Name: Reversione chimica delle cellule staminali pluripotenti umane convenzionali a uno stato ingenuo-simile con una migliore differenziazione di Multilineage potenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Scopri il metodo LIF-3i per revertere le cellule staminali pluripotenti umane convenzionali a uno stato ingenuo-simile. Questo protocollo migliora la differenziazione multilineare e riduce la variabilità tra le linee cellulari.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal NIH/nia (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), RPB Stein Innovation Award, The Maryland Stem Cell Research Fund (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk Science Forum Award e la Fondazione di Moseley.

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</ol>

Con un accordo di licenza tra Life Technologies e la Johns Hopkins University (JHU), Dr. Zambidis è diritto a una quota di royalty ricevute dall'Università per le licenze delle cellule staminali. I termini di questo accordo sono gestiti da JHU secondo le proprie politiche di conflitto di interessi. Questo non altera l'adesione degli autori alle politiche di giornale sulla condivisione di dati e materiali.

Il sistema di LIF-3i si applica una versione modificata del classico 2i murino ingenuo reversione cocktail1 a cellule staminali pluripotenti umane. L'auto-rinnovamento di hPSC (che non può espandersi in 2i da solo) è stabilizzato in LIF-2i completando questo cocktail con l'inibitore di tankyrase XAV939. LIF-3i cultura permette alla rinfusa e reversione efficiente della hPSC convenzionale ad uno stato pluripotenti che assomiglia l' epiblasto preimpianto umano<sup class="xre...

Il sistema di coltura 2i (inibitore MEK/ERK e GSK3β) è stato originariamente sviluppato per perfezionare culture di cellule staminali embrionali (mESC) eterogenei basati su siero del mouse ad uno stato di terreno uniforme di pluripotenza simile al mouse epiblast preimpianto1. Tuttavia, 2i non supporta il mantenimento stabile della pluripotenti umane della cellula formativa (hPSC) linee2. I vari complessa piccola molecola, fattore di crescita-completati e approcci transgenici recentemente sono stati segnalati per catturare putativamente simili pluripotenti umane ingenuo-come molecolare afferma2. Tuttavia, molti degli Stati "ingenuo-like" creati con questi metodi anche esibito karyotypic instabilità, epigenomic difetti (ad es., perdita globale di parental imprinting genomico), o alterata differenziazione potenziale.
In contrasto, il cocktail di tripla inibizione chimica di GSK3β, ERK e tankyrase della segnalazione e fattore inibitorio di leucemia (LIF-3i) era sufficiente per la reversione ingenuo-come stabile di un vasto repertorio di hPSC convenzionali linee3. LIF-3i-reverted ingenuo hPSC (N-hPSC) mantenuto i karyotypes normali e aumentato le loro espressioni di geni specifici ingenuo umano preimpianto epiblasto (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Stella (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). LIF-3i hPSC di reversione conferito anche con una serie di caratteristiche molecolari e biochimiche uniche alla pluripotenza mESC-come ingenuo che comprendeva aumentata fosforilato STAT3 signaling, ha fatto diminuire la fosforilazione di ERK, global 5-metilcitosina CpG ipometilazione, demetilazione CpG genoma alle cellule staminali embrionali (ESC)-promotori di geni specifici e uso di enhancer OCT4 distale dominante. Inoltre, in confronto ad altri ingenui metodi di reversione che ha provocato aberrante ipometilato impresso loci genomici, LIF-3i-reverted N-hPSC erano privi di perdita sistematica di impresso CpG modelli o perdita di espressione di DNA metiltransferasi (per esempio, DNMT3B DNMT1, DNMT3A,)3.
Una coltura di LIF-3i diretta di una vasta gamma di convenzionale staminali embrionali umane (hESC) e cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSC) coltivate su alimentatori o E8 privo di alimentatore condizioni raggiunto reversione alla rinfusa e rapida ad uno stato di epiblasto-come ingenuo. Tuttavia, diretto LIF-3i ingenuo reversione può essere inefficiente in alcune linee di hPSC convenzionale instabile dovuto l'inerente variabilità genomica e lignaggio-innescato derivanti dagli sfondi donatore geneticamente diverse.
Così, per ampliare l'utilità del metodo LIF-3i, un'ottimizzazione graduale è stata sviluppata ed è presentata qui, che permette di reversione ingenuo universale con quasi qualsiasi hESC convenzionale o linea di transgeni hiPSC coltivate su alimentatori. Questo metodo di reversione universalizzanti ingenuo impiega un passo di cultura iniziale transitoria in hPSC convenzionale che integrano il cocktail di LIF-3i con due altre piccole molecole (LIF-5i) che rafforzano la chinasi di proteina A (forskolin) e sonic hedgehog (sHH) ( segnalazione di purmorphamine). Un passaggio iniziale di hPSC convenzionale in LIF-5i li adatta a successive stabile LIF-3i reversione allo stato sfuso. Adattamento di LIF-5i iniziale aumenta significativamente la proliferazione clonale di singola cellula iniziale delle convenzionali hPSC coltivate su E8 o alimentatori (prima del loro successivo passaggio stabile, continuo a LIF-3i da solo). HPSC convenzionali linee adattate prima di un passaggio in LIF-5i tollerano successive alla rinfusa clonale passaggio delle cellule naive-reverted in condizioni di LIF-3i, che previene l'esigenza di picking e subcloning di rare colonie stabili, o l'uso di routine molecole anti-apoptotiche o inibitori della Rho-associati proteina chinasi (ROCK).
Il metodo di LIF-3i è stato impiegato con successo per stabile espandere e mantenere un vasto repertorio di > 30 hPSC convenzionale indipendente, geneticamente diverse linee per > 10 – 30 passaggi utilizzando sia metodi di dissociazione non enzimatica o enzimatica, e senza prova di induzione di cromosomiche o anomalie epigenomic, compreso le anomalie alle loci genici impresso. Inoltre, sequenziale LIF-5i/LIF-3i cultura è il metodo di reversione solo ingenuo che finora è stato segnalato che migliora la pluripotenza funzionale di un vasto repertorio di linee convenzionali hPSC diminuendo la loro espressione genica innescata lignaggio e migliorando notevolmente la loro potenza di differenziazione multipotenti. Il LIF-3i ingenuo reversione metodo cancella l'intrinseco interline variabilità di differenziazione delle linee hPSC lignaggio-innescato, convenzionale e avrà una grande utilità dell'applicazione nella medicina rigenerativa e terapie cellulari.

