Name: In Vivo Photolabeling delle cellule del colon per valutare il potenziale migratorio delle cellule ematopoietiche in topi neonatali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Impara la tecnica di fotolabeling in vivo nel colon di topi neonati per tracciare le cellule ematopoietiche verso siti extra-intestinali. Questo metodo avanzato consente di studiare le interazioni tra ospite e microbioma nel sistema immunitario neonatale.

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Nitya Jain è stato sostenuto da un premio di transizione di carriera NIH/NIAID 1K22AI116661-01.

Tutte le procedure degli animali sono state effettuate con l'approvazione di e conforme ai istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) presso il Massachusetts General Hospital.
Attenzione: Questo protocollo prevede l'utilizzo di un laser di classe 3b (LG3). LG3 laser occhiali di sicurezza devono sempre essere utilizzati quando si opera questo laser. Opportune linee guida formazione e sicurezza devono essere seguite per evitare il rischio di lesioni.
1. progettazione e assemblaggio di Laser
<ol><li>Collegare il diodo luminoso (LED) (405 nm, 19,3 mW, mA 1400, accoppiati in fibra) al LED driver tramite il cavo del connettore M8 a 4 pin che viene collegato al LED. Serrare la vite per fissare il raccordo.</li>
	<li>Prima di collegare il cavo di patch optogenetica al LED, tenere il connettore apertura del LED fino alla luce affinché non ci siano ostruzioni visibili. Colpo sul foro per eliminare eventuali ostruzioni Se necessario e inserire il cavo di patch optogenetica nell'apertura.</li>
	<li>Collegare la cannula di fibra ottica per il cavo di patch optogenetica inserendo la cannula in entrambe le estremità del manicotto connettore. Collegare l'altra estremità del manicotto connettore per il cavo di patch.  Applicare una pressione sufficiente a garantire la connessione, ma fare attenzione a non piegare o rompere la fibra ottica nella cannula. Nota: La cannula di fragile fibra ottica è coperto con il cappuccio di protezione ogni volta che il laser non è in uso.</li>
	<li>Impostare il driver di LED per la modalità onda continua (CW) con la manopola di regolazione continua a 0 e il limite di corrente impostato su 1,2 A.</li>
</ol>2. fotoconversione delle cellule del colon
Nota: Topi maschi e femmine sono stati esposti alla luce di intracolonic 405 nm 1-2 giorno (i) dopo la loro nascita e sono stati sacrificati prima di 1 settimana di età.
<ol><li>Garantire un luogo buio con un accesso ad una presa elettrica. Inserire il driver del LED la presa. Nota: Questa procedura viene eseguita nella minima luce bianca come una lunga esposizione dei topi alla luce dell'ambiente può causare un indesiderato fotoconversione delle cellule. Luce rossa è utilizzato come alternativa. Attenzione: Il passo successivo prevede l'utilizzo di un animale anestetico. La somministrazione di anestetico si svolge in una cappa di classe II o utilizzando un altro sistema di lavaggio appropriato. L'inalazione dell'anestetico può causare capogiri, sonnolenza o anche uno stato di incoscienza.</li>
	<li>Anestetizzare il mouse dall'esposizione all'isoflurano 4-5% a 100% O2 in una scatola di induzione. Verificare la corretta profondità di anestesia pinzando saldamente una zampa posteriore (nessuna risposta). Mantenere l'anestesia tramite un cono di naso a circa il 2% isoflurane. Evitare l'esposizione del gestore a isoflurano dall'uso di un'appropriata cappa o anestetico dispositivo scavenging.</li>
	<li>Posizionare il mouse anestetizzato per l'esposizione di intracolonic utilizzando 1 mano a collottola sul retro del mouse delicatamente con il dito indice e il pollice. Capovolgi il mouse per esporre l'addome. Se il mouse comincia a perdere il suo colore rosa o se il tasso di respirazione inizia a rallentare, allentare la presa. Fissare la coda del mouse tra l'anulare e il mignolo.</li>
