella giunzioni5,6,7,8 o a più grande scala9,10,11 eseguendo tagli locali che interrompono l'integrità meccanica del bersaglio. La dinamica di apertura dopo il taglio fornisce informazioni sull'ablazione previo lo stress sia sulla reologia del tessuto12,13. Uno svantaggio dell'ablazione laser è che è invasivo, in quanto richiede l'interruzione locale della corteccia delle cellule. Quindi, uno può eseguire solo un numero limitato di ablazioni se si vuole preservare l'integrità del tessuto. Un altro svantaggio è che ablazioni forniscono solo stime relative di tensione a contatti cellula, poiché la velocità di apertura dipende dall'attrito viscoso, che non è generalmente noto. Manipolazione magnetica inoltre è stato sviluppato e utilizzato in Drosophila, che coinvolgono l'utilizzo di ferrofluidi14 o liposomi ultramagnetic15. Essi possono fornire misure assolute16,17, ma sono anche invasivi nel senso che richiedono l'iniezione di sonde nella posizione desiderata. Questo può essere molto difficile a seconda del sistema, che non è sempre suscettibile di iniezioni di precise. Una terza tecnica, completamente non-invasiva, è forza inferenza18,19,20. Inferenza di forza si basa sull'ipotesi di equilibrio meccanico presso punti tripli (giunzioni tricellular, o vertici) e permette di dedurre le tensioni affatto cellulare contatti (e possibilmente, pressioni in tutte le cellule) di risolvere un problema inverso. Per le tensioni, ogni vertice fornisce due equazioni (X e Y). Questo produce un grande sistema di equazioni lineari che possono essere invertiti in alcune condizioni per valutare la tensione a tutti i contatti delle cellule. Mentre questo metodo è molto attraente, in quanto non richiede solo un'immagine segmentata e nessun esperimento supplementare o setup, sua precisione è ancora da determinare, e ancora fornisce solo valori relativi, a meno che non viene eseguita una misurazione di calibratura assoluta.
Per superare alcune di queste limitazioni, vi presentiamo in questo articolo un setup di pinzette ottiche accoppiato ad un microscopio foglio leggero applicare forze controllate alla scala delle cellule nell'epitelio embrionale di Drosophila melanogaster. Pinzette ottiche sono state utilizzate per numerose applicazioni biologiche compreso le misure sulle singole proteine e la manipolazione di cellule e organelli21. Qui, segnaliamo le forze applicate nel range di pochi dozzina pN, che è piccola ma sufficiente per indurre deformazioni locali di contatti cellula ed eseguire misure meccaniche in vivo. In genere, usiamo flessione perpendicolare di contatti cellula, monitorati attraverso l'analisi di chimografi, di relazionarsi forza alla deformazione. D'importanza, il nostro programma di installazione non richiede l'iniezione di perline nella posizione desiderata nel tessuto, come pinzette ottiche sono in grado di esercitare direttamente le forze su contatti cellula-cellula. L'accoppiamento delle pinzette ottiche ad un microscopio foglio leggero permette di eseguire la rappresentazione rapida (diversi fotogrammi al secondo), che è molto apprezzabile per un'analisi meccanica alle scale di breve tempo e con ridotta fototossicità, dato che l'illuminazione della il campione è limitato al piano del22di imaging.
Nel complessive, ottiche pinzette sono un modo non-invasivo per applicare forze controllate a contatti cellula in vivo l'embrione di Drosophila e per estrarre informazioni meccaniche come rigidità e tensione a cella contatti23, proprietà reologiche 24e gradiente o anisotropia di tensione23.

