Name: Tessuto-specifici miRNA Expression Profiling in Mouse cuore sezioni mediante ibridazione In Situ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Scopri il profilo di espressione dei miRNA specifici per tessuto nelle sezioni cardiache di topo mediante ibridazione in situ combinata con immunofluorescenza. Questo metodo consente la rilevazione simultanea di microRNA e proteine nella stessa sezione.

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Vorremmo ringraziare Athanasios Papangelis, per osservazioni critiche sul manoscritto. FM è supportato dal Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC; BB/M009424/1). IP è supportato da American Heart Association scienziato Development Grant (17SDG33060002).

Campioni di tessuto di cuore di mouse per questo studio sono stati ottenuti in conformità con le leggi e le linee guida istituzionali e sono stati approvati dal comitato di uso e di Yale University istituzionale Animal Care.
1. soluzione preparazione
<ol><li>Preparare la RNasi free ddH2O, trattando 5L di ddH2O con 5 mL di 0,1% dietilpirocarbonato (DEPC) durante la notte (O/N), a temperatura ambiente (TA). Sterilizzare in autoclave (121 ° C) per disattivare il DEPC. Uso trattata DEPC ddH2O quello per la preparazione di soluzioni a valle come indicato. Attenzione: DEPC è un noto cancerogeno, gestire solo nella cappa.</li>
	<li>Preparare soluzione salina tampone fosfato (PBS) 1x sciogliendo 5 compresse di PBS in 1 L di DEPC-trattati ddH2O. Autoclave (121 ° C).</li>
	<li>Preparare 0,1% detergente non ionico/PBS (PBST) diluendo 1 mL di detergente non ionico per 1 L di PBS 1X.</li>
	<li>Preparare il 90%, 70%, 50% e 30% di etanolo in trattata DEPC ddH2O.</li>
	<li>Preparare un 10 mg/mL soluzione stock di proteinasi K (ProK) trattata DEPC ddH2O. aliquota e conservare a-20 ° C. Preparare una soluzione di lavoro μg/mL 20 di ProK di diluizione 100 μL di soluzione di riserva ProK in 50 mL di DEPC-trattati ddH2O. Make fresco prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare 4% paraformaldeide (PFA) aggiungendo 2 g di PFA in 50 mL di PBS 1X. Scaldare a 65 ° C con agitazione occasionale, fino a completa dissoluzione. Aliquotare e conservare a-20 ° C. Attenzione: PFA è un noto cancerogeno, gestire solo nella cappa.</li>
	<li>Preparare una soluzione di NaCl 3M aggiungendo 87,8 g a 500 mL di ddH2O. Autoclave (121 ° C).</li>
	<li>Preparare una soluzione di 1 M MgCl2 aggiungendo 20,3 g per 100 mL di ddH2O. Autoclave (121 ° C).</li>
	<li>Preparare 1 M Tris pH 8.0 di dissoluzione 121,1 g in 800 mL di ddH2O. regolare il pH a 8.0 con poche gocce di 1 N HCl, portare il volume a 1 L e autoclave (121 ° C). Preparare una soluzione di lavoro di 50 millimetri Tris pH 8.0 diluendo 2,5 mL di 1 M Tris pH 8.0 a 47,5 mL di ddH2O.</li>
	<li>Preparare 1 M Tris pH 9.5 di dissoluzione 60,6 g in 400 mL di ddH2O. regolare il pH a 9.5 con poche gocce di 1 N HCl, portare il volume a 500 mL e autoclave (121 ° C).</li>
	<li>Preparare 0,13 M 1-metilimidazolo pH 8.0 di diluzione 1.6 mL di 1-metilimidazolo a 130 mL di DEPC-trattati ddH2O. regolare il pH a 8.0 con circa 450 µ l di 12 N HCl. aggiungere 16 mL di 3 M di NaCl e portare il volume a 160 mL. Fare fresco prima dell'uso. Attenzione: 1-metilimidazolo è dannoso per la pelle, occhi e membrane mucose, gestire solo nella cappa.</li>
	<li>Preparare diluendo 176 µ l di EDC a 10 mL di 0,13 M 1-metilimidazolo 0,16 M N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide cloridrato (EDC). Regolare il pH a 8.0 con circa 100 µ l di 12 N HCl. fare fresco prima dell'uso. Attenzione: EDC è dannoso per la pelle, occhi e membrane mucose, gestire solo nella cappa.</li>
	<li>Preparare 1% H2O2 diluendo 1,5 mL di 30% H2O2 in 50 mL di 1X PBS. Fare fresco prima dell'uso.</li>
	<li>
Preparare 20 x SSC pH 7.0 sciogliendo 175,3 g di NaCl e 88,2 g di citrato di sodio (Na3C6H5O7) in 800 mL di ddH2O. regolare il pH a 7.0 con poche gocce di 1 N HCl, portare il volume a 1 L e autoclave (121 ° C).
