Name: Un modello di osteogenesi di distrazione del topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-14T12:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 24 s
Description: Scopri l'osteogenesi di distrazione tibiale nel topo con un distrattore personalizzato per studiare la rigenerazione ossea. Questo modello consente analisi dettagliate dei meccanismi di guarigione tissutale.

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Gli autori ringraziano la signora Makiko Kato per fornire incoraggiamento per completare questo studio. Ringraziamo anche la divisione di animali da esperimento e Medical Research Engineering, Nagoya University Graduate School of Medicine, per l'alloggiamento dei topi.

Tutti gli esperimenti sono stati effettuati secondo protocolli approvati dal comitato di uso della nostra istituzione e cura degli animali. Sterilizzare tutti gli strumenti prima della procedura.
1. preparazione di uno stampo per creare il distrattore su misura
<ol><li>Fanno due squilli incomplete (diametro esterno, 20 mm; diametro interno, 10 mm), che sono una parte del distrattore, con un unico foglio di cera di paraffina (145 mm x 74 mm) utilizzando un intagliatore di cera di Evans.<ol>
<li>Fare 4 dei pezzi stessi. Utilizzare una spatola cera riscaldata con un bruciatore a gas. Impilare i quattro anelli per uno spessore di 5 mm. fornire spazio per la vite di espansione e ago, 8 x 2 mm e 5 mm x 2 mm rispettivamente con il carver cera Evans (figure 1A, 1B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incorporare modelli in cera nel materiale da impronta in silicone e creare uno stampo per gli anelli di resina (Figura 1C).</li>
	<li>Dopo l'indurimento il materiale da impronta in silicone (circa 5 min a temperatura ambiente), rimuovere i modelli in cera.</li>
</ol>2. produzione del distrattore su misura
<ol><li>Applicare vaselina sottilmente e uniformemente lo stampo in silicone. 3 g di polimerizzazione resina dentale di mescolare e versare immediatamente nello stampo in silicone. Impostare per 5 min a temperatura ambiente (TA).</li>
	<li>Rimuovere l'anello di resina polimerizzata dallo stampo e lucidare con una barra in metallo duro e un micromotore per rimuovere la bava (1 minuto circa). Due anelli di resina sono necessari per ogni distrattore su misura.<ol>
<li>Ripetere la procedura per creare il numero richiesto di anelli di resina (Figura 1D).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lasciare uno spazio di circa 2 mm per fissare gli anelli di resina con cera di utilità e proteggere l'esterno della vite espansione completamente con resina trasparente. Impostare la resina per 5 min a TA. Quando la polimerizzazione è completa, rimuovere il pomello a vite di espansione (Figura 1E).</li>
</ol>3. protocollo chirurgico
<ol><li>Utilizzare topi maschi di 8 settimane.</li>
	<li>Indurre l'anestesia con un'iniezione intraperitoneale di medetomidina cloridrato a 0,3 mg/g, midazolam a 4 mg/kg e butorfanolo tartrato 5 mg/kg del peso corporeo.<ol>
<li>Attentamente la barba e disinfettare l'area chirurgica con soluzione di iodio 10% e quindi, amministrare 0,5% lidocaina cloridrato presso l'arto inferiore destro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fare un'incisione longitudinale della pelle (circa 15 mm di lunghezza) a destra abbassare la gamba con un bisturi n. 15. Senza mezzi termini separare i muscoli sottostanti, facendo attenzione a non per rimuovere tutti del periostio. Approccio dall'esterno per raggiungere facilmente il perone. Tagliare il perone con le forbici.</li>
	<li>Impugnare la caviglia con pinze sterili sottile strette e usare un ago sterile di 27 G per fare un buco nell'osso circa 5 mm dal tallone. L'ago deve penetrare la pelle, ossa e pelle in quell'ordine. Quando l'ago penetra, tagliare la punta e la radice con una pinza in modo che l'ago è di circa 15 mm.<ol>
<li>Fare un altro buco nello stesso modo, circa 2 – 3 mm prossimale. Tenere intorno alla caviglia e passare due aghi 25g sotto il ginocchio nello stesso modo. Dopo gli aghi penetrano, tagliate le punte e le radici con una tenaglia (Figura 1,F).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Posizionare il distrattore su misura tale che è parallela alla direzione di estensione. Difficoltà gli aghi e dispositivo con sufficiente resina dentale di polimerizzazione per riempire i solchi del dispositivo. Attendere la polimerizzazione completare (circa 5 min) (Figura 1G).</li>
	<li>Fare attenzione a non danneggiare i tessuti circostanti. Tagliare la metà della diafisi della tibia utilizzando un disco di taglio molto sottile durante l'applicazione di una soluzione salina (1 – 2 mL).</li>
	<li>Chiudere la ferita con una sutura in nylon 4-0.</li>
	<li>Dare le iniezioni sottocutanee di buprenorfina (0,1 mg/kg) per analgesia subito dopo l'operazione. Continuare buprenorfina ogni 12 h attraverso giorno postoperatorio 7 e come necessaria in seguito.</li>
</ol>4. distrazione protocollo
Nota: Ci sono vari rapporti sul tasso di distrazione e periodo di latenza, ma qui, sono indicati i protocolli rappresentativi.
<ol><li>Dopo un periodo di latenza di 5 giorni, start distrazione a una velocità di 0,2 mm/12 h. Per estensione, utilizzare il pin collegato alla vite di rapida espansione. Spostare il perno nella direzione della freccia gialla attaccata alla vite di estensione (Figura 1E).</li>
	<li>L'anestesia non è necessaria durante l'estensione. Tenere la coda con il mignolo e il palmo e fissare il dispositivo di estensione con l'indice e il pollice.</li>
	<li>Eseguire estensione (0,2 mm per 1/4 di giro). Continuare allungamento per 8 giorni, che si tradurrà in uno spazio totale di 3,2 mm.</li>
</ol>5. analisi
<ol><li>Analisi della radiografia: dopo il completamento dell'estensione, valutare la rigenerazione ossea con tomografia computata in anestesia generale utilizzando 2,0% isoflurane. Nota: Se la cura è stata presa per quanto riguarda la posizione del dispositivo di estensione, è possibile valutare con la semplice radiografia anche con la periferica collegata.</li>
	<li>Analisi istologica: rimuovere l'apparecchio con cautela per non causare una frattura distrazione durante il campionamento. Fissare il campione in 10% formalina neutra tamponata per 24 h a temperatura ambiente. Effettuare la decalcificazione con soluzione di Morse (citrato di sodio 10%, 20% acido formico) durante la notte a 4 ° C.</li>
</ol>

