Name: Produzione e visualizzazione di Sferoplasti batteriche e protoplasti di caratterizzare Peptide antimicrobico localizzazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Scopri come produrre sferoplasti di E. coli e protoplasti di B. megaterium per visualizzare la localizzazione dei peptidi antimicrobici. Questo metodo consente di studiare le interazioni peptide-batteri con maggiore chiarezza.

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Ricerca è stata sostenuta dal National Institute of Allergy e malattie infettive (NIAID-NIH) award R15AI079685.

1. soluzione preparazione
Nota: Preparare soluzioni descritte nei passaggi 1.1-1.9 e 1.8 – 1.11 per produrre sferoplasti di e. coli e b. megaterium protoplasti, rispettivamente.
<ol><li>Preparare 1 M Tris-Cl, pH 7,8 sciogliendo 10,34 g Tris HCl e 4,17 g di Tris OH in 50 mL di dH2O in un matraccio da 125 mL. Sterilizzare mediante filtrazione attraverso un filtro per siringa 25 mm con una membrana di 0,2 µm e conservare in un tubo conico a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare soluzione A (20 mM MgCl2, 0,7 M saccarosio, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) sciogliendo 0,10 g MgCl2 (95,2 g/mol) e 11,98 g di saccarosio (342.3 g/mol) in 25 mL dH2O in un pallone da mL 125. Aggiungere 500 µ l 1 M Tris-Cl (pH 7,8) e regolare il volume di 50 mL. Sterilizzare mediante filtrazione attraverso un filtro per siringa 25 mm con una membrana di 0,2 µm e conservare in un tubo conico a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare soluzione B (10mm MgCl2, 0,8 M saccarosio, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) sciogliendo 0,05 g MgCl2 (95,2 g/mol) e 13,69 g di saccarosio (342.3 g/mol) in 25 mL dH2O in un pallone da mL 125. Aggiungere 500 µ l 1 M Tris-Cl (pH 7,8) e regolare il volume di 50 mL. Sterilizzare mediante filtrazione attraverso un filtro per siringa 25 mm con una membrana di 0,2 µm e conservare in un tubo conico a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparate 0,8 M saccarosio sciogliendo 13,69 g di saccarosio (342.3 g/mol) in 50 mL dH2O in un pallone da mL 125. Sterilizzare mediante filtrazione attraverso un filtro per siringa 25 mm con una membrana di 0,2 µm e conservare in un tubo conico a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare desossiribonucleasi 5mg/mL ho (DNasi io) sciogliendo 0,015 g dnasi I a 3 mL di dH2O in un pallone da 50 mL. Sterilizzare mediante filtrazione attraverso un filtro per siringa 25 mm con una membrana di 0,2 µm. Aliquota soluzione in tubi del microfuge e conservare a-20 ° C.</li>
	<li>Preparare 0,125 M acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), pH 8.0 sciogliendo disodio EDTA 0,698 g disidratare (372.2 g/mol) in 15 mL dH2O in un matraccio da 125 mL. Sterilizzare mediante filtrazione attraverso un filtro per siringa 25 mm con una membrana di 0,2 µm e conservare in un tubo conico a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare cephalexin µ g/mL 600 sciogliendo 0,03 g di idrato di cephalexin (365.404 g/mol) in 50 mL di dH2O in un matraccio da 125 mL. Sterilizzare mediante filtrazione attraverso un filtro per siringa 25 mm con una membrana di 0,2 µm e conservare in una provetta conica a 4 ° C.</li>
	<li>Preparate il lisozima 5mg/mL sciogliendo lisozima 0,015 g in 3 mL di dH2O in un pallone da 50 mL. Sterilizzare mediante filtrazione attraverso un filtro per siringa 25 mm con una membrana di 0,2 µm. Aliquota soluzione in tubi del microfuge e conservare a-20 ° C.</li>
	<li>Preparate 3% p/v Trypticase Soy brodo (TSB) sciogliendo 30 g di TSB in 1 L di dH2O in un pallone da 2 L. Aliquota della soluzione in beute contenenti 25 mL o 100 mL TSB per essere utilizzati nella preparazione di Escherichia coli Sferoplasti o protoplasti megaterium b. , , rispettivamente. Boccette di autoclave per sterilizzare il mezzo liquido. TSB sterile può essere conservato a temperatura ambiente o 4 ° C.</li>
	<li>Preparare soluzione C (1 M saccarosio, maleate di 0,04 M, 0.04 M MgCl2, pH 6.5) sciogliendo 34,23 g di saccarosio (342.3 g/mol), 0,46 g acido maleico (116.07 g/mol) e 0,38 g MgCl2 (95.21 g/mol) in 100 mL di dH2O in un pallone da 250 mL. Regolare il pH a 6.5. Sterilizzare mediante filtrazione attraverso un filtro per siringa 25 mm con una membrana di 0,2 µm e conservare in un tubo conico a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare 200 mL di terreno di protoplasti mescolando 100 mL 3% p/v TSB e 100 mL di soluzione C in un flacone di vetro 1 L. Autoclave per sterilizzare la soluzione e conservare a temperatura ambiente.</li>