	<ol>
<li>Preparare una soluzione di lavoro di 2 x SSC pH 7.0 diluendo 20 mL 20 x SSC pH 7.0 in 180 ml di ddH2O.</li>
		<li>Preparare una soluzione di lavoro di 1 x SSC pH 7.0 diluendo 2,5 mL di 20 x SSC pH 7.0 a 47,5 mL di ddH2O.</li>
		<li>Preparare una soluzione di 0,2 x SSC pH 7.0 diluendo 5 mL di 2 x SSC pH 7.0 in 45 mL di ddH2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare la soluzione di ibridazione: 1x diluendo 0,5 mL di tampone ISH x microRNA 2 in 0,5 mL di DEPC-trattati ddH2O. Make fresco prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare soluzione stock di 200 mM di Levamisole aggiungendo 250 mg a 5 mL di ddH2O. Aliquotare e conservare a-20 ° C.</li>
	<li>Preparare soluzione bloccante per passaggio 5 (10% pecora serum/1% BSA/0,2 mM levamisolo) diluire 1 mL di siero di pecora in 9 mL PBST e aggiungendo 0,1 g di BSA. Aggiungere 10 μL di Levamisole prima di utilizzare. Fare fresco prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare soluzione bloccante per passaggio 6 (10% capra serum/1% BSA) diluire 1 mL di siero di capra in 9 mL di PBST e aggiungendo 0,1 g di BSA. Conservare a 4 ° C e consumare entro una settimana.</li>
	<li>Preparare soluzione prestaining diluendo 3,3 mL di 3 M NaCl, 5 mL di 1 M MgCl2, 10 mL di 1 M Tris-HCl pH 9.5, 100 µ l di Tween-20, 100 µ l di Levamisole a 81,5 mL ddH2O. Make fresco prima dell'uso.</li>
	<li>Utilizzare del nitroblue (compresse di fosfato (BCIP) NBT)/5-bromo-4-chloro-3-indoly per preparare 20 mL di soluzione substrato fosfatasi alcalina (AP) secondo le istruzioni del produttore. Aggiungere 20 μL di Levamisole. Fare fresco prima dell'uso e proteggerlo dalla luce.</li>
	<li>Preparare la soluzione KTBT con l'aggiunta di 4 g di Tris, 4,4 g di NaCl e 375 mg di KCl in 500 mL di ddH2O. Autoclave (121 ° C).</li>
	<li>Opzionale: Preparare una soluzione di lavoro di DAPI (1 μg/mL) diluendo 50 μL di soluzione di riserva DAPI (1 mg/mL) in 50 mL di PBS 1X. Nota: Soluzioni Standard come 3 M di NaCl, 1 M MgCl2, 1 M Tris-HCl, ddH nuclease-Free2O, 1x PBS e 20 x SSC possono essere acquistati in alternativa. Per questo protocollo, 50 mL vetro Coplin vasetti o mailer in polipropilene diapositiva 20 mL sono stati utilizzati vasetti.</li>
</ol>2. tessuto preparazione
Nota: Le sezioni di cuore di topo usate qui sono state preparate dai servizi di Yale patologia del tessuto, dal tessuto formalina-fisso/paraffina-incastonato, tagliare a 5 μm e posizionate su slitte cariche.