<table><tbody><tr><td>anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated</td><td>BD Biosciences</td><td>561716</td><td>use 5&micro;L per assay (FACS)</td></tr><tr><td>anti- TFCP2L1 antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HPA029708</td><td>use at a 1:100 dilution (immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-beta-Actin antibody</td><td>Abcam</td><td>ab6276</td><td>use at 1:5000 (Western blot)</td></tr><tr><td>anti-CD146 antibody,&nbsp; PE conjugated&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>550315</td><td>use 5&micro;L per assay (FACS)</td></tr><tr><td>anti-CD31 antibody, APC conjugated</td><td>eBioscience</td><td>17-0319-42</td><td>use 2&micro;L per assay (FACS)</td></tr><tr><td>anti-CD31 microbead kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-935</td><td></td></tr><tr><td>anti-NANOG antibody</td><td>Abcam</td><td>ab109250</td><td>use at a 1:100 dilution (immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-NR5A2 antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HPA005455</td><td>use at a 1:100 dilution (immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>4695</td><td>use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein</td></tr><tr><td>anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>4370</td><td>use at 1:1000 (Western blot)</td></tr><tr><td>anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>9145</td><td>use at 1:1000 (Western blot)</td></tr><tr><td>anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated</td><td>Agilent</td><td>E0432</td><td>use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated&nbsp;</td><td>R&amp;D System</td><td>FAB1435A</td><td>use 5&micro;L per assay (FACS)</td></tr><tr><td>anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated</td><td>R&amp;D System</td><td>NLLC1435G</td><td>use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-STAT3 antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>9139</td><td>use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein</td></tr><tr><td>anti-STELLA/DPPA3 antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB4388</td><td>use at a 1:50 dilution (immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated&nbsp;</td><td>R&amp;D System</td><td>NLLC4770R</td><td>use at&nbsp; a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated</td><td>Stemgent</td><td>09-0068</td><td>use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated</td><td>Stemgent</td><td>09-0069</td><td>use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)</td></tr><tr><td>anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated</td><td>BD Biosciences</td><td>560193</td><td>use 10&micro;L per assay (FACS)</td></tr><tr><td>anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated</td><td>BD Biosciences</td><td>560161</td><td>use 10&micro;L per assay (FACS)</td></tr><tr><td>APEL2-Li</td><td>StemCell Technologies</td><td>5271</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>CellAdhere dilution buffer</td><td>StemCell Technologies</td><td>7183</td><td>dilutent for Vitronectin XF&trade; matrix</td></tr><tr><td>CF1 mouse</td><td>Charles river</td><td>023</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>R&amp;D System</td><td>L5283</td><td>reconstitute at 100mM in DMSO</td></tr><tr><td>confocal microscope system</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>cord blood CD34+ derived iPSC line</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A18945</td><td>also referred as 6.2 line</td></tr><tr><td>Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Countess&nbsp; cell counting chamber slide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess automated cell counter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (dimethyl sulfoxide)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DR4 mouse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>3208</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 (E8) medium</td><td>StemCell Technologies</td><td>5940</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovin serum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Stemgent</td><td>04-0025</td><td>reconstitute at 100mM in DMSO</td></tr><tr><td>Gelatin (porcine)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>resuspend in water and sterilize with an autoclave</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 medium</td><td>StemCell Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene cryogenic vials</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5000-0020</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System</td><td>Fisher Scientific</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% in PBS</td><td>USB Corporation&nbsp;</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PZ0162</td><td>reconstitute at 100mM in DMSO</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>Purmorphamine</td><td>Stemgent</td><td>04-0009</td><td>reconstitute at 10mM in DMSO</td></tr><tr><td>recombinant human Activin A</td><td>Peprotech</td><td>AF-120-14E</td><td></td></tr><tr><td>recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4</td><td>Peprotech</td><td>120-05ET</td><td>resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS</td></tr><tr><td>recombinant human FGF-basic (bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>1