</ol>2. preparazione della cultura durante la notte
Nota: Eseguire sezioni 2-4 usando tecniche sterili appropriate. Se lo si desidera, un ceppo batterico può contenere un plasmide per la resistenza antibiotica per ridurre la potenziale contaminazione. Se utilizza un ceppo con resistenza agli Antibiotico, è possibile aggiungere gli antibiotici necessari nei passaggi 2.1, 3.1-3.2 e 4.1 – 4.4.
<ol><li>Preparare una coltura durante la notte con la scelta di una singola colonia di batteri utilizzando una pipetta sterile e inserirlo in un tubo di cultura 14 mL contenente 2 – 3 mL di 3% p/v TSB. Incubare a 37 ° C, mentre si stringono per h 16 – 21.</li>
</ol>3. preparazione di Sferoplasti gram-negativi Escherichia coli
<ol><li>In un pallone da 250 mL, diluire il pernottamento cultura 1: 100 in 25 mL di volume di 3% w/v TSB e incubare la soluzione batterica a 37 ° C, agitando per circa 2,5 h fino a quando la soluzione raggiunge una densità ottica di 0,5 – 0,8 a 600 nm. Misurare la densità ottica utilizzando uno spettrofotometro.</li>
	<li>In un pallone da 250 mL, diluire questa cultura 01:10 in 30 mL di 3% p/v TSB e incubare a 37 ° C, mentre si stringono per 2,5 h in presenza di cephalexin 60 µ g/mL (347.4 g/mol) per la produzione di filamenti di singola cellula di circa 50 – 150 µm di lunghezza , che sono osservabili sotto 1.000 X ingrandimento utilizzando un microscopio ottico (Figura 1B).</li>
	<li>Raccogliere i filamenti mediante centrifugazione la soluzione batterica a 1.500 x g, 4 ° C per 4 min. decantare e scartare il surnatante, riservando il pellet.</li>
	<li>Lavare i filamenti delicatamente aggiungendo 1 mL di saccarosio di 0,8 M, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Incubare per 1 min e poi scartare il sopranatante senza disturbare il pellet.</li>
	<li>Aggiungere 150 µ l di 1 M Tris-Cl (pH 7,8), 120 µ l di lisozima di 5 mg/mL, 30 µ l di 5 mg/mL dnasi I e 120 µ l di 0,125 M EDTA nei rispettivi ordina al pellet e incubare la soluzione a temperatura ambiente per 10 min.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di soluzione A gradualmente oltre 1 min per la soluzione preparata in 3.5 utilizzando una micropipetta mentre delicatamente agitando la soluzione a mano. Incubare la soluzione per 4 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Mettere 7 mL di soluzione di 4 ° C B in due provette coniche da 15 mL. Aggiunge la stessa quantità di soluzione preparata in 3.6 a ciascuno di questi due tubi. Centrifugare la soluzione a 1.500 x g, 4 ° C per 4 min.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta sierologica, rimuovere con cautela tutti ma 1–2 mL di surnatante senza disturbare il pellet. Risospendere il pellet pipettando delicatamente su e giù utilizzando una micropipetta P1000. Controllare visivamente formazione Sferoplasti osservando il campione a 1.000 X ingrandimento utilizzando un microscopio ottico (Figura 1).</li>
	<li>Memorizzare gli Sferoplasti a-20 ° C per fino ad una settimana o fino a quando essi sono passati attraverso 3 cicli di gelo-disgelo.</li>
</ol>4. preparazione dei protoplasti di Gram-positivi megaterium b.
<ol><li>In un pallone da 250 mL, diluire il 1:1,000 durante la notte di cultura in 100 mL di 3% p/v TSB e incubare la soluzione batterica a 37 ° C, agitando per circa 4,5 h fino a quando la soluzione raggiunge una densità ottica di 0,9–1.0 a 600 nm. Misurare la densità ottica utilizzando uno spettrofotometro.</li>
	<li>Versare la coltura liquida in due provette coniche da 50 mL e centrifugare a 2.000 x g, 4 ° C per 10 min.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta sierologica, scartare il surnatante da entrambi i tubi conici. Ogni risospendere in 2,5 mL di terreno di protoplasti e combinare le soluzioni sedimento in un singolo tubo conico. Dispensare la soluzione combinata di sedimento in un matraccio da 125 mL.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di lisozima di 5 mg/mL e incubare per 1h a 37 ° C, mentre si stringono.</li>