<ol><li>
Reidratazione dei tessuti.
	<ol>
<li>Caldo le diapositive a 60 ° C per 10 min in forno ibridazione fino a paraffina visibilmente si sta sciogliendo.</li>
		<li>Incubare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di agente di compensazione commercialmente disponibili (Vedi Tabella materiali) per 10 minuti, due volte.</li>
		<li>Incubare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di etanolo al 100% per 2 minuti, due volte, seguito da 90% etanolo per 2 min, etanolo al 70% per 2 minuti, due volte, etanolo al 50% per 2 min e 30% etanolo per 2 min.</li>
		<li>Incubare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di DEPC-trattati ddH2O per 5 min.</li>
		<li>Incubare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di PBS 1X per 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tessuto de-proteinating.
	<ol>
<li>Incubare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di soluzione di lavoro ProK, a 37 ° C per 15 min in forno ibridazione 20 μg/mL. Attenzione: Sotto-digestione potrebbero poveri o nessun segnale di sviluppo, mentre la digestione eccessiva può provocare la degradazione del tessuto e lo sviluppo di una colorazione di fondo. Ottimizzazione può essere richiesto per questo passaggio (1 – 20 μg/mL ProK, incubazione di 5 – 20 min, RT-37 ° C).</li>
		<li>Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di PBS 1X per 5 min, a RT, due volte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fissazione del tessuto.
	<ol>
<li>Utilizzare una penna idrofobica per disegnare un cerchio idrorepellente intorno al tessuto su ogni diapositiva.</li>
		<li>Applicare 500 µ l di soluzione al 4% PFA per la lunghezza di ogni diapositiva e incubare i vetrini in posizione orizzontale per 10 min, a TA.</li>
		<li>Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di PBS 1X per 5 min, a RT, due volte.</li>
		<li>Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di 0,13 M 1-metilimidazolo per 10 min, a RT, due volte.</li>
		<li>Applicare 500 µ l di soluzione EDC 0,16 M la lunghezza di ogni diapositiva e incubare i vetrini in posizione orizzontale per 1h a RT, in una camera umidificata.</li>
		<li>Sciacquare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di 50 mM Tris-HCl pH 8.0 a TA.</li>
		<li>Sciacquare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di PBS 1X a RT, due volte. Nota: Sia PFA ed EDC fissazione passi sono necessari per la reticolazione di miRNA e non devono essere omesso. 31
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Blocco della perossidasi endogena.