	<li>Con l'altra mano, rimuovere il cappuccio protettivo dalla cannula. Pur mantenendo l'asse lungo della cannula parallela alla linea mediana del mouse, inserire delicatamente la cannula di fibra ottica attraverso l'ano nel colon affinché tutti i 5mm della fibra ottica sono all'interno del mouse. Nota: Questa procedura viene eseguita lentamente e con attenzione a non forare la parete colica. Minuto dimenando e torsione della cannula aiuta l'avanzamento nel colon.</li>
	<li>Indossare gli occhiali di sicurezza e aumentare il laser corrente al valore massimo (tutto in senso orario). Confermare la presenza di luce UV guardando l'addome traslucido del mouse. Nota: Gli occhiali di protezione laser LG3 diminuiscono drasticamente la visibilità. Sono un collega (dispositivi di protezione da portare) aiutare a indossare gli occhiali e accendere il laser.</li>
	<li>Esporre il colon per la luce laser per un totale di 2 min. ritirare la cannula circa 1 mm ogni 30 s per massimizzare l'area luminal esposto alla luce. Alla fine di 2 min, spegnere il laser.</li>
	<li>Rimuovere lentamente la cannula dal mouse. Dopo il recupero dall'anestesia in una gabbia calda vuota, tornare il mouse dalla gabbia.</li>
</ol>3. isolamento dei linfociti intestinali
<ol><li>Preparare 1 L di tampone di siero (HBSS/CS) soluzione salina bilanciata/vitello di Hank, 200 mL di tampone epiteliale striscia, 500 mL di lavaggio mezzi e 200 mL dell'acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)-lavare i media liberi. Nota: I volumi di reagente sono calcolati per una dimensione del campione di 9.<ol>
<li>Rendere il buffer HBSS/CS (HBSS; 5% CS) aggiungendo 50 mL di CS a 950 mL di HBSS. Memorizzata sul ghiaccio.</li>
		<li>Preparare il tampone di striscia epiteliali [HBSS; 5% CS; 1 mM dithiothreitol (DTT); 5 mM EDTA acido di 15mm 4-(2-Hydroxyethyl) piperazina-1-etansolfonico (HEPES) (pH 7.2-7.5)] aggiungendo 10 mL di CS, 200 µ l di 1 M DTT, 2 mL di EDTA 0.5 M e 3 mL di tampone HEPES 1m a 185 mL di HBSS. Posto il buffer di striscia epiteliale in bagnomaria a 37 ° C.</li>
		<li>Fai il media di lavaggio (HBSS; 1% CS; 1 mM EDTA) aggiungendo 5 mL di CS e 1 mL di EDTA 0,5 M a 494 mL di HBSS. Conservare a temperatura ambiente.</li>
		<li>Preparare il supporto di lavaggio senza EDTA (HBSS; 1% CS; 15 mM HEPES) con l'aggiunta di 2 mL di CS e 3 mL di 1 M HEPES a 195 mL di HBSS. Conservare a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rendere un FACS buffer [1x tamponato fosfato salino (PBS) (pH = 7.2); 2% CS] con l'aggiunta di 10 mL di CS a 490 mL di PBS. Memorizzata sul ghiaccio.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare il piatto di raccolta del tessuto inserendo un colino di cella µm 70 all'interno di una piastra di coltura 60 x 10 mm. Aggiungere 10 mL di tampone HBSS/CS (HBSS; 5% buffer di CS effettuata nel passaggio 3.1.1 e conservati nel ghiaccio) al piatto e posizionarlo sul ghiaccio.</li>
	<li>Eutanasia il mouse tramite un'overdose di inalazione isoflurane utilizzando lo scavenging appropriato di anestetico (un'esposizione di circa 3 min a > 4% isoflurane nell'aria della stanza o in 100% O2). Dopo apparente cessazione della respirazione e reflex movimento, verificare l'assenza di dolore profondo pinzando saldamente una zampa posteriore (usando il forcipe è consigliato). Garantire l'eutanasia tramite una decapitazione utilizzando un paio di forbici chirurgiche o un rasoio nuovo. Nota: Dislocazione cervicale non è raccomandata per questo passo a causa delle dimensioni e l'età dell'animale. Questi metodi sono coerenti con le linee guida AVMA 2013 sull'eutanasia e approvato dal MGH IACUC.</li>