	<li>Monitorare la crescita dei protoplasti sotto 1.000 x ingrandimento utilizzando un microscopio ottico, rilevando eventuali irregolarità, come i batteri che vengono visualizzati come barre gonfiati invece di sfere (Figura 2). Utilizzando una pipetta sierologica, trasferire la soluzione in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 2.000 x g, 4 ° C per 10 min.</li>
	<li>Decantare il supernatante e risospendere il pellet in media di protoplasti di 5 mL. Memorizzare i protoplasti a-20 ° C per fino ad una settimana o fino a quando essi sono passati attraverso 3 cicli di gelo-disgelo.</li>
</ol>5. preparazione della soluzione Peptide e tintura di membrana per l'Imaging
<ol><li>
Soluzione peptide
	<ol>
<li>In un tubo di microfuge avvolto in carta stagnola, sciogliere 2 mg di FITC etichettato BF2 P11A, dH 800 µ l2O. uso un peptide contenente almeno un residuo di triptofano al fine di effettuare misure di concentrazione di proteina.</li>
		<li>Spettrofotometricamente, misurare l'assorbanza della soluzione del peptide a 280 nm in triplice copia. Calcolare la concentrazione di peptide utilizzando il coefficiente di estinzione molare per triptofano (5.700/Mcm).</li>
		<li>Diluire la concentrazione di peptide in dH2O a una concentrazione finale di 100 – 200 µM. Store in un tubo di microfuge a-20 ° C avvolti in fogli di alluminio per proteggerlo dalla luce.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tintura di membrana
	<ol>
<li>In un tubo di microfuge, preparare un brodo di 10 mM di-8-ANEPPS (592,9 g/mol) sciogliendo 5 mg di-8-ANEPPS in 843.3 µ l di DMSO. Conservare a 4 ° C, avvolti in fogli di alluminio per proteggerlo dalla luce.</li>
		<li>In un tubo di microfuge, preparare 1 mL di 0,03 mM di-8-ANEPPS con l'aggiunta di 3 µ l di 10 mM di-8-ANEPPS a 997 µ l DMSO. Conservare in un tubo di microfuge a 4 ° C, avvolti in fogli di alluminio per proteggerlo dalla luce.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. visualizzazione di e. coli Sferoplasti e b. megaterium protoplasti mediante microscopia confocale
<ol><li>Pipettare 5 µ l di Sferoplasti o protoplasti su una lastra di vetro rivestito di poli-L-lisina. Aggiungere 2 µ l di FITC etichettato AMP (100-200 µM) alla diapositiva e incubare per 3 min al riparo dalla luce.</li>
	<li>Aggiungere 1 µ l della membrana della tintura di-8-ANEPPS (0,03 mM) alla diapositiva e incubare per 3 min al riparo dalla luce. Coprire con un vetrino coprioggetti e sigillare con lo smalto di chiodo.</li>
	<li>Accendere il laser confocale di microscopio e argon. Regolare il laser di argon per potenza di 20% e 20% trasmissione.</li>
	<li>Impostare gli intervalli di lunghezza d'onda emissione di 499 – 532 nanometro e 670 – 745 nm per il peptide FITC-labeled emissione canale e membrana di-8-ANEPPS-labeled tintura emissione, rispettivamente.</li>
	<li>Protoplasti di immagine o Sferoplasti (Figura 1 e Figura 2) con un obiettivo X 63. Utilizzare software di imaging per ottenere 8-bit, 512 x 512 composito z-stack immagini composte di 0,5 µm fette della totalità del sferoplasto o del protoplasto. Nota: Prendere attenta considerazione per ridurre l'emissione trapasso mentre imaging Sferoplasti e protoplasti. Vedere la discussione per i dettagli.</li>
</ol>7. caratterizzazione della localizzazione di AMP
<ol><li>Aprire l'immagine di z-pila composito in software di imaging. Individuare la fetta più in centro di sferoplasto/i protoplasti e posizionare una regione circolare di interesse (ROI) (0,3 µm di diametro) sulla membrana (ROI 1), uno al centro del sferoplasto o del protoplasto (ROI 2) e una distanza dello spheroplast o protoplasti su misura la fluorescenza di fondo (ROI 3) (Figura 5). Evitare l'inclusione di pixel saturi. L'intensità di fluorescenza in ogni ROI può essere calcolato dal software di imaging. Nota: In casi quando peptide non localizza all'interezza della membrana, disegno ROI 1 in un'area della membrana dove è localizzato il peptide.</li>
	<li>Utilizzare la seguente equazione per determinare il rapporto di intensità di fluorescenza del peptide intracellulare di intensità di fluorescenza del peptide di membrana: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57904/57904eq1.jpg"> Nota: L'intensità di fluorescenza in ROI 3 viene sottratto dall'intensità di fluorescenza in ROI 2 e ROI 1 per tenere conto di fluorescenza di fondo.</li>
</ol>