	<ol>
<li>Incubare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di 1% H2O2 per 30 minuti a TA.</li>
		<li>Sciacquare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di PBS 1X a RT, due volte.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ibridazione
<ol><li>Preriscaldare la soluzione di ibridazione (500 µ l per vetrino) a 50 ° C nel forno di ibridazione, finché la temperatura di destinazione, è raggiungibile (10 – 15 minuti).</li>
	<li>Preparare la camera di ibridazione posizionando 2 pezzi di carta velina o di filtro nella parte inferiore dell'alloggiamento e bagnare la carta con 50% formammide/1 x SSC. Attenzione: Formammide è dannosa per le membrane mucose, occhi e pelle, unico manico nella cappa.</li>
	<li>Applicare 200 µ l di soluzione di ibridazione per la lunghezza di ogni diapositiva. Incubare i vetrini in posizione orizzontale per 1-3 h a 50 ° C, in una camera umidificata.</li>
	<li>Preparare la soluzione di sonda con sonda di 0,5 µ l stock (25 µM) in 250 µ l di soluzione ofhybridization (concentrazione finale di 50 nM) in una provetta da 1,5 mL. Nota: Diversi miRNA sono espressi a livelli diversi, ottimizzazione per quanto riguarda la concentrazione di sonda potrebbe essere necessaria per questo passaggio (1 – 50 nM) non evitare alcun segnale o sviluppo di alta priorità bassa.</li>
	<li>Applicare 250 µ l di soluzione della sonda per la lunghezza di ogni diapositiva e adagiarvi un coprioggetto gratis RNasi. Evitare la formazione di bolle.</li>
	<li>Accuratamente la camera di ibridazione con parafilm ed incubare O/N a 50 ° C. Nota: La temperatura di ibridazione deve essere impostata circa a 30 ° C sotto la temperatura di fusione di RNA (Tm) di ogni sonda. Ottimizzazione può essere richiesto. Qui, 50 ° C viene utilizzato come la temperatura di lavaggio/ibridazione di miRNA-182, regolare di conseguenza per diverse sonde.</li>
</ol>4. condizioni di stringenza lavaggi
<ol><li>Preriscaldare 200 mL di 2 x SSC a 50 ° C nel forno di ibridazione, fino a quando non viene raggiunta la temperatura di destinazione (20 – 40 min).</li>
	<li>Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di 2 x SSC a 50 ° C per 5 minuti, o fino a quando i coprioggetti allentare.</li>
	<li>Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di 2 x SSC a temperatura ambiente per 5 minuti, due volte.</li>
	<li>Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di 0.2 x SSC a RT per 5 min.</li>
	<li>Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di PBST presso RT per 5 min.</li>
	<li>Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di PBS 1X a RT per 5 min. Nota: Uso delle condizioni di RNAsi-libera non è più necessario poiché gli ibridi RNA-RNA sono considerati stabili.</li>
</ol>5. rilevazione dell'anticorpo di scavare
<ol><li>Utilizzare una penna idrofobica per ri-disegnare un cerchio idrorepellente intorno al tessuto su ogni diapositiva se necessario.</li>
	<li>Applicare 500 µ l di soluzione per la lunghezza di ogni diapositiva di blocco. Incubare i vetrini in posizione orizzontale per 30 min a RT, in una camera umidificata.</li>
	<li>Preparare la soluzione di anticorpo DIG (1:1, 000) diluendo 0,5 µ l di anticorpo DIG in 500 µ l di soluzione di ofblocking in una provetta da 1,5 mL. Attenzione: Ottimizzazione può essere richiesto per questo passaggio (1: 500 – 1:2, 000).</li>
	<li>Applicare 500 µ l di soluzione di anticorpo DIG per la lunghezza di ogni diapositiva. Incubare i vetrini in posizione orizzontale per 1h a RT, in una camera umidificata.</li>
	<li>Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di PBST presso RT per 5 min, tre volte.</li>
	<li>Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di prestaining soluzione a temperatura ambiente per 5 minuti, due volte.</li>
	<li>Incubare i vetrini in un barattolo di mailer in polipropilene diapositiva contenente soluzione di substrato UFAP 20 mL a 37 ° C, per 6-24 h, al riparo dalla luce. Attenzione: Lo sviluppo del colore deve essere controllato che ogni 2 h. ottimizzazione può essere richiesto per questo passaggio.</li>
	<li>Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di soluzione di KTBT a RT per 5 min, due volte.</li>
	<li>Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di PBS 1X a RT per 5 min.</li>