<table><tbody><tr><td>Laser a fibra di itterbio LP, 10 W, CW</td><td>IPG Laser</td><td>YLM-10-LP-SC</td><td>incluso collimatore LP: raggio D = 1,6 mm e laser guida rosso</td></tr><tr><td>&Oslash; 1/2" Otturatore</td> ottico <td>Thorlabs</td><td>SH05</td><td></td></tr><tr><td>Sistema galvanometrico di piccolo diametro</td><td>Thorlabs</td><td>GVS001</td><td>1 per spostamento X, 1 per spostamento Y</td></tr> Sistema <tr><td>Galvo 1D o 2D Alimentatore lineare Alimentatore Galvanometri</td><td>Thorlabs</td><td>GPS011</td><td>Alimentazione</td></tr><tr><td>2 lenti f = 30 mm</td><td>Telescopio relè Thorlabs</td><td>LB1757-B</td><td>tra 2 galva</td></tr><tr><td>Lente f = 200 mm</td><td>Telescopio Thorlabs</td><td>LB1945-B</td><td>2.5X</td></tr><tr><td>Lente f = 500 mm</td><td>Telescopio Thorlabs</td><td>LB1869-B</td><td>2.5X</td></tr><tr><td>Montatura a specchio ellittico cinematico ad angolo retto con fori per l'asta della gabbia filettata Occhiali</td> di sicurezza laser per <td>periscopio</td><td>Thorlabs</td><td>KCB1E</td></tr><tr><td>, lenti verde chiaro, trasmissione della luce visibile al 59%, stile universale</td><td>Thorlabs</td><td>LG1</td><td></td></tr><tr><td>45&deg; AOI, diametro 50,0 mm, specchio caldo</td><td>Edmund Optics</td><td>#64-470</td><td></td></tr><tr><td>Multiphoton-Emettitore HC 750/S</td><td>AHF</td><td>HC 750/SP</td><td></td></tr><tr><td>Chassis CompactDAQ</td><td>National Instruments</td><td>cDAQ-9178</td><td></td></tr><tr><td>Modulo di uscita in tensione Serie C</td><td>National Instruments</td><td>NI-9263</td><td>Modulo di uscita</td></tr><tr><td>analogico Serie C</td><td>National Instruments</td><td>NI-9215</td><td>Modulo di ingresso analogico</td></tr><tr><td>FluoSpheres Microsfere modificate con carbossilato, 0,5 &micro; m, rosso fluorescente (580/605), 2% solidi</td><td>Perle di calibrazione</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F8812</td></tr> C<tr><td>++ (Qt) software</td><td></td><td></td> per pinzette ottiche fatte in casa <td>sviluppato da Olivier Blanc e Claire Chard's. Soluzione alternativa: labview</td></tr></tbody></table>

tastatura meccanica delle cellule con pinzette ottiche senza tallone nell'embrione della drosofila

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Morfogenesi richiede un coordinamento tra genetica patterning e forze meccaniche per modellare robustamente cellule e tessuti. Quindi, una sfida di comprendere processi morfogenetici è misurare direttamente le forze cellulari e proprietà meccaniche in vivo durante l'embriogenesi. Qui, presentiamo una configurazione di pinzette ottiche accoppiate al microscopio foglio leggero, che permette di applicare direttamente le forze su contatti cellula-cellula dell'embrione della drosofila precoce, mentre la formazione immagine ad una velocità di diversi fotogrammi al secondo. Questa tecnica ha il vantaggio che non richiede l'iniezione di perline in embrione, solitamente usato come sonde intermedi in cui vengono esercitate forze ottiche. Siamo in dettaglio passo dopo passo l'attuazione del programma di installazione e proporre strumenti per estrarre informazioni meccaniche dagli esperimenti. Monitorando gli spostamenti di contatti cellula-cellula in tempo reale, è possibile eseguire misure di tensione e indagare la reologia i contatti cellula.

La figura 5 Mostra dati sperimentali ottenuti imponendo un movimento sinusoidale alla trappola. La trappola produce una deflessione dell'interfaccia, come esemplificato dai 3 istantanee risultati 3 successivi interfaccia posizioni (Figura 5A)23. Filmati registrati vengono utilizzati per generare un kymograph (figura 5B) e vengono ulteriormente analizzati per determinare la pos...

Presentiamo una configurazione di pinzette ottiche accoppiate al microscopio un foglio leggero e la sua attuazione a sonda meccanica delle cellule senza perline nell'embrione della drosofila .

Tastatura meccanica delle cellule con pinzette ottiche senza tallone nell'embrione della drosofila

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella meccanica tissutale come come le proprietà dei contatti cellulari cambiano nello spazio e nel tempo durante la morfogenesi tissutale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è debolmente invasiva ed è compatibile con l'imaging dal vivo come la microscopia a fogli di luce. Questa tecnica non richiede l'iniezione di perline nel tessuto.Di solito usato come sonde demiere su cui ottenere froses, sono eccitato. A dimostrare il processo saranno Chardes, un ingegnere, e Raphael Clement, ricercatore del mio livello di terreno. Per iniziare, impostare un microscopio verticale per la microscopia a fogli di luce nella pianura orizzontale, quindi preparare il laser e l'ottica per fungere da pinzette ottiche.Successivamente, espellere un micro-litro di perline fluorescenti da 500 nanometri in una cuvetta di vetro e aggiungere 10 millilitri di acqua distillata. Posizionare la cuvetta nel supporto della cuvetta sotto l'obiettivo e regolare la messa a fuoco dell'obiettivo in modo che l'obiettivo tocchi la superficie dell'acqua. Ora, apri il creatore QT dell'ambiente di sviluppo integrato che viene utilizzato per controllare il s

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Biologia dello sviluppo

Questo protocollo descrive l'uso di microiniezione e di imaging ad alta risoluzione...