	<li>Raccogliere il colon usando pulite pinze e le forbici per aprire l'addome. Riflettere gli intestini al 1 lato dell'addome del mouse per esporre i due punti. Rimuovere tutto il colon transecting primo esso appena distale (verso l'ano) al cieco. Quindi, mentre afferrando saldamente i due punti con il forcipe, usare le forbici per tagliare attraverso l'uretra, il retto. Tagliare i due punti come vicino all'ano come possibile. Raccogliere la milza dopo la rimozione del colon (Vedi punti 4.1-4.2 qui sotto). Nota: Mentre il protocollo di fotoconversione destinato solo a ~ 25% dei due punti del neonato (5 mm della cannula fibra ottica), tutto il colon è raccolto per facilitare l'isolamento delle cellule.</li>
	<li>Pulizia del colon usando il forcipe per spingere il contenuto fuori del colon e su un tovagliolo di carta a secco. Omogeneizzare il tessuto utilizzando lamette per tritare finemente i due punti in una pasta sulla copertina di una piastra di coltura e poi trasferire questa pasta al filtro cella in di Petri.</li>
	<li>Aggiungere un ancoretta magnetica lunga 8mm pulito il filtro e collocare il piatto su un piatto di agitatore magnetico 9-posizione. Impostare la velocità di barra magnetica a 800 giri/min e incubare le cellule per 5 min a temperatura ambiente. Scartare il buffer e ripetere il lavaggio utilizzando 10 mL di HBSS/CS (L'HBSS; 5% buffer di CS effettuata nel passaggio 3.1.1 e conservati nel ghiaccio). Scartare il buffer alla fine del lavaggio.</li>
	<li>Dissociare le cellule epiteliali con l'aggiunta di 10 mL di tampone preriscaldati striscia epiteliale (L'HBSS; 5% CS; 5mm EDTA; 1 millimetro DTT, tampone HEPES [pH 7.2-7.5] di 15mM che è stato fatto nel passaggio 3.1.2 e memorizzati in bagnomaria a 37 ° C) al filtro cella e mescolare a 800 rpm per 30 min in un 3 Incubatrice di 7 ° C. Al termine dell'incubazione, l'arricchito nella frazione epiteliale ad un tubo pulito da 15 mL di buffer di trasferimento. Nota: L'epitelio e associato le cellule (cellule epiteliali intestinali e i linfociti epiteliali intestinali) vengono rilasciate nel buffer, mentre le cellule nel intatto della lamina propria rimangono sul filtro cella durante questo passaggio11.<ol>
<li>Centrifugare la frazione epiteliale intestinale arricchita (IELs) a 700 x g per 5 min a temperatura ambiente. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone di FACS. Memorizzarlo sul ghiaccio per uso nel punto 3.15.</li>
	</ol></li>
	<li>Lavare la frazione della lamina propria all'interno del filtro cella 2 x con HBSS/CS. A tale scopo, aggiungere 10 mL di soluzione HBSS/CS (HBSS; buffer di CS 5% che è stato fatto nel passaggio 3.1.1 che è stato memorizzato sul ghiaccio) al filtro cella e mescolate a 800 rpm per 5 min in un incubatore a 37 ° C. Eliminare il buffer dopo ogni lavaggio.</li>
	<li>Lavare il campione 2 x lavaggio media. Aggiungere 10 mL di lavaggio media (HBSS; 1% CS; soluzione tampone dell'EDTA 1 mM che è stato fatto nel passaggio 3.1.3 e conservato a temperatura ambiente) al filtro cella e mescolate a 800 rpm per 15 min in un incubatore a 37 ° C. Eliminare il buffer dopo ogni lavaggio.<ol>
<li>Dopo aver utilizzato i media di lavaggio, memorizzarlo sul ghiaccio per l'utilizzo nel passaggio 3.14.</li>
	</ol></li>
	<li>Lavare il campione 2 x con HBSS/CS. aggiungere 10 mL di tampone HBSS/CS (HBSS; buffer di CS 5% fatta al punto 3.1.1 è stato archiviato in ghiaccio) al filtro cella e mescolate a 800 rpm per 5 min in un incubatore a 37 ° C. Eliminare il buffer dopo ogni lavaggio.</li>
	<li>Incubare il tessuto nel tampone di lavaggio senza EDTA. Aggiungere 10 mL di tampone di lavaggio senza EDTA (HBSS; 1% CS; tampone HEPES 15 mM che è stato fatto nel passaggio 3.1.4 e conservato a temperatura ambiente) al filtro cella e incubare la piastra per 10 min a temperatura ambiente senza mescolare. Scartare il buffer alla fine di questo passaggio.</li>