</ol>6. cTnT rilevazione dell'anticorpo
<ol><li>Utilizzare una penna idrofobica per ri-disegnare un cerchio idrorepellente intorno al tessuto su ogni diapositiva se necessario.</li>
	<li>Applicare 500 µ l di soluzione per la lunghezza di ogni diapositiva di blocco. Incubare i vetrini in posizione orizzontale per 1h a RT, in una camera umidificata.</li>
	<li>Preparare la soluzione di anticorpo cTnT (1: 100) diluendo 2 µ l di anticorpo cTnT in 200 μL di soluzione di ofblocking in una provetta da 1,5 mL.</li>
	<li>Applicare 200 µ l di soluzione di anticorpo cTnT alla lunghezza di ogni diapositiva. Incubare i vetrini orizzontalmente O/N a 4 ° C, in una camera umidificata.</li>
	<li>Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di PBS 1X a RT per 5 min, tre volte.</li>
	<li>Preparare la soluzione di anticorpo anti-coniugato-568 (1: 500) diluendo 0,5 µ l di anticorpo anti-coniugato-568 in 250 μL di soluzione di ofblocking in una provetta da 1,5 mL.</li>
	<li>Applicare 250 µ l di soluzione di anticorpo anti-coniugato-568 alla lunghezza di ogni diapositiva. Incubare i vetrini in posizione orizzontale per 1h a RT, in una camera umidificata.</li>
	<li>Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di PBS 1X a RT per 5 min, tre volte.</li>
	<li>Opzionale: Applicare 250 µ l di soluzione di lavoro di DAPI per la lunghezza di ogni diapositiva e incubare i vetrini in posizione orizzontale per 1 min a RT, al riparo dalla luce.</li>
	<li>Lavare i vetrini in una vaschetta di Coplin vetro contenente 50 mL di PBS 1X a RT per 5 min, due volte.</li>
</ol>7. montaggio e Imaging
<ol><li>Montare i vetrini con 2 – 3 gocce di mezzo di montaggio e un vetro vetrino coprioggetti. Lasciare i vetrini asciugare in piano, O/N, a 4 ° C, al riparo dalla luce.</li>
	<li>Procedere alla epifluorescente o microscopia confocale.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

rilevazione di miRNA trascrizione può essere raggiunto attraverso tecniche diverse che variano nella sensibilità, specificità e potere quantitativa. Qui, dimostriamo l'accoppiamento di miRNA ibridazione in situ con immunostaining e descrivere un protocollo che consente la valutazione simultanea dei livelli di espressione di miRNA e proteina molecole, le stesse sezioni di cuore. Abbiamo in primo luogo mostrano come eseguire ibridazione in situ di scavare-contrassegnato LNA miRNA sonde su sezioni di cuore...

micro-RNA (Mirna) è brevi (18 – 25 nucleotidi), singolo filamento, non codificanti RNA che fungono da regolatori negativi della espressione genica a livello post-trascrizionale inibendo la traduzione di RNA messaggero (mRNA) e/o promuovere la degradazione di mRNA 1. i miRNA sono trascritti da introni o essoni di codifica o di geni non codificanti e sono spaccati nel nucleo di DROSHA, al precursore Mirna (pre-miRNA), che sono strutture di breve gambo-ciclo di 70 nucleotidi2. Seguendo citoplasmico esportare, pre-miRNA vengono ulteriormente elaborati con DICER in Mirna maturi che si estendono su 18 – 25 nucleotidi3,4. Successivamente, il complesso di silenziamento indotto da RNA (RISC) incorpora questi miRNA come single-stranded RNA, che per il loro legame la regione 3' non tradotta (3'-UTR) del loro mRNA bersaglio consente di sopprimere la loro espressione3,5 .
Negli ultimi tre decenni, poiché in primo luogo sono stati identificati, Mirna sono emerse al Maestro regolatori dell'espressione genica, i cui livelli di espressione sono strettamente controllato6. Ruoli per i miRNA sono stati descritti in organo sviluppo7,8,9,10,11,12, mantenimento della omeostasi13,14 , così come contesti di malattia che includono neurologico15,16,17,18,19, cardiovascolare20, patologie autoimmuni21 ,22, cancri23,24e altri25. Il crescente apprezzamento per la rilevanza dei modelli di espressione di miRNA ha portato avanti la necessità di metodi di rilevazione affidabili delle trascrizioni di miRNA. Tali metodi includono la Real Time PCR, microarray, Northern Blotting, ibridazione in situ e altri, che variano per la sensibilità, la specificità e la potenza quantitativa, principalmente dovuto al fatto che miRNA trascrizioni sono costituite da brevi e sequenze altamente omologhe6.