<ol><li>Watson, J. T. <a target="_blank" href="https://journals.lww.com/jaaos/Fulltext/2006/00001/Distraction_Osteogenesis.37.aspx">Distraction osteogenesis.</a> The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 14, 168-174 (2006).</li>
<li>Ilizarov, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tension-stress+effect+on+the+genesis+and+growth+of+tissues%3A+Part+II.+The+influence+of+the+rate+and+frequency+of+distraction%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Orthopaedics+and+Related+Research%22%5BJournal%5D)">The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues: Part II. The influence of the rate and frequency of distraction.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 239, 263-285 (1989).</li>
<li>Wan, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18184809">Activation of the hypoxia-inducible factor-1 alpha pathway accelerates bone regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 686-691 (2008).</li>
<li>Fujio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell-derived+factor-1+enhances+distraction+osteogenesis-mediated+skeletal+tissue+regeneration+through+the+recruitment+of+endothelial+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Stromal cell-derived factor-1 enhances distraction osteogenesis-mediated skeletal tissue regeneration through the recruitment of endothelial precursors.</a> Bone. 49 (4), 693-700 (2011).</li>
<li>Tong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+adhesion+kinase+expression+during+mandibular+distraction+osteogenesis%3A+evidence+for+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+reconstructive+surgery%22%5BJournal%5D)">Focal adhesion kinase expression during mandibular distraction osteogenesis: evidence for mechanotransduction.</a> Plastic and reconstructive surgery. 111 (1), 211-222 (2003).</li>
<li>Rhee, S. T., El-Bassiony, L., Buchman, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+signal-+related+kinase+and+bone+morphogenetic+protein+expression+during+distraction+osteogenesis+of+the+mandible%3A+in+vivo+evidence+of+mechanotransduction+mechanism+for+differentiation+and+osteogenesis+by+mesenchymal+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+reconstructive+surgery%22%5BJournal%5D)">Extracellular signal- related kinase and bone morphogenetic protein expression during distraction osteogenesis of the mandible: in vivo evidence of mechanotransduction mechanism for differentiation and osteogenesis by mesenchymal precursor cells.</a> Plastic and reconstructive surgery. 117 (7), 2243-2249 (2006).</li>
<li>Isefuku, S., Joyner, C. J., Simpson, A. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11062353">A murine model of distraction osteogenesis.</a> Bone. 27 (5), 661-665 (2000).</li>
<li>Tay, B. K., Le, A. X., Gould, S. E., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+and+molecular+analyses+of+distraction+osteogenesis+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Histochemical and molecular analyses of distraction osteogenesis in a mouse model.</a> Journal of Orthopaedic Research. 16 (5), 636-642 (1998).</li>
<li>Carvalho, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+angiogenesis+in+a+murine+tibial+model+of+distraction+osteogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">The role of angiogenesis in a murine tibial model of distraction osteogenesis.</a> Bone. 34 (5), 849-861 (2004).</li>
<li>Osawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+FGFR3+promotes+bone+formation+via+accelerating+endochondral+ossification+in+mouse+model+of+distraction+osteogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Activated FGFR3 promotes bone formation via accelerating endochondral ossification in mouse model of distraction osteogenesis.</a> Bone. 105, 42-49 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Quando un animale di grandi dimensioni viene utilizzato come modello sperimentale, può essere utilizzato un dispositivo di estensione già pronti, ed è facile da ottenere buon fissaggio e valutare l'operazione di estensione stessa e la quantità di estensione. Tuttavia, quando il mouse è utilizzato come modello sperimentale, è necessario sviluppare alcune o tutte le attrezzature. Isefuku et al. e Tay et al ha fatto il dispositivo e creato un mouse modello7,<sup class="xr...