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<li>Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+electrophysiology+for+the+study+of+bacterial+ion+channels+in+giant+spheroplasts+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli.</a> Biophys J. 111 (1), 132-139 (2016).</li>
<li>Xie, Y., Fleming, E., Chen, J. L., Elmore, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+proline+position+on+the+antimicrobial+mechanism+of+buforin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Effect of proline position on the antimicrobial mechanism of buforin II.</a> Peptides. 32 (4), 677-682 (2011).</li>
<li>Kobayashi, S., Takeshima, K., Park, C. B., Kim, S. C., Matsuzaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+the+Novel+Antimicrobial+Peptide+Buforin+2+with+Lipid+Bilayers%3A+Proline+as+a+Translocation+Promoting+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Interactions of the Novel Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Lipid Bilayers: Proline as a Translocation Promoting Factor.</a> Biochem. 39 (29), 8648-8654 (2000).</li>
<li>Decad, G. M., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+Membrane+of+Gram-Negative+Bacteria+XII.+Molecular-Sieving+Function+of+Cell+Wall%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Outer Membrane of Gram-Negative Bacteria XII. Molecular-Sieving Function of Cell Wall.</a> J. Bacteriol. 128 (1), 325-336 (1976).</li>
<li>Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell%2C+real-time+detection+of+oxidative+stress+induced+in+Escherichia+coli+by+the+antimicrobial+peptide+CM15%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in Escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), E303-E310 (2015).</li>
<li>Yang, Z., Choi, H., Weisshaar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melittin-Induced+Permeabilization%2C+Re-sealing%2C+and+Re-permeabilization+of+E.+coli+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Melittin-Induced Permeabilization, Re-sealing, and Re-permeabilization of E. coli Membranes.</a> Biophys J. 114 (2), 368-379 (2018).</li>
<li>Ruthe, H. J., Adler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+bacterial+spheroplasts+by+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Fusion of bacterial spheroplasts by electric fields.</a> Biochim. Biophys. Acta. 819 (1), (1985).</li>
</ol>