Recentemente abbiamo segnalato un importante ruolo dei miRNA-182 nello sviluppo dell'ipertrofia del miocardio26, una condizione che descrive l'adeguamento strutturale del cuore in risposta a richieste emodinamiche elevati27,28. L'ipertrofia cardiaca è caratterizzata dall'aumento della massa miocardica, che, se associato con rimodellamento maladattativo29, può condurre al rischio aumentato per insufficienza cardiaca, una condizione pari al 8,5% di tutti i decessi attribuibili a cardiovascolare malattia30.
Qui, descriviamo il nostro protocollo che combina l'ibridazione in situ con sonda di acido nucleico (DIG) bloccato (LNA) e immunostaining per la rilevazione simultanea di miRNA e proteina molecole su sezioni di tessuto di cuore di topo, digoxigenin-labeled in nostro modello dell'ipertrofia cardiaca.

<table><tbody><tr><td>Dietilpirocarbonato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5758</td><td>DEPC</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Tensioattivo non ionico</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td></tr><tr><td>Histoclear</td><td>National Diagnostics</td><td>HS-200</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K, ricombinante, grado PCR Sigma</td><td>Aldrich</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>ProK Paraformaldeide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>PFA</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>ThermoFisher</td><td>S271</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato</td><td>ThermoFisher</td><td>M33</td><td>MgCl2</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di acido cloridrico, 1 N</td><td>ThermoFisher</td><td>SA48</td><td>HCl</td></tr><tr><td>Soluzione di acido cloridrico, 12 N</td><td>ThermoFisher</td><td>S25358</td><td>HCl</td></tr><tr><td>1-metilimidazolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>336092</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-Dimetilamminopropil)-N&prime;-etilcarbodiimmide cloridrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>39391</td><td>EDC</td></tr><tr><td>Soluzione di perossido di idrogeno H2O2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>216763</td><td>H2O2</td></tr><tr><td>Trisodium citrato diidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1804</td><td>Sodium Citrate</td></tr><tr><td>miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE)</td><td>Qiagen</td><td>339450</td><td>scramble miRNA/U6 snRNA</td></tr><tr><td>miRCURY LNA mmu-miR-182 sonda di rilevamento</td><td>QIagen</td><td>YD00615701</td><td>5'-DIG e 3'-DIG marcata</td></tr><tr><td>Levamisol cloridrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31742</td><td></td></tr><tr><td>Albumina di siero bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9647</td><td>BSA</td></tr><tr><td>NBT/BCIP Compresse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11697471001</td><td>NBT-BCIP</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>ThermoFisher</td><td>P217</td><td>KCl</td></tr><tr><td>DAPI soluzione (1mg/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>62248</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti</td><td>ThermoFisher</td><td>12-545E</td><td>Vetrino coprioggetti</td></tr> in <tr><td>plastica Grace</td><td>Bio-Labs</td><td>HS40 22mmX40mmX0.25mm</td><td>Vetrino coprioggetti in plastica senza RNA-asi</td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenina-AP, frammenti Fab Sigma</td><td>Aldrich</td><td></td><td>11093274910 Anticorpo DIG</td></tr><tr><td>Penna barriera idrofobica</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td>Pap pen</td></tr><tr><td>Anticorpo Troponina T anti-cardiaco</td><td>Abcam</td><td>ab92546</td><td>anticorpo cTnT</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario ad assorbimento incrociato IgG (H+L) anti-coniglio di capra, Alexa Fluor 568</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11011</td><td>anticorpo anti-coniglio-568</td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio a fluorescenza Dako</td><td></td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Siero di pecora</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3772</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Formamide deionizzata</td><td>americana Forno di</td> ibridazione <td>AB00600</td><td></td>bioanalitica</tr><tr><td></td><td>ThermoFisher</td><td>UVP HB-1000 Hybridizer</td><td></td></tr></tbody></table>