L'osteogenesi di distrazione (DO) è un metodo di trattamento stabilito per una varietà di disturbi scheletrici, quali discrepanze di lunghezza degli arti, difetti dell'osso e di deformità degli arti1. Questa strategia di trattamento unico si basa sul "principio di tensione-stress" proposta da Ilizarov. Il metodo richiede diversi giorni per latenza, diverse settimane per attiva di distrazione e diversi mesi per il consolidamento, fino a quando l'osso maturo è formata2.
Le condizioni di ipossia locale a causa del blocco del sangue flusso3,4 e stimolazione meccanica5,6 sono particolarmente importanti nel processo di guarigione di DO. L'angiogenesi indotta da ipossia trasporta ossigeno, sostanze nutritive, fattori solubili e cellule necessarie per la riparazione dei tessuti localmente attraverso il flusso sanguigno. Lo stimolo meccanico dall'operazione di estensione provoca reazioni biologiche quali la differenziazione delle cellule staminali mesenchimali, formazione dell'osso, la calcificazione ed il ritocco. Seriale trattamento permette la formazione di non solo tessuti duri, ma anche dei tessuti molli, compresi i nervi, muscoli, vasi sanguigni e dei tessuti della pelle, senza la necessità di trapianto di cellule staminali. Di conseguenza, un modello è considerato un eccellente modello per analizzare la rigenerazione di vari tessuti.
Conigli e cani sono gli animali più ampiamente usati nella ricerca di base per fare; Tuttavia, ci sono alcuni strumenti di analisi disponibili per questi animali. L'utilizzo di un modello di topo facilita un'analisi più dettagliata. È particolarmente adatto per esperimenti utilizzando topi knockout. Tuttavia, quando si utilizza un mouse come un animale sperimentale, un dispositivo di estensione deve essere creato. Qui, vi presentiamo un mouse tibial modello sviluppato utilizzando un distrattore su misura creato utilizzando uno strumento di laboratorio odontotecnico e tecnica, che è stato utilizzato in uno studio precedente.