Non vengono dichiarati conflitti di interesse.

I protocolli qui presentati rendono fattibile per i ricercatori per ottenere più rapidamente più grandi dimensioni del campione di immagini batteriche perché i batteri allargati, sferici sono molto più facili da individuare, orientare e dell'immagine. Questa maggiore capacità di raccogliere dati è utile sotto diversi aspetti. In primo luogo, consente un'analisi quantitativa più sistematica dei modelli di localizzazione del peptide. Mentre le tendenze qualitative possono essere dimostrate da più piccoli insiemi di immagin...

Peptidi antimicrobici (amp) hanno guadagnato l'attenzione a causa del loro potenziale utilizzo in alternativa agli antibiotici convenzionali1,2,3,4,5. Amplificatori per uccidono i batteri sia dispostamento attraverso la membrana cellulare e interagendo con componenti intracellulari quali gli acidi nucleici o di permeabilizing la membrana provocando perdite di cella contenuto6. Oltre al loro uso come antibiotici, dispostamento amplificatori può essere adattato per le applicazioni di consegna di droga perché essi senza interruzioni possono attraversare la membrana cellulare impermeabile7,8. Di conseguenza, cerchiamo di capire i meccanismi di azione di gettare le basi per il loro uso nel disegno della droga fondamentali-AMP.
Microscopia confocale offre un modo per valutare i modelli di localizzazione degli amplificatori fluorescente identificati nelle cellule batteriche fornendo intuizioni loro meccanismo di azione9,10,11,12, 13 , 14. identificando la membrana dei batteri, si può determinare se un peptide fluorescente contrassegnato si localizza la membrana o spazio intracellulare di una cellula batterica. Tuttavia, questa tecnica è limitata dalla piccola dimensione e rod forma di batteri, che possono rendere impegnativa a causa di limiti di risoluzione dei microscopi ottici convenzionali e l'orientamento variabile dei batteri sulla diapositiva15di imaging.
L'obiettivo del metodo presentato è quello di attivare la visualizzazione avanzata dei modelli di localizzazione del peptide fluorescente identificati usando la microscopia confocal. Visualizzazione è migliorato girando la piccola, sottile, a forma di bastoncello gram-negativi Escherichia coli (Escherichia coli) e Gram-positivo Bacillus megaterium (b. megaterium) batteri in forme sferiche, allargate indicato come Sferoplasti (per ceppi gram-negativi) e protoplasti (per ceppi gram-positivi)16,17,18,19,20,21. Sferoplasti e protoplasti sono più facili da immagine a causa della loro maggiore dimensione sia loro forma simmetrica, che rende l'orientamento di un batterio su un vetrino irrilevante per la sua rappresentazione. Inoltre, vi presentiamo un approccio sistematico per analizzare quantitativamente dati di microscopia confocale per caratterizzare AMPs come entrambi membrana localizzazione o dispostamento. L'applicazione di questi metodi rende più facile distinguere fluorescente etichettati modelli di localizzazione del peptide. I protocolli presentati qui possono essere utilizzati per valutare la localizzazione di una varietà di agenti di membrana-attivo diverso da AMPs, compresi peptidi cellula-penetrante.
Un vantaggio di questa tecnica è che esso fornisce il meccanismo di azione degli amplificatori: approfondimenti a livello di singola cellula, che può rivelare la cellula--cellula eterogeneità15, al contrario di altre analisi di fluorescenza comunemente utilizzato per identificare il meccanismi di azione degli amplificatori, che forniscono soltanto alla rinfusa stime9,22,23,24,25. L'uso di Sferoplasti e protoplasti al fine di valutare la voce di cella AMP è utile particolare26 perché sono più fisiologicamente rilevanti15 rispetto ad altri modelli utilizzati per la valutazione della voce di cella, ad esempio di vescicole lipidiche24.

<table><tbody><tr><td>Idrocloruro di Trizma (Tris HCl)</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Base di Trizma (Tris OH)</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima</td><td></td><td>Sigma L6876</td><td></td></tr><tr><td>Desossiribonucleasi I</td><td>Sigma</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico</td><td>Sigma</td><td>106361</td><td>Utilizzato Sigma 106361 nello sviluppo del protocollo originale; 106361 interrotto con ED2SS in sostituzione</td></tr><tr><td>Cephalexin idrato</td><td>Sigma</td><td>C4895</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760</td><td></td></tr><tr><td>BBL Tripticasi brodo di soia</td><td>Fisher Scientific</td><td>B11768</td><td></td></tr><tr><td>BF2 P11A FITC</td><td>NeoScientific</td><td>Ordinato</td><td></td>su misura</tr><tr><td>di-8-ANEPPS</td><td>Biotium</td><td>61012</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>34869</td><td>Utilizzato Sigma D8779 nello sviluppo del protocollo originale; D8779 fuori produzione con 34869 come sostituzione</td></tr><tr><td>Acido maleico</td><td>Sigma</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc 25 mm Filtro siringa con 0,2 &mu; m HT Tuffryn Membrane</td><td>Pall Corporation</td><td>4192</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale a scansione laser</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5 II</td><td>Per l'acquisizione di immagini</td></tr><tr><td>Leica Application Suite, Fluorescenza avanzata</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Per l'elaborazione di immagini</td></tr></tbody></table>