tessuto-specifici mirna expression profiling in mouse cuore sezioni mediante ibridazione in situ

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNA (Mirna) è trascritti di RNA singolo filamento che associare a RNA messaggeri (mRNA) e inibiscono la loro traduzione o promuovono la loro degradazione. Ad oggi, i miRNA sono stati implicati in un gran numero di processi biologici e malattia, che ha significato la necessità per i metodi di rilevamento affidabile delle trascrizioni di miRNA. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la rilevazione basata su probe miRNA (DIG) Locked Nucleic Acid (LNA) digoxigenin-etichettati, combinati con proteine immunostaining su sezioni di cuore di topo. In primo luogo, abbiamo effettuato una tecnica in situ di ibridazione con la sonda per identificare espressione di miRNA-182 in sezioni di cuore da controllo e ipertrofia cardiaca nei topi. Successivamente, abbiamo effettuato immunostaining per la proteina cardiaca troponina T (cTnT), sulle stesse sezioni, a co-localizzano miRNA-182 con le cellule del cardiomyocyte. Usando questo protocollo, siamo stati in grado di rilevare miRNA-182 attraverso una fosfatasi alcalina basato su analisi colorimetrica e cTnT attraverso colorazione fluorescente. Questo protocollo può essere usato per rilevare l'espressione di qualsiasi miRNA di interesse attraverso sonde Scavare-contrassegnate LNA e l'espressione della proteina rilevanti su sezioni di tessuto di cuore di topo.

ibridazione in situ di miRNA è stata ottimizzata su sezioni di cuore di topo utilizzando un scramble miRNA e U6-snRNA, che servivano come controlli positivi e negativi, rispettivamente. La macchiatura positiva è indicata in blu, mentre la macchiatura negativa è indicata dalla mancanza di sviluppo del colore (Figura 1A-1B). Cardiomyocyte espressione specifica dei miRNA-182 è stata valutata in sezioni di cuore da topi sovraesprimenti P...

micro-RNA (Mirna) è brevi e altamente omologhi sequenze di RNA, che serve come regolatori trascrizionali di RNA messaggeri (mRNA). Attuali metodi di rilevazione di miRNA variano nella sensibilità e specificità. Descriviamo un protocollo che unisce l'ibridazione in situ e immunostaining per il rilevamento simultaneo di miRNA e proteina molecole su sezioni di tessuto di cuore di topo.

Tessuto-specifici miRNA Expression Profiling in Mouse cuore sezioni mediante ibridazione In Situ

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel campo dei microRNA, fornendo strumenti per rilevare la relativa lcalizzazione delle molecole di proteine e microRNA. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile rilevare molecole di proteine e microRNA dalla stessa sezione tissutale. Questo protocollo inizia con una reidratazione dei tessuti montati sul vetrino.Riscaldare gli scivoli a 60 gradi Celsius per 10 minuti nel forno di ibridazione. La paraffina dovrebbe sciogliersi visibilmente. Quindi, incubare le diapositive in un barattolo di coplin di vetro contenente agente di compensazione disponibile in commercio per 10 minuti.Fallo due volte. Successivamente, trasferire le diapositive dal lavaggio al lavaggio per reidratare i tessuti. Una volta idratato, incubare i tessuti nella soluzione di lavoro proteinasi K a 37 gradi Celsius per 15 minuti.Per rimuovere la proteinasi K, lavare le diapositive in 1x PBS due volte. Ora, aggiusta i tessuti. In primo luogo, creare serbatoi sugli scivoli usando una penna idrofobica per disegnare un cerchio idrorepellente intorno ai preparati.Successivamente, applicare 500 microlitri di soluzione di PFA al 4% all'interno d

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