Name: Contrasto-Matching detergente in esperimenti di Scattering di neutroni Small-Angle per Ab Initio modellazione e analisi strutturale di proteine di membrana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Scopri la modellazione ab initio di proteine di membrana tramite scattering di neutroni small-angle con contrast-matching del detergente. Questo metodo consente di determinare stato oligomerico, forma e struttura a bassa risoluzione in soluzione.

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L'ufficio di biologico e la ricerca ambientale sostenuto la ricerca di ORNL centro per biologia molecolare strutturale (CSMB) e Bio-SANS utilizzando strutture supportati dalla divisione scientifica di strutture utente, Office di base energia scienze, dipartimento di di energia. Opere strutturali su proteine di membrana nel laboratorio di Lieberman sono stata sostenuta da NIH (DK091357, GM095638) e NSF (0845445).

Gli autori Volker S. Urban, Sai Venkatesh Pingali, Kevin L. Weiss e Ryan C. Oliver sono contratte attraverso UT-Battelle con noi DOE per sostenere il programma utente di neutroni scienza e Bio-SANS strumento all'Oak Ridge National Laboratory, utilizzato in questo articolo.
Questo manoscritto è stato co-autore di UT-Battelle, LLC, sotto contratto DE-AC05-00OR22725 con l'US Department of Energy (DOE). Mantiene il governo degli Stati Uniti e l'editore, accettando l'articolo per la pubblicazione, riconosce che il governo degli Stati Uniti mantiene una licenza non esclusiva, liberata, irrevocabile, in tutto il mondo per pubblicare o riprodurre il modulo pubblicato di questo manoscritto o consentire gli altri a farlo, fini governo US. DOE fornirà accesso del pubblico a questi risultati di ricerca sponsorizzato dal governo federale conformemente al piano di accesso pubblico DOE. 82

I ricercatori di biologia strutturale sfruttano tecniche strutturali complementari come soluzione dispersione per ottenere dettagli biochimici e strutturali (ad esempio, forma e dimensioni complessive) da biomolecole in soluzione. SANS è una tecnica particolarmente attraente per la determinazione di strutture di bassa risoluzione delle proteine di membrana, un focus di nucleo della moderna biologia strutturale e biochimica. SANS richiede quantità di proteine purificate paragonabili a quelli degli studi cristallografici (...