produzione e visualizzazione di sferoplasti batteriche e protoplasti di caratterizzare peptide antimicrobico localizzazione

Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

L'uso della microscopia confocale come un metodo per valutare i modelli di localizzazione del peptide all'interno batteri comunemente è inibita dai limiti della risoluzione dei microscopi ottici convenzionali. Come la risoluzione di un microscopio dato non può essere facilmente migliorata, vi presentiamo protocolli per trasformare la piccola a forma di bastoncello gram-negativi Escherichia coli (Escherichia coli) e Gram-positivo Bacillus megaterium (b. megaterium) in forme sferiche più grandi, facilmente imaged chiamarono Sferoplasti o protoplasti. Questa trasformazione permette agli osservatori di rapidamente e chiaramente determinare se peptidi presentare se stessi nella membrana batterica (cioè, localizzazione di membrana) o attraversano la membrana per entrare nella cellula (cioè, dispostamento). Con questo approccio, inoltre presentiamo un metodo sistematico per caratterizzare i peptidi come membrana localizzazione o dispostamento. Mentre questo metodo può essere utilizzato per una varietà di peptidi attivi di membrana e ceppi batterici, dimostriamo l'utilità del presente protocollo osservando l'interazione di Buforin II P11A (BF2 P11A), un peptide antimicrobico (AMP), con e. coli Sferoplasti e b. megaterium protoplasti.

Ingrandendo i batteri e rendendoli sferica, possiamo distinguere facilmente se peptidi si localizzano la membrana batterica o traslocano facilmente attraverso la membrana batterica. I limiti di risoluzione dei microscopi ottici convenzionali rendono difficile distinguere se peptide segnali derivano dalla membrana o spazio intracellulare in batteri normali perché segnali localizzati alla membrana apparirà a sovrapporsi con la spazio intracellulare (Figura 3A)....

Qui presentiamo un protocollo per produrre gram-negativi Escherichia coli (Escherichia coli) Sferoplasti e Gram-positivo Bacillus megaterium (b. megaterium) protoplasti di visualizzare chiaramente e rapidamente caratterizzare interazioni del peptide-batteri. Questo fornisce un metodo sistematico per definire membrana localizzazione e dispostamento peptidi.

Produzione e visualizzazione di Sferoplasti batteriche e protoplasti di caratterizzare Peptide antimicrobico localizzazione

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dei peptidi antimicrobici sul fatto che i peptidi si localizzino o si traslocino attraverso la membrana cellulare. L'uso di sferoplasti e protoplasti consente la visualizzazione e l'analisi della localizzazione dei peptidi in un sistema modello fisiologicamente rilevante senza le sfide di risoluzione incontrate con l'imaging cellulare batterico. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui peptidi antimicrobici, può essere applicato anche ad altri agenti attivi di membrana come i peptidi che penetrano nelle cellule.Gli sferoplasti di E.coli Gram-negativi e i protoplasti di B.megaterium Gram-positivi devono essere preparati in una cappa di sicurezza biologica o in una cappa a flusso laminare utilizzando un'appropriata tecnica sterile. Se lo si desidera, i ceppi batterici possono contenere un plasmide resistente agli antibiotici e gli sferoplasti e i protoplasti possono essere preparati su un banco di laboratorio aperto. In questo video gli sferoplasti e i protoplasti vengono preparati su un banco di laboratorio aperto utilizzando ceppi batterici resistenti agli antibiotici.Per impostare una coltura notturna, u

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Visualizzazione delle risposte tossina batterica provocata con diretta microscopia a fluorescenza cellulare

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Preparazione di E. coli Spheroplasts

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Generazione di protoplasti dal batterio Gram-positivo Bacillus megaterium

Fonte: Bratton, B. P., et al., Imaging tridimensionale delle cellule batteriche per rappresentazioni cellulari accurate e localizzazione precisa delle proteine. J. Vis. Esp. (2019)Questo video dimostra il metodo per acquisire e analizzare immagini di fluorescenza tridimensionali delle cellule batteriche per studiare l'organizzazione delle proteine a livello di singola cellula.