reversione chimica delle cellule staminali pluripotenti umane convenzionali a uno stato ingenuo-simile con una migliore differenziazione di multilineage potenza

Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Na&#239;ve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency

Cellule staminali pluripotenti umane di ingenuo (N-hPSC) con funzionalità migliorate possono avere un ampio impatto nella medicina rigenerativa. L'obiettivo del presente protocollo è per ripristinare in modo efficiente le cellule staminali pluripotenti umane lignaggio-innescato, convenzionale (hPSC) mantenute su condizioni sia privo di alimentatore o Alimentatore-dipendente da un ingenuo-come pluripotenza con funzionalità migliorate. Questo metodo di reversione ingenuo chimica impiega il fattore inibitorio di leucemia classica (LIF), GSK3β e MEK/ERK inibizione cocktail (LIF-2i), completati con solo un inibitore di tankyrase XAV939 (LIF-3i). LIF-3i Ripristina hPSC convenzionale a uno stato stabile pluripotenti adottando biochimici, trascrizionale e caratteristiche epigenetiche dell'epiblasto umana pre-impianto. Questo metodo di LIF-3i richiede manipolazione di cultura di cellule minimal ed è altamente riproducibile in un vasto repertorio di cellule staminali embrionali umane (hESC) e linee di cellule staminali (hiPSC) di transgeni umane pluripotenti indotte. Il metodo di LIF-3i non richiede un passaggio ri-adescamento prima la differenziazione; N-hPSC possono essere differenziati direttamente con rendimenti estremamente elevati e mantenere karyotypic e stabilità di epigenomic (tra cui impresso loci). Per aumentare l'universalità del metodo, hPSC convenzionali sono coltivate in primo luogo nel cocktail LIF-3i completati con due altre piccole molecole che potenziare la chinasi di proteina A (forskolin) e segnalazione di sonic hedgehog (sHH) (purmorphamine) (LIF-5i). Questo breve passaggio di adattamento LIF-5i significativamente migliora l'iniziale espansione clonale di hPSC convenzionale e permette loro di essere successivamente ingenuo-è ritornato con LIF-3i solo allo stato sfuso, così prevenendo l'esigenza di picking/subcloning rara N-hPSC colonie più tardi. LIF-5i-stabilizzato hPSCs sono mantenute in seguito a LIF-3i da solo senza la necessità di molecole anti-apoptotico. La cosa più importante, LIF-3i reversione contrassegnato migliora la pluripotenza funzionale di un vasto repertorio convenzionale hPSC diminuendo la loro espressione genica innescata lignaggio e cancellando la variabilità di interlinea di differenziazione diretto comunemente osservato tra linee hPSC indipendente. Rappresentante caratterizzazioni di LIF-3i-reverted N-hPSC sono strategie fornite e sperimentale per comparazioni funzionale di hPSC isogeniche nel lignaggio-innescato vs. Stati di tipo ingenuo sono delineati.