<table><tbody><tr><td>Cera di paraffina</td><td>YAMAHACHI DENTAL MFG. CO.</td><td>-</td><td>Per la preparazione di uno stampo per anelli in resina</td></tr><tr><td>Labocone putty</td><td>GC</td> <td>Corporation-Per</td> <td>la preparazione di uno stampo per anelli in resina</td></tr><tr><td>Cera di utilità</td><td>GC</td> <td>Corporation-Per</td> <td>la preparazione di uno stampo per anelli in resina</td></tr><tr><td>Vite ad espansione</td><td>Ortho Dentaurum</td><td>600-301-30</td><td>Componente di distrattore su misura</td></tr><tr><td>Unifast III</td><td>GC Corporation</td><td>-</td><td>Resina a polimerizzazione immediata Componente del distrattore su misura</td></tr><tr><td>Ortho Crystal</td><td>NISSIN-Resina</td><td></td> <td>trasparente Componente del distrattore su misura</td></tr><tr><td>Ago da 25 G</td><td>TERUMO</td><td>NN-2516R</td><td>Per distrattore su misura</td></tr><tr><td>Ago da 27 G</td><td>TERUMO</td><td>NN-2719S</td><td>Per distrattore su misura</td></tr><tr><td>Mouse ICR</td><td>Chubu Kagaku Shizai</td> <td>Corporation-Experimental</td><td> animale</td></tr><tr><td>Somnopentyl</td><td>Kyoritsu</td> Seiyaku-Pentobarbital <td></td><td>sale sodico</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>099-06571</td><td>Soluzione per inalazione di isoflurano</td></tr></tbody></table>

un modello di osteogenesi di distrazione del topo

A Mouse Distraction Osteogenesis Model

L'osteogenesi di distrazione (DO) è una procedura chirurgica che comporta la rigenerazione del tessuto scheletrico senza trapianto di cellule. Un modello si compone dei seguenti tre fasi: la fase di latenza dopo osteotomia e posizionamento del distrattore esterno; la fase di distrazione, in cui l'estremità dell'osso separati sono gradualmente e continuamente distratto; e la fase di consolidamento. Questo distrattore su misura utilizzato per è composto da due anelli di resina acrilica incompleto e un tassello ad espansione. Il processo è stato avviato facendo uno stampo con il materiale da impronta in silicone e quindi creando il distrattore su misura. Resina dentale è stata versata nella cassaforma fatta di materiale da impronta in silicone, ed è stato permesso di polimerizzare per creare anelli incompleti resina necessari per il distrattore su misura. Questi anelli sono stati fissati con una vite di espansione utilizzando resina trasparente. Il distrattore su misura creato tramite questo approccio è stato fissato alla tibia di topi. La tibia è stata fissata al dispositivo utilizzando una coppia di aghi 25g prossimalmente, una coppia di aghi 27 G distalmente e resina acrilica. Dopo un periodo di latenza di 5 giorni, la distrazione è stata avviata a una velocità di 0,2 mm/12 h. L'allungamento è stato continuato per 8 giorni, risultando in uno spazio totale di 3,2 mm. I topi sono stati sacrificati 4 settimane dopo la distrazione. Formazione dell'osso nello spacco di distrazione è stata confermata usando sia la radiografia e l'istologia.

Figure 1A e 1B presentano anelli incompleti (esterno diametro, 20 mm interno diametro, 10 mm; spessore 5 mm) con cera di paraffina. Due modelli in cera sono stati incorporati nel materiale da impronta in silicone, e uno stampo per gli anelli di resina (Figura 1C) è stato formato. Resina polimerizzata immediatamente è stata versata in questo stampo, e anelli di resina sono stati ottenuti (...

