Biologia di sintesi
Questo video presenta la biologia sintetica e il suo ruolo nella bioingegneria. La biologia sintetica si riferisce ai metodi utilizzati per modificare…
La biologia sintetica è un campo che combina biologia e ingegneria per creare o riprogettare entità biologiche, organismi o percorsi. L'idea è simile alla sintesi chimica in chimica in cui reazioni ben note vengono utilizzate per sintetizzare nuovi composti chimici. L'obiettivo finale può variare dalla creazione di nuove molecole di farmaci biologici alla modifica degli organismi per renderli in grado di abbattere i rifiuti. Questo video discute i principi di base della biologia sintetica e alcune tecniche utilizzate per costruire moduli biologici. Infine, presentiamo alcune applicazioni del mondo reale di questo campo in evoluzione.
L'obiettivo primario di questo campo emergente è quello di utilizzare la biologia e la bioingegneria come strumento per creare nuove molecole e organismi. Proprio come un ingegnere elettrico che crea un circuito funzionale da singoli componenti elettrici, un obiettivo chiave della biologia sintetica è quello di creare un microrganismo programmabile da zero utilizzando singoli componenti cellulari. Tuttavia, questo è ancora lontano dall'essere realizzabile a questo punto, principalmente perché i processi biologici sono meno compresi. Questo obiettivo è reso più raggiungibile dai recenti progressi, come il sequenziamento del DNA di prossima generazione. Utilizzando il sequenziamento del DNA, i ricercatori possono identificare le funzioni nei geni specifici della sequenza del DNA in organismi che possiedono determinati tratti desiderabili. Quindi, l'esatta sequenza di DNA può essere sintetizzata in grandi quantità e quindi utilizzata per modificare geneticamente una cellula usando la trasfezione. La trasfezione è il processo di inserimento di materiale genetico, come DNA o RNA, nelle cellule di mammifero. Quando viene eseguita su cellule batteriche, la tecnica è chiamata trasformazione. In questo processo, il DNA viene spesso complessato con molecole portanti caricate positivamente o condensato all'interno di un liposoma o di una particella polimerica caricata positivamente, come la polietilenimmina. Il complesso caricato positivamente si attacca alla membrana cellulare caricata negativamente e quindi entra nella cellula tramite endocitosi, che è un processo attraverso il quale le molecole entrano in una cellula attraverso vescicole legate alla membrana chiamate endosomi. Una volta all'interno della cellula, il materiale genetico lascia l'endosoma e alla fine entra nel nucleo, dove il macchinario della cellula è in grado di produrre MRNA e quindi proteine da esso. Ora che abbiamo introdotto le basi della biologia sintetica, diamo un'occhiata ad alcune tecniche di trasfezione comunemente utilizzate in laboratorio.
L'elettroporazione è una tecnica che prevede l'uso di un elettrodo per creare piccoli pori nella membrana cellulare, consentendo così al DNA di passare. In primo luogo, il fondo di ogni pozzetti di una piastra da 48 pozzetti è rivestito con 250 microlitri di anticorpi e tampone con calcio e magnesio. Le piastre vengono quindi incubate a 37 gradi. Successivamente, l'RNA viene preparato per la trasfezione. Un microlitro di soluzione madre di RNA viene aliquotato in un tubo di microcentifuga per ogni trasfezione separata, con i tubi che rimangono sul ghiaccio. Le piastre rivestite di anticorpi vengono quindi lavate con tampone prima che venga aggiunto il mezzo cellulare. Le cellule vengono staccate dal fondo dei pozzi di coltura tissutale, raggruppate in un tubo di centrifuga, pellettate e ricaspendate. Le cellule vengono contate e la loro vitalità valutata. Quindi, un piccolo volume di cellule viene aggiunto a ciascuna aliquota di RNA. Le cellule in RNA vengono quindi caricate in una punta dell'elettrodo della pipetta e nel tampone elettrolitico aggiunto a una cuvetta di vetro. La cuvetta viene posizionata all'interno del supporto e l'elettrodo della pipetta inserito nella cuvetta. Le celle sono elettroporate utilizzando una tensione pulsata di circa 1500 volt. Dopo che l'elettroporazione è completa, le cellule vengono mescolate con i mezzi di coltura cellulare in una piastra di coltura e utilizzate o conservate.