Questo protocollo consente di ottimizzare efficiente reversione ingenuo-come con LIF-3i in entrambe le culture hPSC convenzionale lignaggio-innescato alimentatore-dipendenti e indipendenti dell'alimentatore (Figura 1). Il protocollo dettagliato, ivi descritto contorni adattamento sequenziale per LIF-3i a partire da entrambi condizioni hPSC Alimentatore-dipendente o senza alimentatore convenzionale (es. E8 medio).
<p class="jove_content" fo:keep-t...

Vi presentiamo un protocollo per la reversione chimica efficiente, alla rinfusa e rapida delle cellule staminali pluripotenti umane lignaggio-innescato convenzionale (hPSC) in uno stato di preimpianto epiblasto-come pluripotenti ingenuo epigenomically-stable. Questo metodo provoca l'espressione genica in diminuzione di lignaggio-innescato e miglioramento notevole nella differenziazione multilineare diretto attraverso un vasto repertorio di hPSC convenzionali linee.

Reversione chimica delle cellule staminali pluripotenti umane convenzionali a uno stato ingenuo-simile con una migliore differenziazione di Multilineage potenza

Na&#239;ve human pluripotent stem cells (N-hPSC) with improved functionality may have a wide impact in regenerative medicine. The goal of this protocol is ...