Tecniche di microiniezione per Studiare Mitosi in Drosophila melanogaster Embryo sinciziale

Il cinetocore è dove il SAC inizia il suo segnale di controllo della segregazione mitotica dei cromatidi fratelli. Un metodo è descritto per visualizzare il reclutamento e il fatturato di una delle proteine ​​cinetocoro e il suo coordinamento con il movimento dei cromosomi...

Studiare Checkpoint mitotica illustrando un comportamento dinamico delle proteine ​​cinetocoro e Motion cromosoma in Living<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni sinciziale

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Etichettatura di singole cellule nel sistema nervoso centrale di<em&gt; Drosophila melanogaster</em

La mancanza di strumenti per misurare le proprietà dei materiali e parametri tensionale in vivo impedisce la convalida loro ruoli durante lo sviluppo. Abbiamo impiegato la microscopia a forza atomica (AFM) e rilevamento delle nanoparticelle di quantificare caratteristiche meccaniche sulla cella tuorlo intatto zebrafish embrione durante epiboly. Questi metodi sono affidabili e ampiamente applicabile evitando interventi intrusivi.

AFM e Microrheology nella cella tuorlo embrione di pesce zebra

Le forze meccaniche sono importanti per controllare la migrazione cellulare. Questo protocollo dimostra l'uso di idrogel elastici che possono essere deformati utilizzando una micropipetta di vetro e un micromanipolatore per stimolare le cellule con un gradiente di rigidità locale per suscitare cambiamenti nella struttura cellulare e nella migrazione.

Analisi A singola cella Durotaxis per valutare il controllo meccanico del movimento cellulare e gli eventi di segnalazione correlati

Presentato qui è un protocollo per microiniettare e contemporaneamente immaginire più embrioni di Drosophila durante lo sviluppo embrionale utilizzando un imager a base di piastre e ad alto contenuto.

Preparazione e microiniezione dell'embrione Drosophila per microscopia a cellule vive eseguita utilizzando un analizzatore automatizzato ad alto contenuto

L'obiettivo di questo protocollo è mostrare come eseguire un saggio migliorato per la nocicezione meccanica nelle larve di Drosophila. Usiamo il saggio qui per dimostrare che l'ipersensibilità meccanica (allodinia e iperalgesia) esiste nelle larve di Drosophila.

Un saggio e strumenti migliorati per misurare la nocicezione meccanica nelle larve di Drosophila

Qui, presentiamo un protocollo per studiare le proprietà meccaniche intracellulari di cellule embrionali isolate di zebrafish in confinamento tridimensionale con misurazione della forza diretta mediante una trappola ottica.

Misure di forza diretta della meccanica subcellulare nel confinamento mediante pinzette ottiche

Nel primo embrione di Drosophila , molti organelli sono mobili. In linea di principio, possono essere ripresi dal vivo tramite specifiche sonde fluorescenti, ma il guscio d'uovo impedisce l'applicazione diretta all'embrione. Questo protocollo descrive come introdurre tali sonde tramite microiniezione e quindi analizzare il movimento degli organelli di massa tramite velocimetria dell'immagine delle particelle .

Visualizzazione del traffico citoscheletro-dipendente di organelli contenenti lipidi in embrioni di Drosophila

La contrattilità dell'actomiosina svolge un ruolo importante nella morfogenesi cellulare e tissutale. Tuttavia, è difficile manipolare la contrattilità dell'actomiosina in vivo in modo acuto. Questo protocollo descrive un sistema optogenetico che inibisce rapidamente la contrattilità dell'actomiosina mediata da Rho1 negli embrioni di Drosophila , rivelando l'immediata perdita di tensione epiteliale dopo l'inattivazione dell'actomiosina in vivo.

Inibizione optogenetica della contrattilità dell'actomiosina mediata da Rho1 accoppiata alla misurazione della tensione epiteliale negli embrioni di Drosophila

Questi protocolli delineano come caratterizzare l'organizzazione e la funzione di occluso delle giunzioni del setto piegato nell'epitelio embrionale di Drosophila di controllo e mutante.

Immunocolorazione e esperimenti di penetrazione del colorante per definire le proteine di giunzione settata piegate core nell'epitelio embrionale di Drosophila

Scopri la misura meccanica delle cellule con pinzette ottiche senza tallone nell'embrione di Drosophila. Questo metodo minimamente invasivo combina microscopia a foglio di luce per analisi in vivo della tensione tissutale.

Tastatura meccanica delle cellule con pinzette ottiche senza tallone nell'embrione della drosofila

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