Proteine di membrana sono codificati di circa il 30% di tutti i geni1 e rappresentano una forte maggioranza di bersagli per farmaci medicinali moderni. 2 queste proteine svolgono una vasta gamma di funzioni cellulari vitali,3 ma nonostante la loro abbondanza e importanza — rappresentano solo circa l'1% del totale strutture depositato nel Research Collaboratory per bioinformatica strutturale (RCSB) proteina Banca dati. 4 a causa della loro natura parzialmente idrofobo, determinazione strutturale delle proteine di membrana-limita è stato estremamente impegnativo. 5 , 6 , 7
Come molte tecniche biofisiche richiedono particelle monodisperse in soluzione per la misurazione, isolando le proteine di membrana dalle membrane native e queste proteine in un mimic solubile delle membrane native di stabilizzazione è stato un'area attiva di ricerca negli ultimi decenni. 8 , 9 , 10 queste indagini hanno portato allo sviluppo di molti romanzo anfifilici assembly per solubilizzare le proteine di membrana, come nanodiscs,11,12,13 bicelles,14,15 e amphipols. 16 , 17 tuttavia, l'uso di detergenti micelle rimane uno degli approcci più comuni e semplici per soddisfare le esigenze di solubilità di una data proteina. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 purtroppo, nessun singolo detersivo o la magica miscela di detergenti attualmente esiste che soddisfa tutte le proteine di membrana; così, queste condizioni devono essere schermate empiricamente per le esigenze specifiche di ogni proteina. 26 , 27
Detergenti, auto-assemblarsi in soluzione sopra loro concentrazione micellare critica per formare le strutture aggregati chiamate micelle. Micelle sono composte di molti monomeri detergente (in genere che vanno da 20-200) con catene idrofobiche alchiliche formando un nucleo di micelle e gruppi testa idrofiliche disposti in uno strato di guscio micella affrontando il solvente acquoso. Il comportamento di detergenti e formazione di micelle è stato classicamente descritto da Charles Tanford in The effetto idrofobico,28 e dimensioni e forme delle micelle dai detergenti comunemente utilizzati negli studi di proteine di membrana sono stati caratterizzata mediante scattering ad angolo piccolo. 29 , 30 organizzazione detersivo sulle proteine di membrana è stato anche studiato, e la formazione di complessi proteina-detergente (PDC) è previsto con detergente molecole circostanti la proteina in un arrangiamento che ricorda il detergente pulito micelle. 31
Uno ha aggiunto vantaggio nell'utilizzo di detergenti è che le proprietà di micella risultante possono essere manipolate incorporando altri detergenti. Molti detergenti per mostre di miscelazione ideale, e selezionare proprietà delle micelle miste possono anche essere prevedute dal componenti e rapporto di miscelazione. 22 tuttavia, la presenza di detersivo può ancora presentare sfide per caratterizzazioni biofisiche contribuendo al segnale complessivo. Ad esempio, con tecniche di dispersione della luce e raggi x, segnale da detersivo in PDC è praticamente indistinguibile dalla proteina. 32 le indagini con singola particella cRIO-microscopia elettronica (cryo-EM) in genere si basano su particelle intrappolate (congelate); dettagli strutturali della proteina sono ancora oscurati da taluni detersivi o un'alta concentrazione di detersivo che aggiunge allo sfondo. 33 approcci alternativi verso interpretando la completa struttura PDC (compreso il detersivo) sono state fatte attraverso metodi computazionali che cercano di ricostruire il detersivo intorno una proteina di membrana determinato. 34
Per il caso di scattering di neutroni, la disposizione di nucleo-guscio di detersivo nella micella produce un fattore di forma che contribuisce alla dispersione osservata. Fortunatamente, i componenti della soluzione possono essere alterati tale che non contribuiscono alla dispersione osservata netta. Questo processo di "contrasto di corrispondenza" si ottiene sostituendo deuterio per l'idrogeno ottenere una densità di lunghezza di dispersione che corrisponde a quello dello sfondo (buffer). Deve essere considerate una scelta giudiziosa di detergente (con controparti deuterati disponibile) e il loro rapporto di miscelazione. Per detergente micelle, questa sostituzione può essere eseguita usando un detersivo con lo stesso gruppo di testa ma avendo una catena alchilica deuterato (d-coda invece di h-coda). Dato che i detergenti sono ben miscelati,35 loro aggregati avrà una densità di lunghezza di dispersione è la frazione molare ponderata medio dei due componenti (h-code e d-code). Quando questo contrasto medio è coerenza con quella del gruppo di testa, le strutture di aggregazione uniforme possono essere abbinate completamente per rimuovere tutti i contributi alla dispersione osservata.
Presentiamo qui un protocollo per manipolare il contrasto di neutroni di micelle detergente incorporando molecole chimicamente identici detersivi con catene alchiliche deuterio-etichettati. 19 , 36 , 37 ciò consente il completo contrasto simultaneo di corrispondenza della micella core e shell, che è una capacità unica di scattering di neutroni. 35 , 38 con questo significativamente raffinato livello di dettaglio, contrasto di corrispondenza può attivare studi altrimenti irrealizzabile di strutture di proteine di membrana. Inoltre, questo approccio di contrasto di corrispondenza potrebbe essere esteso ad altri sistemi che coinvolgono detergente, come polimero cambio reazioni39 e olio-acqua disperdenti,40 o anche altri agenti solubilizzanti, quali bicelles,41 nanodiscs,42 o blocco di copolimeri. 43 A approccio simile come delineato in questo manoscritto, ma impiegando una singola specie di detersivo con sostituzioni di deuterio parziale sul gruppo alchilico catena e/o di testa, è stato recentemente pubblicato. 37 mentre questo può essere previsto per migliorare la distribuzione casuale di idrogeno e deuterio in tutto il detersivo rispetto all'approccio qui presentato, il numero limitato di posti disponibili sul detersivo per sostituzione e in due fasi detergente sintesi necessari pone ulteriori sfide per l'esame.
I passaggi 1 e 2 del protocollo descritto di seguito spesso si sovrappongono poiché esperimento iniziale pianificazione deve essere fatto per presentare una proposta di qualità. Tuttavia, la presentazione delle proposte è considerato qui come il primo passo per sottolineare che questo processo deve essere iniziato in anticipo un esperimento di neutroni. Si noti inoltre che un passaggio dei prerequisiti, che dovrebbe essere dimostrato dalla proposta, è di avere la caratterizzazione biochimica e fisica (tra cui purezza e stabilità) del campione sostiene la necessità per gli studi di neutroni. Una discussione generale di small-angle neutron scattering (SANS) è oltre la portata di questo articolo. Un'introduzione breve ma completa è disponibile nella Caratterizzazione di materiali da Kaufmann,44 e una soluzione completa di libro concentrata sul biologica small-angle scattering è stata recentemente pubblicata l'opera di riferimento. 45 ulteriori letture consigliate sono riportate nella sezione discussione. Scattering di piccolo angolo utilizza il così chiamato vettore di dispersione Q come la quantità centrale che descrive il processo di dispersione. In questo articolo utilizza la definizione ampiamente accettata Q = 4 π sin (θ) / λ, dove θ è la metà dell'angolo tra fascio in ingresso e sparso e λ è la lunghezza d'onda della radiazione neutronica in Angstrom. Esistono altre definizioni che uso diverso simboli come di ' per il vettore di dispersione e che possono variare di un fattore 2 π o utilizzando nanometri al posto di Angstrom (Vedi anche la discussione di Figura 10).