Vi presentiamo un modello di osteogenesi di distrazione tibial del topo sviluppato utilizzando un distrattore su misura. L'uso di un mouse come un obiettivo di analisi è vantaggioso per far progredire la ricerca.

Un modello di osteogenesi di distrazione del topo

Distraction osteogenesis (DO) is a surgical procedure that involves skeletal tissue regeneration without cell transplantation. A DO model consists of the ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della rigenerazione dei tessuti duri e molli. Il principale vantaggio di questa tecnica è che l'uso di un topo consente un'analisi dettagliata della rigenerazione ossea. Inizia con un topo adulto completamente anestetizzato.Radere e disinfettare con cura l'area chirurgica con una soluzione di iodio al 10%. Quindi, somministrare lo 0,5% di cloridrato di lidocaina all'arto inferiore destro. Quindi, dopo aver fatto un'incisione longitudinale della pelle di 15 millimetri nella parte inferiore destra della gamba con un bisturi numero 15, separare senza mezzi termini i muscoli sottostanti, facendo attenzione a non rimuovere tutto il periosteo.Quindi, taglia la fibula con le forbici. Afferrare la caviglia con pini stretti e sottili e utilizzare un ago calibro 27 per fare un buco nell'osso, a circa cinque millimetri dal tallone. L'ago dovrebbe penetrare nella pelle, nell'osso e nella pelle in quell'ordine.Quando l'ago penetra completamente, tagliare la punta e la radice con un nipper in modo che l'ago sia di circa 15 millimetri. Fai un altro buco allo stesso modo, circa due o tre millimetri prossimali. Quindi, tieniti intorno alla caviglia e passa un ago calibro 25 sotto il ginocchio allo stesso modo.Dopo che l'ago penetra, tagliare la punta e la radice con un nipper. Fai un altro buco nello stesso modo, circa due o tre millimetri distali. Posizionare il distrattore su misura in modo che sia parallelo alla direzione di estensione.Fissare gli aghi e il dispositivo con una resina dentale di polimerizzazione sufficiente per riempire le scanalature del dispositivo. Attendere il completamento della polimerizzazione, che dovrebbe richiedere circa cinque minuti. Quindi, pur essendo molto attenti a non danneggiare i tessuti circostanti, tagliare il centro della diafisi della tibia usando un disco di taglio molto sottile mentre si applica una soluzione salina.Chiudere la ferita con una sutura di nylon 4-0. Soerere iniezioni sottocutanee di buprenorfina per l'analgesia subito dopo l'intervento chirurgico. Ci sono vari rapporti sul periodo di latenza e sul tasso di distrazione, ma qui vengono mostrati protocolli rappresentativi.Dopo un periodo di latenza di cinque giorni, inizia la procedura di distrazione. Per l'estensione, utilizzare il perno collegato alla vite di rapida espansione. Spostare il perno nella direzione della freccia gialla attaccata alla vite di estensione.Tenere la coda con il mignolo e il palmo della mano e fissare il dispositivo di estensione con l'indice e il pollice. Eseguire l'estensione spostando il perno nella direzione della freccia gialla di 0,2 millimetri per un quarto di giro. Continuare l'allungamento alla velocità di 0,2 millimetri ogni 12 ore per otto giorni, il che si tradurrà in uno spazio totale di 3,2 millimetri.Questa immagine mostra i tipici risultati della radiografia a quattro settimane dalla distrazione nel modello. L'osso appena formato è visto nel sito di distrazione. Qui si vedono risultati di colorazione di ematossilina ed eosina.Fu osservato un ponte osseo di nuova formazione, e l'osso appena formato poteva essere facilmente distinto dall'osso nativo. Abbiamo presentato un modello TIBIAL DO per mouse sviluppato utilizzando un distrattore su misura. L'uso di un modello DO del mouse facilita un'analisi più dettagliata.È particolarmente adatto per esperimenti che utilizzano topi knockout.

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