	<li>Lavare il campione 2 x con HBSS/CS e preparare la soluzione di enzima. Aggiungere 10 mL di HBSS/CS (HBSS; buffer di CS 5% effettuata nel passaggio 3.1.1 che è stato memorizzato sul ghiaccio) nel buffer al filtro cella e mescolate a 800 rpm per 10 min in un incubatore a 37 ° C. Eliminare il buffer dopo ogni lavaggio.<ol>
<li>Preparare la soluzione di enzima (privo di EDTA lavare buffer; 0,1 mg/mL dnasi I; collagenosi 167 mg/mL) durante il secondo periodo di lavaggio: aggiungere 9 mg di dnasi I e 15 mg di liofilizzato collagenosi a 90 mL di EDTA-free il tampone di lavaggio. Conservare la soluzione a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Digerire la frazione propria di lamina contenuta nel colino cella per ottenere i linfociti della lamina propria (LPLs). Aggiungere 10 mL della soluzione enzimatica (EDTA-libero il tampone di lavaggio; 0,1 mg/mL dnasi I; 167 mg/mL di tampone di collagenasi effettuata nel passaggio 3.12.1 e conservato a temperatura ambiente) al filtro cella e mescolate a 800 rpm per 45 min in un incubatore a 37 ° C. Nota: LPLs vengono rilasciati nella soluzione dopo la digestione enzimatica.<ol>
<li>Raccogliere la soluzione enzima contenente le celle e filtrarlo attraverso un colino di cella nuova in una provetta conica da 50 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Aggiungere 20 mL di media di lavaggio a freddo (L'HBSS; 1% CS; 1mM EDTA tampone fatta al punto 3.1.3 e memorizzati sul ghiaccio nel passaggio 3.9.1) alle cellule filtrate per bloccare l'attività della collagenosi nella soluzione degli enzimi. Centrifugare la provetta a 700 x g per 6 min a temperatura ambiente. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet contenente LPLs in 1 mL di tampone di FACS.</li>
	<li>Combinare la IEL (dal punto 3.7.1) e le frazioni LPL (dal punto 3.14) e li macchia con anticorpi coniugati fluorescenti per l'analisi cytometric di flusso (vedi passo 5). Nota: IEL e LPL frazioni possono essere macchiate separatamente se non si desidera informazioni di vano.</li>
</ol>4. isolamento dei linfociti dalla milza
<ol><li>Preparare il tubo di raccolta aggiungendo 500 µ l di tampone di FACS in un tubo del microcentrifuge. Memorizzarlo sul ghiaccio.</li>
	<li>Dopo aver rimosso i due punti (punto 3.4), raccogliere la milza intera e inserirlo nel tubo di raccolta. Conservare il tessuto sul ghiaccio.</li>
	<li>Utilizzando un omogeneizzatore del tessuto elettrico, omogeneizzare milza in una microcentrifuga per circa 1 min. Centrifugare il campione a 300 x g [micro centrifuga] per 5 min a temperatura ambiente e aspirare il sovranatante.</li>
	<li>Per eseguire la lisi dei globuli rossi, risospendere il campione in 500 µ l di tampone di lisi di ammonio-cloruro-potassio (ACK) per avviare la morte cellulare da lisi osmotica. Lasciare il campione Incubare per 1-2 minuti a temperatura ambiente e poi e risospendere in 725 µ l di tampone di FACS.</li>
	<li>Centrifugare il campione a 300 x g [micro centrifuga] per 5 min a temperatura ambiente e aspirare il sovranatante. Risospendere il pellet in 500 µ l di tampone di FACS e filtrarlo attraverso un colino di cella di 40 µm in un nuovo tubo del microcentrifuge. L'intero campione di trasferimento ad un nuovo tubo del microcentrifuge e macchia con anticorpi coniugati fluorescenti per l'analisi cytometric di flusso (vedi passo 5).</li>
</ol>5. identificazione di Dendra-r+ cellule tramite flusso Cytometry
