Produzione e visualizzazione di Sferoplasti batteriche e protoplasti di caratterizzare Peptide antimicrobico localizzazione

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dei peptidi antimicrobici sul fatto che i peptidi si localizzino o si traslocino attraverso la membrana cellulare. L'uso di sferoplasti e protoplasti consente la visualizzazione e l'analisi della localizzazione dei peptidi in un sistema modello fisiologicamente rilevante senza le sfide di risoluzione incontrate con l'imaging cellulare batterico. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui peptidi antimicrobici, può essere applicato anche ad altri agenti attivi di membrana come i peptidi che penetrano nelle cellule.

Gli sferoplasti di E.coli Gram-negativi e i protoplasti di B.megaterium Gram-positivi devono essere preparati in una cappa di sicurezza biologica o in una cappa a flusso laminare utilizzando un'appropriata tecnica sterile. Se lo si desidera, i ceppi batterici possono contenere un plasmide resistente agli antibiotici e gli sferoplasti e i protoplasti possono essere preparati su un banco di laboratorio aperto. In questo video gli sferoplasti e i protoplasti vengono preparati su un banco di laboratorio aperto utilizzando ceppi batterici resistenti agli antibiotici.

Per impostare una coltura notturna, utilizzare una punta per micropipetta sterile per trasferire una singola colonia batterica da una piastra di coltura di agar solida a una provetta di coltura da 14 millilitri, contenente da due a tre millilitri di brodo di soia tripticasi al tre percento, TSB, per un'incubazione da 16 a 21 ore a 37 gradi Celsius con agitazione. Per preparare gli sferoplasti di E.coli Gram-negativi, diluire la coltura notturna in un rapporto da uno a 100 e 25 millilitri di TSB in un pallone da 250 millilitri e rimettere i batteri nell'incubatore agitatore per altre 2,5 ore. Quando la soluzione ha raggiunto una densità ottica da 0,5 a 0,8 a 600 nanometri, diluire la coltura in un rapporto di uno a dieci in TSB fresco in un nuovo pallone da 250 millilitri per una seconda incubazione di 2,5 ore con una concentrazione efficace finale di 60 microgrammi per millilitro di cefalexina.

Per produrre filamenti a singola cellula di circa 50-150 micrometri di lunghezza, visualizzati al microscopio ottico con un ingrandimento di 1000x. Centrifugare la soluzione batterica per raccogliere i filamenti e travasare il surnatante. Lavare i filamenti con l'aggiunta delicata di un millilitro di saccarosio 0,8 molare, facendo attenzione a non disturbare il pellet.

Dopo un minuto, scartare il surnatante senza disturbare il pellet e aggiungere ai filamenti i reagenti indicati nel loro rispettivo ordine. Dopo dieci minuti a temperatura ambiente, aggiungere gradualmente un millilitro di soluzione A nell'arco di un minuto, agitando delicatamente la soluzione a mano. Incubare la soluzione per quattro minuti a temperatura ambiente, quindi dividere la sospensione filamentosa in due aliquote uguali tra due provette coniche da 15 millilitri contenenti sette millilitri di soluzione a quattro gradi Celsius B.Successivamente, pellettare i filamenti mediante centrifugalizzazione e utilizzare la pipetta assiriologica per rimuovere con cura tutti tranne uno o due millilitri del surnatante senza disturbare i pellet.

Utilizzare una micropipetta p1000 per risospendere delicatamente i pellet. Controllare una piccola aliquota del campione per la formazione di sferoplasti mediante microscopia ottica. Lo sferoplasto può quindi essere conservato a meno 20 gradi Celsius per un massimo di una settimana o fino a quando non ha attraversato tre cicli di gelo e scongelamento.

Per preparare protoplasti di B.megaterium Gram-positivi, diluire la coltura batterica notturna in un rapporto da uno a 1000 in 100 millilitri di TSB al tre percento in un pallone da 250 millilitri per un'incubazione di 4,5 ore a 37 gradi Celsius con agitazione. Quando la coltura liquida raggiunge una densità ottica da 0,9 a 1,0 a 600 nanometri, dividere i batteri in due provette coniche da 50 millilitri per la loro centrifugazione e utilizzare una pipetta assiriologica per esasperare i surnatanti. Risospendere i pellet in 2,5 millilitri di terreno protoplastico per provetta e tirare la sospensione in un singolo tubo conico per la coltura in un pallone da 125 millilitri.