Un'altra tecnica è il metodo dello shock termico, che utilizza il calore per creare aperture nella membrana cellulare. In primo luogo, i supporti e l'agar appropriati vengono preparati e sterilizzati. Quindi, l'agar raffreddato contenente antibiotico viene versato in piastre e lasciato raffreddare a temperatura ambiente. Successivamente, un bagno d'acqua è impostato a 42 gradi Celsius e le cellule chimicamente competenti scongelate sul ghiaccio. Da uno a cinque microlitri di un nanogrammo per microlitro di plasmide freddo vengono aggiunti alle cellule scongelate e mescolati delicatamente. Quindi la miscela di cellule e plasma viene restituita al ghiaccio per 30 minuti. Dopo questa incubazione su ghiaccio, la miscela cellulare viene posta nel bagno d'acqua per riscaldarla per 30 secondi. La miscela di cellule e plasmidi viene quindi immediatamente posta su ghiaccio e viene aggiunto un mezzo fresco. Quindi la miscela cellulare viene posta in un incubatore vibrante a 37 gradi Celsius per un'ora, in modo che le cellule possano recuperare. Successivamente le cellule vengono coltivate sulle piastre di agar aggiungendo da 20 a 200 microlitri dei batteri coltivati alla piastra e quindi diffondendosi. Le piastre vengono quindi incubate durante la notte. Il giorno seguente, le placche di agar dovrebbero avere una crescita della colonia che indica che le cellule hanno assorbito il plasmide. Queste colonie possono ora essere utilizzate per ulteriori sperimentazioni.
Ora che abbiamo introdotto alcuni metodi comuni di trasfezione e trasformazione, diamo un'occhiata ad alcune applicazioni di questo nuovo campo. I batteri geneticamente modificati potrebbero essere utilizzati per la pulizia ambientale come il degrado dei residui di olio. Utilizzando tecniche di biologia sintetica, organismi personalizzati potrebbero essere progettati per abbattere specifici inquinanti ambientali. Ciò potrebbe comportare costi di pulizia inferiori rispetto ai tipici metodi di pulizia ad alta intensità di manodopera. Sistemi biologici a scala molecolare sinteticamente costruiti potrebbero anche essere creati per diagnosticare e trattare malattie specifiche come il cancro. Questi organismi potrebbero essere creati per rispondere alle firme caratteristiche o agli anticorpi delle cellule tumorali. Inoltre, potrebbero aiutare nel trattamento delle cellule infette mediante targeting programmato.
Hai appena visto l'introduzione di Jove alla biologia sintetica. Ora dovresti avere familiarità con gli obiettivi di questo nuovo campo e alcune tecniche utilizzate per migliorare e alla fine creare organismi per combattere gli attuali problemi del mondo. Grazie per l'attenzione.
La biologia sintetica è un campo che combina biologia e ingegneria per creare o riprogettare entità biologiche, organismi o percorsi. L'idea è simile alla sintesi chimica in chimica, dove reazioni ben note vengono utilizzate per sintetizzare nuovi composti chimici. L'obiettivo finale può variare dalla creazione di nuove molecole di farmaci biologici alla modifica degli organismi per renderli in grado di abbattere i rifiuti. Questo video discute i principi di base della biologia sintetica e alcune tecniche utilizzate per costruire moduli biologici. Infine, presentiamo alcune applicazioni nel mondo reale di questo campo in evoluzione.
