Reversione chimica delle cellule staminali pluripotenti umane convenzionali a uno stato ingenuo-simile con una migliore differenziazione di Multilineage potenza
10 giugno 2018
Vi presentiamo un protocollo per la reversione chimica efficiente, alla rinfusa e rapida delle cellule staminali pluripotenti umane lignaggio-innescato convenzionale (hPSC) in uno stato di preimpianto epiblasto-come pluripotenti ingenuo epigenomically-stable. Questo metodo provoca l'espressione genica in diminuzione di lignaggio-innescato e miglioramento notevole nella differenziazione multilineare diretto attraverso un vasto repertorio di hPSC convenzionali linee.
Il metodo LIF-3i riporta le cellule staminali pluripotenti umane convenzionali in uno stato pluripotente più primitivo con caratteristiche biochimiche, trascrizionali ed epigenetiche dell'epiblasto umano pre-impianto. Questo metodo migliora la funzionalità delle cellule staminali pluripotenti umane convenzionali diminuendo l'espressione genica orientata alla linea cellulare e cancellando la variabilità tra le linee di hPSC indipendenti comunemente osservata durante la differenziazione diretta. Utilizzando questo metodo, le cellule staminali pluripotenti umane chimicamente riportate mantengono stabilità cariotipica ed epigenomica dopo un passaggio prolungato, inclusi i loci improntati e possono essere differenziate direttamente con efficacia migliorata senza richiedere una fase di re-priming.
Il metodo LIF-3i aprirà nuove vie di indagine nella biologia dello sviluppo umano precoce e potrebbe far progredire la medicina rigenerativa migliorando la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane, il targeting genico e la generazione di chimera interspecifiche. Per iniziare il protocollo, mantenere ed espandere le cellule staminali pluripotenti umane convenzionali o hPSC con cariotipi normali validati in co-culture con un fibroblasto embrionale di topo o un sistema di coltura di feeder basato su MEF o in un sistema di coltura senza feeder. Preparare i feeder MEF in una piastra a sei pozzetti gelatinizzata precedentemente preparata almeno un giorno prima del passaggio delle colture hPSC convenzionali adattate a LIF-5i.
Dopo che le colture hPSC convenzionali hanno raggiunto circa il 50% di confluenza, sostituire il normale mezzo di coltura hESC con due millilitri per pozzetto di Fattore Inibitore della Leucemia 5i o mezzo LIF-5i. Coltivare e mantenere le hPSC convenzionali e i MEF fino a due giorni in LIF-5i in un incubatore CO2. Cambiare il mezzo LIF-5i quotidianamente per adattarli al passaggio successivo e alla reversione stabile in LIF-3i.
Per le colture convenzionali senza feeder, coltivare le hPSC in LIF-5i solo durante la notte prima del passaggio del mattino successivo. Prima del passaggio, lavare le hPSC convenzionali adattate a LIF-5i una volta con PBS e aggiungere un millilitro di reagente di dissociazione cellulare a ciascun pozzetto. Quindi, incubare la piastra per cinque minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore CO2.
Dopo l'incubazione, triturare delicatamente le cellule con una pipetta in una sospensione di cellule singole. Raccogliere la sospensione cellulare nel mezzo hESC in una diluizione di almeno due volte in un tubo conico sterile da 15 millilitri e triturare delicatamente le cellule pipettando per ottenere una sospensione di cellule singole. Centrifugare le cellule a 300 g per cinque minuti.
Dopo la centrifugazione, aspirare e scartare il surnatante e risuspendere il pellet cellulare in uno-due millilitri di mezzo LIF-5i. Quindi, contare le cellule. Lavare due volte la piastra MEF pre-piattata a sei pozzetti con due millilitri di PBS per pozzetto.
Distribuire da una a due volte 10 alla sesta cellula in due millilitri di mezzo LIF-5i in un pozzetto della piastra MEF lavata con PBS. Posizionare la piastra in un incubatore CO2. Il giorno successivo, agitare delicatamente la piastra per sollevare tutte le cellule non attaccate e aspirare il mezzo e sostituirlo con due millilitri di mezzo LIF-5i.
Ripetere questo passaggio quotidianamente per tre-cinque giorni o fino a quando le cellule sono al 60-70% di confluenza. Questo protocollo supporta una reversione rapida e di massa simile alla condizione naive di una vasta gamma di linee cellulari staminali pluripotenti embrionali umane e indotte, a condizione che le preparazioni di cellule staminali pluripotenti umane con differenziazione marcata o cariotipi anormali siano meticolosamente escluse. Dopo l'adattamento iniziale a LIF-5i, passare le successive colture LIF-3i stabili ogni tre-quattro giorni in un gabinetto di sicurezza biologica o quando le colture raggiungono il 60-70% di confluenza.
Scartare il mezzo di coltura e lavare ogni pozzetto delle colture LIF-5i-LIF-3i aggiungendo delicatamente due millilitri di PBS. Scartare il PBS e aggiungere un millilitro di soluzione di distacco cellulare. Incubare le cellule per cinque minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore CO2.