Aggiungere un millilitro di cinque milligrammi per millilitro di lisozima alla coltura per un'incubazione di un'ora a 37 gradi Celsius con agitazione. Monitorando la crescita del protoplasto al microscopio ottico e notando eventuali irregolarità, come i batteri che appaiono come bastoncelli gonfi invece che sfere. Al termine dell'incubazione, trasferire la sospensione in una provetta conica da 15 millilitri per la centrifugazione e risospendere il pellet in cinque millilitri di terreno protoplasto.

Il protoplasto può quindi essere conservato a meno 20 gradi Celsius per un massimo di una settimana o fino a quando non sono stati sottoposti a tre cicli di gelo e scongelamento. Per la visualizzazione dello sferoplasto o del protoplasto, trasferire cinque microlitri della sospensione di interesse su un vetrino rivestito di poli L lisina, seguiti da due microlitri di peptide antimicrobico o AMP marcato con fitc da 100 a 200 micromolari. Dopo un'incubazione di tre minuti, al riparo dalla luce, aggiungere al campione un microlitro di una matrice a membrana appropriata per un'altra incubazione di tre minuti al buio.

Al termine dell'incubazione coprire lo spheroplast o protoplast etichettato con un vetrino coprioggetti e sigillare il vetrino coprioggetti con lo smalto. Per visualizzare le cellule, accendere il microscopio confocale e il laser appropriato e selezionare l'obiettivo 63x, quindi utilizzare il software di imaging appropriato per ottenere immagini composite Z stack a otto bit 512 per 512 composte da fette di 0,5 micrometri dell'intera cellula batterica di interesse. Per visualizzare la localizzazione dell'AMP marcato in fluorescenza, aprire le immagini composite dello stack Z in un programma di analisi di imaging appropriato e localizzare la fetta più centrale del primo sferoplasto o protoplasto di interesse.

Posizionare una regione circolare di interesse di 0,3 micrometri di diametro sulla membrana, una al centro della cellula e una lontana dalla cellula per misurare la fluorescenza di fondo, facendo attenzione a evitare pixel saturi. L'intensità media della fluorescenza in ciascuna regione di interesse può quindi essere calcolata dal software. I limiti di risoluzione dei microscopi ottici convenzionali rendono difficile distinguere se i segnali peptidici marcati in fluorescenza provengono dalla membrana o dallo spazio intracellulare nei batteri normali.

Man mano che i segnali si localizzano sulla membrana sembrerà sovrapporsi allo spazio intracellulare. Al contrario, le dimensioni ingrandite dello sferoplasto e del protoplasto rispetto ai batteri normali, si traduce in una chiara risoluzione tra il marcatore di membrana e lo spazio intracellulare. Facilitando la distinzione della localizzazione dei peptidi.

Ad esempio, la localizzazione sulla membrana e la traslocazione attraverso la membrana cellulare di peptide marcato in fluorescenza possono essere visualizzate sia in E.coli spheroplast che in B.megaterium protoplast, mediante microscopia a fluorescenza confocale, come appena dimostrato. Il posizionamento delle regioni di interesse sulla membrana e sullo spazio intracellulare dello sferoplasto o protoplasto e sullo sfondo, consente di calcolare il rapporto tra l'intensità della fluorescenza peptidica intracellulare e l'intensità della fluorescenza peptidica sulla membrana di ogni sferoplasto o protoplasto che interagisce con l'AMP. Ad esempio, questo metodo può essere utilizzato per visualizzare le interazioni di un mutante di peptidi microbici derivato dall'istone con E.coli spheroplast e protoplasti di B.megaterium.

In questo esperimento, l'AMP ha dimostrato un modello di localizzazione simile in entrambi i ceppi di batteri. Evidenziando la sua ridotta traslocazione rispetto al peptide wild type. In definitiva, questa tecnica consente ai ricercatori di esplorare i modelli di localizzazione dei peptidi a livello di singola cellula.

Offrire approfondimenti sul meccanismo d'azione di un peptide di interesse. Oltre a consentire ai ricercatori di raccogliere un numero maggiore di immagini per la caratterizzazione sistematica dei meccanismi peptidici, le immagini di sferoplasti e protoplasti più grandi sono più gestibili per l'analisi quantitativa rispetto a quelle di cellule batteriche più piccole.