Visualizzazione della distribuzione delle proteine batteriche in tre dimensioni tramite imaging a fluorescenza

Fonte: Figueroa, D. et al. Produzione e visualizzazione di sferoplasti e protoplasti batterici per caratterizzare la localizzazione dei peptidi antimicrobici. J. Vis. Esp. (2018).Questo video mostra la preparazione degli sferoplasti da batteri gram-negativi a forma di bastoncello. I batteri si sviluppano in presenza di un antibiotico per formare filamenti allungati. Questi vengono lavati con una soluzione ipertonica e trattati con un tampone di lisi per rimuovere la parete cellulare esterna. Il...

Generazione di sferoplasti da batteri gram-negativi

Il protocollo presenta l' Escherichia coli-base pressione selettiva incorporazione degli aminoacidi non canonico (ncAAs) il lactococcal peptide antimicrobico nisina. Le proprietà possono essere modificate durante l'espressione ricombinante tramite sostituzione con ncAAs desiderata in media di sviluppo definito. Conseguenti variazioni bioattività sono mappati da saggi di inibizione di crescita e microscopia a fluorescenza.

Peptidi antimicrobici prodotte dalla pressione selettiva incorporazione di aminoacidi Non canonico

Approcci basati sulla proteina fluorescenti per monitorare gli effettori secernuti dai batteri nelle cellule ospiti sono impegnativi. Ciò è dovuto all'incompatibilità tra proteine fluorescenti e il sistema di secrezione di tipo III. Qui, un sistema GFP superfolder ottimizzato split viene utilizzato per la visualizzazione degli effettori secernuta dai batteri nella cellula della pianta ospite.

Proteina fluorescente verde sistema di visualizzare gli effettori consegnati dai batteri durante l'infezione Split

Gli antibiotici fluorescenti etichettati con fluorescente sono potenti strumenti che possono essere utilizzati per studiare molteplici aspetti della resistenza agli antimicrobici. Questo articolo descrive la preparazione di antibiotici fluorescenti con tag e la loro applicazione allo studio della resistenza agli antibiotici nei batteri. Le sonde possono essere utilizzate per studiare i meccanismi di resistenza batterica (ad esempio, l'efflusso) mediante spettrofotometria, citometria di flusso e...

Visualizzazione della resistenza batterica utilizzando sonde antibiotici fluorescenti

Il presente protocollo descrive un metodo dettagliato per la produzione batterica di proteine ricombinanti, comprese proteine tipicamente insolubili o contenenti disolfuro, confezionate all'interno di vescicole extracellulari legate alla membrana. Ciò ha il potenziale per essere applicato a settori versatili della ricerca scientifica, tra cui la biotecnologia applicata e la medicina.

Produzione e analisi ottimizzate di vescicole ricombinanti piene di proteine da E. coli

In questo articolo, descriviamo una procedura che consente il rilevamento a livello di organo di batteri patogeni durante l'infezione e la quantificazione delle attività del reporter fluorescente.

Tomografia tridimensionale tridimensionale ad alta risoluzione di infezioni microbiche

Questo protocollo descrive un metodo per produrre e valutare l'attività antimicrobica e la citotossicità del peptide cationico Mel4 e del mimetico dei peptidi RK758. Integrando sintesi chimica, espressione ricombinante e saghi funzionali standardizzati, fornisce un flusso di lavoro semplificato per la produzione e il test di peptidi e mimetici di piccole molecole.

Produzione e test di peptidi antimicrobici e dei loro mimetici

Scopri come produrre sferoplasti di E. coli e protoplasti di B. megaterium per visualizzare la localizzazione dei peptidi antimicrobici. Questo metodo consente di studiare le interazioni peptide-batteri con maggiore chiarezza.

Produzione e visualizzazione di Sferoplasti batteriche e protoplasti di caratterizzare Peptide antimicrobico localizzazione

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