Dopo l'incubazione, raccogliere la sospensione cellulare, aggiungere mezzo hESC non trattato in una diluizione di due volte e triturare delicatamente le cellule pipettando per ottenere una sospensione di cellule singole. Trasferire la sospensione in un tubo conico sterile da 15 millilitri. Centrifugare le cellule a 300 g per cinque minuti e aspirare e scartare il surnatante.
Risuspendere il pellet in mezzo LIF-3i, quindi contare le cellule. Quindi piattare due volte 10 alla quinta cellula per pozzetto sull'MEF irradiato nella piastra a sei pozzetti gelatinizzata per il passaggio di routine delle colture LIF-3i. Per le colture iniziali adattate a LIF-5i, posizionare una densità inizialmente più alta prima del primo passaggio in MEF LIF-3i.
Le linee cellulari staminali pluripotenti umane individuali dovrebbero essere ottimizzate e regolate a densità di piastra iniziali elevate se necessario per mantenere il passaggio di massa continuo durante i primi passaggi della coltura di reversione LIF-3i. Ripiattare e distribuire le hPSC adattate a LIF-5i su piastre feeder MEF-irradiate fresche lavate con PBS nel mezzo LIF-3i. Sostituire il mezzo LIF-3i quotidianamente.
Passare le N-hPSC per almeno quattro-sette passaggi di massa continui nel mezzo LIF-3i prima dell'uso di N-hPSC in studi funzionali o crioconservazione. Registrare il numero di passaggi di N-hPSC in mezzo convenzionale o LIF-3i. Le colorazioni immunofluorescenti e i western blot hanno rilevato l'espressione delle isoforme attivate fosforilate e totali di STAT3 e Erk1/2, marcatori chiave della pluripotenza molecolare.
Le colorazioni con ematossilina ed eosina delle microsezioni del teratoma hanno rivelato una robusta differenziazione in tutti e tre gli strati germinali con linee di ectodermo, mesoderma ed endodermo ben strutturate. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come riportare efficientemente le cellule staminali pluripotenti umane convenzionali in massa a uno stato simile alla condizione naive utilizzando il metodo chimico universale sequenziale LIF-5i a LIF-3i. Prima di tentare questo protocollo, è importante iniziare con un basso passaggio di linee cellulari staminali pluripotenti umane convenzionali che si conformano a cariotipi normali.
Le colture di cellule staminali pluripotenti umane convenzionali dovrebbero essere per lo più non differenziate e contenere poche cellule differenziate spontaneamente prima di iniziare. Il passaggio di adattamento iniziale e breve a LIF-5i migliora significativamente l'espansione clonale delle cellule staminali pluripotenti umane convenzionali e permette loro di essere successivamente riportate in uno stato naive con LIF-3i solo in quantità di massa, evitando così la necessità di selezionare o sub-clonare colonie rare di cellule staminali pluripotenti umane naive in un secondo momento. L'ulteriore ottimizzazione di questo metodo chimico che utilizza l'inibitore della tankirase in condizioni di coltura definite senza feeder conformi a GMP faciliterà la generazione efficiente e clinicamente utile di una vasta gamma di tipi cellulari funzionali e innestabili per uso terapeutico.
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Panoramica
Il metodo LIF-3i inverte in modo efficiente le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) convenzionali in uno stato simile all'epiblasto preimpianto naïve. Questo protocollo migliora le capacità di differenziazione e riduce l'espressione genica orientata verso specifiche linee cellulari.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia delle cellule staminali
- Medicina rigenerativa
- Biologia dello sviluppo
Sfondo
- Le hPSC convenzionali mostrano variabilità nella differenziazione.
- Gli stati pluripotenti naïve sono fondamentali per comprendere lo sviluppo precoce.
- Sono necessari metodi di differenziazione migliorati per le applicazioni rigenerative.
- Il metodo LIF-3i affronta queste sfide.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo per riportare le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) a uno stato naïve.
- Migliorare l'efficienza della differenziazione diretta.
- Ridurre la variabilità tra linee cellulari nelle hPSCs.
Metodi Utilizzati
- Co-coltura con fibroblasti embrionali di topo (MEFs).
- Sistemi di coltura senza alimentatore.
- Preparazione di piastre a sei pozzetti gelatinizzate per alimentatori MEF.
- Passaggio prolungato di hPSC riportate allo stato iniziale per valutare la stabilità.
Risultati principali
- Ripristino con successo delle hPSCs in uno stato naïve stabile.
- Riduzione dell'espressione genica legata al priming per la linea cellulare.
- Miglioramento dell'efficienza di differenziazione senza ri-priming.
- Mantenimento della stabilità cariotipica ed epigenomica.
Conclusioni
- Il metodo LIF-3i apre nuove prospettive nella biologia dello sviluppo umano.
- Potrebbe favorire applicazioni nella medicina rigenerativa.