L'obiettivo primario di questo campo emergente è quello di utilizzare la biologia e la bioingegneria come strumento per creare nuove molecole e organismi. Proprio come un ingegnere elettrico che crea un circuito funzionale da singoli componenti elettrici, un obiettivo chiave della biologia sintetica è quello di creare un microrganismo programmabile da zero utilizzando singoli componenti cellulari. Tuttavia, questo è ancora lontano dall'essere realizzabile a questo punto, principalmente perché i processi biologici sono meno compresi. Questo obiettivo è reso più raggiungibile dai recenti progressi, come il sequenziamento del DNA di nuova generazione. Utilizzando il sequenziamento del DNA, i ricercatori possono identificare le funzioni nei geni specifici della sequenza di DNA negli organismi che possiedono determinati tratti desiderabili. Quindi, l'esatta sequenza di DNA può essere sintetizzata in grandi quantità e quindi utilizzata per modificare geneticamente una cellula utilizzando la trasfezione. La trasfezione è il processo di inserimento di materiale genetico, come DNA o RNA, nelle cellule di mammifero. Quando viene eseguita su cellule batteriche, la tecnica è chiamata trasformazione. In questo processo, il DNA viene spesso complessato con molecole trasportatrici caricate positivamente o condensato all'interno di un liposoma caricato positivamente o di una particella polimerica, come la polietilenimmina. Il complesso caricato positivamente si attacca alla membrana cellulare caricata negativamente e quindi entra nella cellula tramite endocitosi, che è un processo mediante il quale le molecole entrano in una cellula attraverso "vescicole legate alla membrana" chiamate endosomi. Una volta all'interno della cellula, il materiale genetico lascia l'endosoma e alla fine entra nel nucleo, dove il macchinario della cellula è in grado di produrre MRNA e quindi proteine da esso. Ora che abbiamo introdotto le basi della biologia sintetica, diamo un'occhiata ad alcune tecniche di trasfezione comunemente utilizzate in laboratorio.
L'elettroporazione è una tecnica che prevede l'uso di un elettrodo per creare minuscoli pori nella membrana cellulare, consentendo così il passaggio del DNA. Innanzitutto, il fondo di ogni pozzetto di una piastra da 48 pozzetti viene rivestito con 250 microlitri di anticorpo e tampone con calcio e magnesio. Le piastre vengono quindi incubate a 37 gradi. Successivamente, l'RNA viene preparato per la trasfezione. Un microlitro di soluzione madre di RNA viene aliquotato in una provetta per microcentifugo per ogni trasfezione separata, con le provette che rimangono sul ghiaccio. Le piastre rivestite di anticorpi vengono quindi lavate con tampone prima dell'aggiunta del terreno cellulare. Le cellule vengono staccate dal fondo dei pozzetti di coltura tissutale, raggruppate in una provetta da centrifuga, pellettate e risospese. Le cellule vengono contate e la loro vitalità valutata. Quindi, un piccolo volume di cellule viene aggiunto a ciascuna aliquota di RNA. Le cellule nell'RNA vengono quindi caricate in una punta dell'elettrodo per pipetta e il tampone elettrolitico viene aggiunto a una cuvetta di vetro. La cuvetta viene posizionata all'interno del supporto e l'elettrodo della pipetta viene posizionato nella cuvetta. Le celle vengono elettroporate utilizzando una tensione pulsata di circa 1500 volt. Al termine dell'elettroporazione, le cellule vengono miscelate con terreni di coltura cellulare in una piastra di coltura e utilizzate o conservate.
Un'altra tecnica è il metodo dello shock termico, che utilizza il calore per creare aperture nella membrana cellulare. Innanzitutto, i terreni appropriati e l'agar vengono preparati e sterilizzati. Quindi, l'agar raffreddato contenente antibiotico viene versato in piastre e lasciato raffreddare a temperatura ambiente. Successivamente, un bagno d'acqua viene impostato a 42 gradi Celsius e le cellule chimicamente competenti vengono scongelate sul ghiaccio. Da uno a cinque microlitri di un nanogrammo per microlitro di plasmide freddo vengono aggiunti alle cellule scongelate e mescolati delicatamente. Quindi la miscela di cellule e plasma viene rimessa nel ghiaccio per 30 minuti. Dopo questa incubazione su ghiaccio, la miscela cellulare viene posta nel bagno d'acqua per uno shock termico per 30 secondi. La miscela di cellule e plasmidi viene quindi immediatamente posta su ghiaccio e viene aggiunto terreno fresco. Quindi la miscela di cellule viene posta in un incubatore ad agitazione a 37 gradi Celsius per un'ora, in modo che le cellule possano riprendersi. Successivamente, le cellule vengono coltivate sulle piastre di agar aggiungendo da 20 a 200 microlitri di batteri coltivati alla piastra e quindi diffondendole. Le piastre vengono quindi incubate durante la notte. Il giorno seguente, le piastre di agar dovrebbero avere una crescita di colonie che indica che le cellule hanno assorbito il plasmide. Queste colonie possono ora essere utilizzate per ulteriori esperimenti.