<table><tbody><tr><td>Concentratore Amicon Ultra MWCO 50KDa</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC905096</td><td>da laboratorio</td></tr><tr><td>Acido citrato di ammonio bibasico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A663</td><td>componente medio</td></tr><tr><td>Solfato di ammonio</td><td>EMD Millipore</td><td>2150</td><td>componente medio</td></tr><tr><td>Bioflo 310 Sistema di bioreattori</td><td>Eppendorf</td><td>M1287-2110</td><td></td></tr><tr><td>attrezzatura Cloruro di calcio diidrato</td><td>Acros</td><td>423525000</td><td>componente medio</td></tr><tr><td>Carbenicillina</td><td>IBI Scientific</td><td>IB02025</td><td>antibiotico</td></tr><tr><td>Cloramfenicolo</td><td>EMD Millipore</td><td>3130</td><td>antibiotico</td></tr><tr><td>Cloruro di cobalto (II)</td><td>Acros</td><td>AC21413-0050</td><td>componente medio</td></tr><tr><td>Solfato di rame (II)</td><td>Acros</td><td>AC19771-1000&nbsp;</td><td>componente medio</td></tr><tr><td>Ossido di deuterio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>756822</td><td>componente medio</td></tr><tr><td>Drierite Gas Purifier</td><td>W.A. Hammond Drierite Co. Ltd.</td><td>27068</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, disdio, diidrato</td><td>EMD Millipore</td><td>4010</td><td>componente medio</td></tr><tr><td>Emulsiflex-C3</td><td>Avestin</td><td>EF-C3</td><td>apparecchiature</td></tr><tr><td>&Auml; kta Purificatore UPC100</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td></td><td>attrezzatura</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>componente medio</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR colonna</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td></td><td></td>17116701</tr><tr><td>Imidazolo</td><td>VWR</td><td>97064-622</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Teknova</td><td>I3325</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di ferro (III) esaidrato</td><td>MP Biochemicals</td><td>ICN19404590</td><td>componente medio</td></tr><tr><td>LB Agar Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio eptaidrato</td><td>VWR</td><td>97062-134</td><td>componente medio</td></tr><tr><td>Solfato di manganese (II) monoidrato</td><td>Acros</td><td>AC20590-5000</td><td>componente medio</td></tr><tr><td>MaxQ 6000 Agitatore incubato/refrigerato</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE6000-7&nbsp;</td><td>attrezzatura</td></tr><tr><td>n-Dodecil-d25-&beta;-D-maltopiranoside</td><td>Anatrace</td><td>D310T</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecil-&beta;-D-maltopiranoside</td><td>Anatrace</td><td>D310A</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>VWR</td><td>97062-346</td><td>componente medio</td></tr><tr><td>RC 6 Plus Centrifuga</td><td>Thermo Scientific Sorvall</td><td>46910</td><td>attrezzatura</td></tr><tr><td>SIGMAFAST inibitore della proteasi compresse cocktail, Senza EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795429</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>componente medio</td></tr><tr><td>Filtro per siringa sterile da 25 mm con 0,2&micro; m Membrana PES</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>Filtro sterile monouso per flacone con 0,2&micro; m membrana in PES</td><td>Thermo Scientific</td><td>596-4520&nbsp;</td><td>Articoli da laboratorio</td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL&nbsp;</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td></td><td></td>17517501</tr><tr><td>Colonna Superose-12 10/300 GL&nbsp;</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td></td><td></td>17517301</tr><tr><td>Densimetro cellulare Ultrospec 10</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>80211630</td><td>attrezzature</td></tr><tr><td>Solfato di zinco monoidrato</td><td>Acros</td><td>AC38980-2500&nbsp;</td><td>componente medio</td></tr></tbody></table>