Il metodo LIF-3i riporta le cellule staminali pluripotenti umane convenzionali in uno stato pluripotente più primitivo con caratteristiche biochimiche, trascrizionali ed epigenetiche dell'epiblasto umano pre-impianto. Questo metodo migliora la funzionalità delle cellule staminali pluripotenti umane convenzionali diminuendo l'espressione genica orientata alla linea cellulare e cancellando la variabilità tra le linee di hPSC indipendenti comunemente osservata durante la differenziazione diretta. Utilizzando questo metodo, le cellule staminali pluripotenti umane chimicamente riportate mantengono stabilità cariotipica ed epigenomica dopo un passaggio prolungato, inclusi i loci improntati e possono essere differenziate direttamente con efficacia migliorata senza richiedere una fase di re-priming.Il metodo LIF-3i aprirà nuove vie di indagine nella biologia dello sviluppo umano precoce e potrebbe far progredire la medicina rigenerativa migliorando la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane, il targeting genico e la generazione di chimera interspecifiche. Per iniziare il protocollo, mantenere ed espandere le cellule staminali pluripotenti umane convenzionali o hPSC con cariotipi normali validati in co-culture con un fibroblasto embrionale di topo o un sistema di coltura di feeder basato su MEF o in un sistema di coltura senza feeder. Preparare i feeder MEF in una piastra a sei pozzetti gelatinizzata precedentemente preparata almeno un giorno prima del passaggio delle colture hPSC convenzionali adattate a LIF-5i.Dopo che le colture hPSC convenzionali hanno raggiunto circa il 50% di confluenza, sostituire il normale mezzo di coltura hESC con due millilitri per pozzetto di Fattore Inibitore della Leucemia 5i o mezzo LIF-5i. Coltivare e mantenere le hPSC convenzionali e i MEF fino a due giorni in LIF-5i in un incubatore CO2. Cambiare il mezzo LIF-5i quotidianamente per adattarli al passaggio successivo e alla reversione stabile in LIF-3i.Per le colture convenzionali senza feeder, coltivare le hPSC in LIF-5i solo durante la notte prima del passaggio del mattino successivo. Prima del passaggio, lavare le hPSC convenzionali adattate a LIF-5i una volta con PBS e aggiungere un millilitro di reagente di dissociazione cellulare a ciascun pozzetto. Quindi, incubare la piastra per cinque minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore CO2.Dopo l'incubazione, triturare delicatamente le cellule con una pipetta in una sospensione di cellule singole. Raccogliere la sospensione cellulare nel mezzo hESC in una diluizione di almeno due volte in un tubo conico sterile da 15 millilitri e triturare delicatamente le cellule pipettando per ottenere una sospensione di cellule singole. Centrifugare le cellule a 300 g per cinque minuti.Dopo la centrifugazione, aspirare e scartare il surnatante e risuspendere il pellet cellulare in uno-due millilitri di mezzo LIF-5i. Quindi, contare le cellule. Lavare due volte la piastra MEF pre-piattata a sei pozzetti con due millilitri di PBS per pozzetto.Distribuire da una a due volte 10 alla sesta cellula in due millilitri di mezzo LIF-5i in un pozzetto della piastra MEF lavata con PBS. Posizionare la piastra in un incubatore CO2. Il giorno successivo, agitare delicatamente la piastra per sollevare tutte le cellule non attaccate e aspirare il mezzo e sostituirlo con due millilitri di mezzo LIF-5i.Ripetere questo passaggio quotidianamente per tre-cinque giorni o fino a quando le cellule sono al 60-70% di confluenza. Questo protocollo supporta una reversione rapida e di massa simile alla condizione naive di una vasta gamma di linee cellulari staminali pluripotenti embrionali umane e indotte, a condizione che le preparazioni di cellule staminali pluripotenti umane con differenziazione marcata o cariotipi anormali siano meticolosamente escluse. Dopo l'adattamento iniziale a LIF-5i, passare le successive colture LIF-3i stabili ogni tre-quattro giorni in un gabinetto di sicurezza biologica o quando le colture raggiungono il 60-70% di confluenza.Scartare il mezzo di coltura e lavare ogni pozzetto delle colture LIF-5i-LIF-3i aggiungendo delicatamente due millilitri di PBS. Scartare il PBS e aggiungere un millilitro di soluzione di distacco cellulare. Incubare le cellule per cinque minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore CO2.Dopo l'incubazione, raccogliere la sospensione cellulare, aggiungere mezzo hESC non trattato in una diluizione di due volte e triturare delicatamente le cellule pipettando per ottenere una sospensione di cellule singole. Trasferire la sospensione in un tubo conico sterile da 15 millilitri. Centrifugare le cellule a 300 g per cinque minuti e aspirare e scartare il surnatante.Risuspendere il pellet in mezzo LIF-3i, quindi contare le cellule. Quindi piattare due volte 10 alla quinta cellula per pozzetto sull'MEF irradiato nella piastra a sei pozzetti gelatinizzata per il passaggio di routine delle colture LIF-3i. Per le colture iniziali adattate a LIF-5i, posizionare una densità inizialmente più alta prima del primo passaggio in MEF LIF-3i.Le linee cellulari staminali pluripotenti umane individuali dovrebbero essere ottimizzate e regolate a densità di piastra iniziali elevate se necessario per mantenere il passaggio di massa continuo durante i primi passaggi della coltura di reversione LIF-3i. Ripiattare e distribuire le hPSC adattate a LIF-5i su piastre feeder MEF-irradiate fresche lavate con PBS nel mezzo LIF-3i. Sostituire il mezzo LIF-3i quotidianamente.Passare le N-hPSC per almeno quattro-sette passaggi di massa continui nel mezzo LIF-3i prima dell'uso di N-hPSC in studi funzionali o crioconservazione. Registrare il numero di passaggi di N-hPSC in mezzo convenzionale o LIF-3i. Le colorazioni immunofluorescenti e i western blot hanno rilevato l'espressione delle isoforme attivate fosforilate e totali di STAT3 e Erk1/2, marcatori chiave della pluripotenza molecolare.Le colorazioni con ematossilina ed eosina delle microsezioni del teratoma hanno rivelato una robusta differenziazione in tutti e tre gli strati germinali con linee di ectodermo, mesoderma ed endodermo ben strutturate. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come riportare efficientemente le cellule staminali pluripotenti umane convenzionali in massa a uno stato simile alla condizione naive utilizzando il metodo chimico universale sequenziale LIF-5i a LIF-3i. Prima di tentare questo protocollo, è importante iniziare con un basso passaggio di linee cellulari staminali pluripotenti umane convenzionali che si conformano a cariotipi normali.Le colture di cellule staminali pluripotenti umane convenzionali dovrebbero essere per lo più non differenziate e contenere poche cellule differenziate spontaneamente prima di iniziare. Il passaggio di adattamento iniziale e breve a LIF-5i migliora significativamente l'espansione clonale delle cellule staminali pluripotenti umane convenzionali e permette loro di essere successivamente riportate in uno stato naive con LIF-3i solo in quantità di massa, evitando così la necessità di selezionare o sub-clonare colonie rare di cellule staminali pluripotenti umane naive in un secondo momento. L'ulteriore ottimizzazione di questo metodo chimico che utilizza l'inibitore della tankirase in condizioni di coltura definite senza feeder conformi a GMP faciliterà la generazione efficiente e clinicamente utile di una vasta gamma di tipi cellulari funzionali e innestabili per uso terapeutico.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Abbiamo stabilito un protocollo per l'induzione di neuroblasti pluripotenti direttamente da cellule staminali embrionali umane conservati in condizioni definite con piccole molecole, che permette la derivazione di una grande quantità di progenitori neuronali umane e tipi di cellule neuronali nel sistema nervoso centrale per lo sviluppo neurale riparazione.