Ora che abbiamo introdotto alcuni metodi comuni di trasfezione e trasformazione, diamo un'occhiata ad alcune applicazioni di questo nuovo campo. I batteri geneticamente modificati potrebbero essere utilizzati per la pulizia ambientale come la degradazione dei residui di petrolio. Utilizzando tecniche di biologia sintetica, è possibile progettare organismi personalizzati per abbattere specifici inquinanti ambientali. Ciò potrebbe comportare costi di pulizia inferiori rispetto ai tipici metodi di pulizia ad alta intensità di lavoro. Si potrebbero anche creare sistemi biologici su scala molecolare costruiti sinteticamente per diagnosticare e trattare malattie specifiche come il cancro. Questi organismi potrebbero essere creati per rispondere alle firme caratteristiche o agli anticorpi delle cellule tumorali. Inoltre, potrebbero aiutare nel trattamento delle cellule infette con il targeting programmato.
Hai appena visto l'Introduzione di Giove alla biologia sintetica. Ora dovresti avere familiarità con gli obiettivi di questo nuovo campo e alcune tecniche utilizzate per migliorare e infine creare organismi per combattere gli attuali problemi del mondo. Grazie per l'attenzione.
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Q1: What is the main goal of synthetic biology?
Synthetic biology combines biology and engineering to create or redesign biological entities, organisms, or pathways. The primary objective is to use biology as a tool to create new molecules and organisms, similar to how an electrical engineer builds functional circuits from individual components. Researchers aim to create programmable microorganisms from scratch using individual cell components to solve real-world problems.
Q2: How does transfection differ from transformation in genetic modification?
Transfection is the process of inserting genetic material such as DNA or RNA into mammalian cells. When the same technique is performed on bacterial cells, it is called transformation. Both methods use positively charged carrier molecules or liposomes to deliver genetic material across the negatively charged cell membrane via endocytosis.
Q3: What happens during electroporation in the laboratory?
Electroporation uses an electrode to create tiny pores in the cell membrane, allowing DNA to pass through. Cells and RNA are loaded into a pipette electrode tip with electrolytic buffer in a glass cuvette. A pulsed voltage of approximately 1500 volts is applied to open the membrane temporarily. After electroporation, cells are mixed with culture media and either used or stored for further experimentation.
Q4: What are the key steps in the heat shock method for bacterial transformation?
The heat shock method begins with chemically competent cells thawed on ice and mixed with cold plasmid DNA. The mixture is incubated on ice for 30 minutes, then placed in a 42-degree Celsius water bath for 30 seconds. Cells are immediately returned to ice, fresh media is added, and the mixture is incubated at 37 degrees Celsius for one hour to allow recovery. Cells are then cultured on antibiotic-containing agar plates overnight to identify successful transformants.
Q5: How does DNA sequencing advance synthetic biology research?
DNA sequencing allows researchers to identify specific gene functions in organisms with desirable traits. Once identified, the exact DNA sequence can be synthesized in large amounts and used to genetically modify cells through transfection or transformation. This capability enables scientists to isolate and replicate beneficial genetic information, making it possible to engineer custom organisms for specific applications.
Q6: What are real-world applications of synthetic biology?
Synthetic biology has diverse applications including environmental cleanup, where genetically engineered bacteria break down oil residues and specific pollutants at lower costs than traditional labor-intensive methods. In medicine, synthetically constructed organisms can be engineered to diagnose and treat diseases like cancer by responding to cancer cell signatures and targeting infected cells for treatment. These engineered systems support upstream and downstream bioprocess engineering for scaled production.
Q7: How does genetic material enter the cell during transfection?
During transfection, DNA is complexed with positively charged carrier molecules or condensed within positively charged liposomes or polymer particles such as polyethyleneimine. The positively charged complex attaches to the negatively charged cell membrane and enters via endocytosis, a process using membrane-bound vesicles called endosomes. Once inside, genetic material leaves the endosome and enters the nucleus where cellular machinery produces mRNA and protein.