contrasto-matching detergente in esperimenti di scattering di neutroni small-angle per ab initio modellazione e analisi strutturale di proteine di membrana

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

Lo strumento di dispersione biologica ad angolo piccolo neutrone al High-Flux isotopo reattore di Oak Ridge National Laboratory è dedicato allo studio di materiali biologici, biocarburanti lavorazione e materiali bio-ispirato che coprono nanometro a scale di lunghezza di micrometro. I metodi presentati qui per indagare le proprietà fisiche (cioè, dimensioni e forma) delle proteine di membrana (qui, MmIAP, del intramembrane aspartil proteasi da Methanoculleus marisnigri) in soluzioni di formazione di micelle sono detergenti particolarmente adatto per questo strumento di scattering ad angolo piccolo neutrone, tra gli altri. Altre tecniche di caratterizzazione biofisica sono ostacolati dalla loro incapacità di affrontare i contributi detersivi in una struttura di complesso proteina-detergente. Accesso al laboratorio di Bio-Deuteration fornisce inoltre funzionalità uniche per la preparazione di coltivazioni su larga scala e che esprimono le proteine deuterio-etichettati per una maggiore dispersione del segnale dalla proteina. Mentre questa tecnica non fornisce dettagli strutturali in alta risoluzione, il divario di conoscenza strutturale per le proteine di membrana contiene molte zone indirizzabile di ricerca senza risoluzione vicino-atomica. Ad esempio, queste aree includono la determinazione degli Stati oligomerici, formazione complessa, cambiamenti conformazionali durante perturbazione ed eventi di chiusura/apertura. Queste indagini possono essere facilmente realizzate attraverso applicazioni di questo metodo.

Una proposta di tempo e strumento di fascio chiaramente dovrebbe trasmettere tutte le informazioni necessarie per il Comitato di revisione in modo che può essere fatta una valutazione valida dell'esperimento proposto. Comunicazione con un NSS è altamente consigliata per gli utenti inesperti. il NSS può valutare fattibilità iniziale e presentazione delle proposte Guida per enfatizzare la fattibilità, la sicurezza e il potenziale per la scienza ad alto impatto. Le informazioni fornite nella...

Questo protocollo viene illustrato come ottenere un modello a bassa risoluzione ab-initio e dettagli strutturali di una proteina di membrana detergente-solubilizzato in soluzione mediante scattering di neutroni piccolo angolo con contrasto-corrispondenza del detergente.

Contrasto-Matching detergente in esperimenti di Scattering di neutroni Small-Angle per Ab Initio modellazione e analisi strutturale di proteine di membrana

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulle proteine integrali della membrana come lo stato oligomerico, le loro dimensioni, la forma complessiva e la struttura a bassa risoluzione in soluzione. Gli studi di soluzione delle proteine di membrana richiedono molecole stabilizzanti come i detergenti. Questa tecnica ha il vantaggio di rende invisibili i detergenti ed evidenzia il segnale della proteina della membrana.Le implicazioni di questa tecnica si estendono a molte domande di ricerca biologica e medica perché oltre 1/3 delle proteine risiedono in membrane in cui svolgono molte funzioni cellulari vitali. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di etichettatura del deuterio e di scattering neutronico sono difficili da apprendere perché pochissime istituzioni offrono formazione su queste tecniche. Per iniziare, determinare densità di lunghezza di dispersione neutronica o S SLD utilizzando l'applicazione web MULCh, moduli per l'analisi dei dati di variazione del contrasto.Aprire il modulo di contrasto facendo clic sul contrasto nel riquadro di spostamento sinistro. Fornire il testo per un titolo di progetto e immettere i dettagli seg

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