Derivazione efficiente di progenitori neuronali umane e Neuroni pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

Abbiamo stabilito un protocollo per l'induzione della cardioblasts pluripotenti direttamente da cellule staminali embrionali umane conservati in condizioni definite con piccole molecole, che permette la derivazione di una grande quantità di risorse umane progenitori cardiaci e funzionale cardiomiociti per la riparazione cardiovascolare.

Derivazione efficiente dei diritti dell&#39;uomo e precursori cardiaci e cardiomiociti pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

Protocolli per la differenziazione neuronale di cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) sono spesso molto tempo e richiedono notevoli capacità di colture cellulari. Qui, abbiamo adattato una piccola molecola procedura basata differenziazione di un formato di piastra multititre, permettendo la generazione semplice, rapido, efficace e di neuroni umani in modo controllato.

Generazione rapida e efficiente di neuroni da cellule staminali umane pluripotenti in un formato piatto Multititre

Noi, sulla base delle conoscenze della biologia dello sviluppo e della ricerca pubblicata, abbiamo sviluppato un protocollo ottimizzato per generare in modo efficiente neuroni dopaminergici del mesencefalo A9 sia da cellule staminali embrionali umane che da cellule staminali pluripotenti indotte umane, che sarebbero utili per la modellazione della malattia e la terapia di sostituzione cellulare per il morbo di Parkinson.

Regia neuroni dopaminergici differenziazione da cellule staminali pluripotenti umane

Descriviamo un protocollo per la derivazione di cellule staminali pluripotenti umane indotte prive di fattori riprogrammate e caratterizzate su base lentivirale e la conversione in condizioni cliniche putative.

Derivazione e caratterizzazione di un free-Transgene umana indotta pluripotenti staminali Cell Line e Conversione in definite condizioni clinico-grade

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte fornisce prospettive affascinanti per la derivazione di trapianto autologo. Tuttavia, la progressione attraverso uno stato pluripotente e laborioso ri-differenziazione impedisce ancora di traduzione clinica. Qui si descrive la derivazione di fibroblasti umani adulti e la loro conversione diretta in cellule progenitrici neurali indotte e la successiva differenziazione in linee neurali.

Derivazione di adulti fibroblasti umani e la loro conversione diretta in celle espandibile progenitrici neurali

Questo protocollo descrive la riprogrammazione di primaria amniotico liquido e membrana di cellule staminali mesenchimali in cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un approccio episomal non-integrazione in condizioni completamente chimicamente definite. Procedure di estrazione, cultura, riprogrammazione e caratterizzazione delle cellule staminali pluripotenti indotte risultanti dai rigorosi metodi sono dettagliate.

Riprogrammazione primario del liquido amniotico e le celle a membrana di pluripotenza in condizioni prive di Xeno

La generazione di tipi di cellule differenziate dalle cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) mantiene grandi promesse terapeutiche, ma rimane impegnativo. I PSC spesso presentano un'inerente a differenziarsi anche se stimolati con un set adeguato di segnali. Descritto qui è un semplice strumento per migliorare la differenziazione multilineage attraverso una varietà di linee PSC.

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Presentiamo qui un metodo che combina l'uso della cancellazione epigenetica chimica con segnali correlati al meccanosensing per generare in modo efficiente cellule pluripotenti di mammiferi, senza la necessità di trasfezione genica o vettori retrovirali. Questa strategia è, quindi, promettente per la medicina traslazionale e rappresenta un notevole progresso nella tecnologia degli organoidi delle cellule staminali.

Una strategia in due fasi che combina modificazione epigenetica e segnali biomeccanici per generare cellule pluripotenti di mammifero

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Delezione genica mediata da CRISPR-Cas9 in cellule staminali pluripotenti umane coltivate in condizioni prive di alimentatore

Scopri il metodo LIF-3i per revertere le cellule staminali pluripotenti umane convenzionali a uno stato ingenuo-simile. Questo protocollo migliora la differenziazione multilineare e riduce la variabilità tra le linee cellulari.

Reversione chimica delle cellule staminali pluripotenti umane convenzionali a uno stato ingenuo-simile con una migliore differenziazione di Multilineage potenza (Video) | JoVE Journal

Reversione chimica delle cellule staminali pluripotenti umane convenzionali a uno stato ingenuo-simile con una migliore differenziazione di Multilineage potenza

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