- Questo protocollo potrebbe facilitare studi sul targeting genico e chimere.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente la riattivazione collettiva di cellule staminali pluripotenti umane convenzionali verso uno stato simile allo stato naïve, riducendo la variabilità tra linee nei risultati di differenziazione e migliorando la pluripotenza funzionale. Migliorando l'efficienza di differenziazione senza riattivazione, supporta modellizzazioni precliniche più prevedibili e riduce i rischi nella validazione di bersagli all'interno dei percorsi di medicina rigenerativa. La riproducibilità del metodo su diverse linee di hESC e di hiPSC libere da transgeni facilita flussi di lavoro scalabili e standardizzati per la ricerca di scoperta precoce e applicata.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche ripristinando cellule staminali pluripotenti umane già orientate verso una linea differenziativa a uno stato più precoce dal punto di vista dello sviluppo, con riduzione del rumore epigenetico.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale di bersagli mediante confronti isogenici tra stati naïve-like e stati primed, chiarificando così il meccanismo d'azione.
- Valore predittivo: Aumenta l'affidabilità nei saggi di differenziamento riducendo la variabilità tra linee cellulari, fattore che altrimenti ostacolerebbe l'identificazione di composti promettenti.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Produce cellule staminali pluripotenti umane di tipo naïve stabili e cariotipicamente normali, adatte a piattaforme di screening ad alto rendimento che richiedono risposte cellulari costanti.
- Output quantitativo: Consente efficienze di differenziazione misurabili attraverso i diversi strati germinativi, permettendo screening robusti di risposta dose-dipendente e fenotipici.
- Scalabilità: Permette la conversione su larga scala senza selezione clonale, supportando la preparazione su larga scala di saggi e campagne di screening di reagenti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Fornisce un sistema umano di tipo epiblasto pre-impianto sviluppativamente accurato per modellare disturbi dello sviluppo precoce.
- Continuità traslazionale: Mantiene la stabilità epigenomica nei loci improntati, favorendo un'extrapolazione affidabile alla differenziazione in vivo e alla formazione di teratomi.
- De-risking meccanicistico: Elimina la variabilità tra linee nella differenziazione diretta, riducendo falsi negativi e falsi positivi negli studi preclinici di efficacia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo sequenziale da LIF-5i a LIF-3i si integra nei flussi di lavoro di scoperta consentendo la generazione standardizzata di cellule in stato naïve prima dei saggi di differenziamento, dell'identificazione di composti promettenti e delle fasi di validazione preclinica.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi mediante confronti isogenici tra stati delle hPSC di tipo naïve e di tipo primed per chiarire i meccanismi bersaglio e le dipendenze delle vie di segnalazione.
- Screening: Fornisce popolazioni cellulari riproducibili e capaci di differenziarsi per la standardizzazione dei saggi e lo screening di composti, riducendo la variabilità tra pozzetti.
- Analisi: Permette letture quantitative dell'efficienza di differenziamento trilineare e la normalizzazione dell'espressione genica per confronti incrociati tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Mantiene la stabilità epigenomica e cariotipica durante passaggi prolungati, supportando studi preclinici longitudinali e l'allineamento di biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un metodo reversibile e indipendente dalla piattaforma per generare hPSC di tipo naïve in diversi progetti e linee cellulari, riducendo ottimizzazioni ridondanti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Maggiore affidabilità predittiva negli esiti della differenziazione grazie alla riduzione dei segnali predisponenti alla linea cellulare e al miglioramento della stabilità della pluripotenza.
- Valore operativo: Protocollo standardizzato, compatibile con cellule feeder o in assenza di feeder, con manipolazioni minime e alta riproducibilità tra diversi laboratori.
- Valore strategico: Decisioni più efficaci sul proseguimento o meno dei progetti grazie alla riduzione del rumore biologico nei saggi di differenziazione, con conseguente minor rischio di fallimento in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei ceppi cellulari basata sulla capacità funzionale di ripristino, piuttosto che sulla variabilità del background genetico.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura di cellule staminali, inclusi il passaggio, la dissociazione e la validazione dei marcatori di pluripotenza.
- Dipende da un incubatore a CO2, da una cappa a sicurezza biologica e da attrezzature standard per la coltura cellulare per la co-coltura con MEF o l'adattamento senza feeder.
- Necessita di una formulazione standardizzata del mezzo, inclusi LIF, inibitori di GSK3β e MEK/ERK, e l'inibitore della tankirasi XAV939 per il LIF-3i, con aggiunta facoltativa di forskolina e purmorphamina per l'adattamento a LIF-5i.
- Richiede la validazione di un cariotipo normale e di una bassa differenziazione spontanea nelle linee di hPSC iniziali per garantire un'inversione riuscita.
- L'adattamento tra diversi sistemi modello potrebbe richiedere un'ottimizzazione della densità iniziale di semina e della durata dell'esposizione al LIF-5i per l'espansione clonale.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Title
1:14
Bulk Stabilization of Conventional hPSC Cultures for Subsequent Naïve Reversion with a Brief LIF-5i Adaptation
4:38
Long-term Maintenance and Expansion of N-hPSC in LIF-3i Medium
7:14
Results: Effective Reversion of Human Pluripotent Stem Cells
7:47
Conclusion