<ol><li>Centrifugare i campioni IEL/LPL e milza a 300 x g [micro centrifuga] per 5 min a temperatura ambiente e aspirare il sovranatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 100 µ l di anticorpo che macchia mix. Preparare l'anticorpo che macchia mix aggiungendo 1 µ l di anticorpo fluorescente coniugato anti-CD45 a 100 µ l di tampone di FACS per campione. Nota: È importante a titolare gli anticorpi utilizzati per la citometria di flusso prima dell'esperimento per determinare la concentrazione ottimale dove si verifica la saturazione di associazione.</li>
	<li>Incubare i campioni per 35 min su ghiaccio (in un luogo buio).</li>
	<li>Risospendere i campioni a 300 µ l di tampone di FACS e li Centrifugare a 300 x g [micro centrifuga] per 5 min a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante e risospendere i campioni in 325 µ l di tampone di FACS. Analizzare i campioni su un citometro a flusso.</li>
</ol>

<ol><li>Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+interactions+of+the+intestinal+microbiota+and+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system.</a> Nature. 489, 231-241 (2012).</li>
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<li>Morton, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoscopic+photoconversion+reveals+unexpectedly+broad+leukocyte+trafficking+to+and+from+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

L'identificazione e la caratterizzazione delle cellule che interagiscono e sono influenzati dal microbiota del colon sono importanti e dovrebbero facilitare la comprensione di come le informazioni dal microambiente mucoso viene inoltrati al resto del corpo. Un metodo per studiare la migrazione delle cellule dell'intestino richiede l'isolamento di cellule associato all'intestino, seguita da un trasferimento adottivo in topi destinatari per determinare i modelli di tessuto-homing e funzione12,<...

Il tratto gastrointestinale dei mammiferi ospita centinaia di specie di batteri presenti in un rapporto simbiotico con l'host1. Le cellule immunitarie presenti nell'ambiente locale applicare una coesistenza pacifica con questi microbi e stabilire una barriera protettiva contro le invasioni di agente patogeno. Così, bi-direzionale interazioni tra le cellule immunitarie e il microbiota sono fondamentali per stabilire una comunità commensale che educa il sistema immunitario dell'ospite e imposta la soglia per la reattività immune agli agenti patogeni. Cambiamenti nel microbiche composizione, o disbiosi, può disturbano l'omeostasi immunitaria e perturbano circuiti regolatori che trattengono infiammazioni intestinali che portano a malattie immuno-mediate come diabete di tipo 1 e IBD2,3 .
Il periodo immediatamente dopo la nascita è un'unica finestra inerente allo sviluppo durante il quale le comunità microbiche intestinali cominciano a stabilire allo stesso tempo il sistema immunitario matura4. Il microbiota postnatale non è stabile, con variazioni nella composizione della comunità che si verificano naturalmente e frequentemente5. Le cellule immunitarie che interagiscono con il microbiota risiedono in due distinte posizioni anatomiche nell'intestino - della propria di lamina e l' epitelio intestinale6. Numerosi tipi di cellule immunitarie sono presenti nell'intestino, compreso i linfociti (ad esempio cellule T, cellule B e cellule linfoidi innate) così come le cellule mieloidi (che includono macrofagi, monociti e cellule dendritiche). Queste cellule, anche conosciuto come cellule ematopoietiche, eseguono una moltitudine di funzioni che preservare la barriera intestinale e mantenere l'omeostasi.
Oltre alle loro funzioni di regolamentazione presso siti intestinali, le cellule immuni della mucosa possono anche portare messaggi microbici ai siti extra-intestinali per regolare l'immunità sistemica7,8,9. Questa è un'area di crescente interesse per la ricerca e sottolinea la necessità di metodi per identificare le cellule immunitarie che migrano dai tessuti intestinali al fine di sondare la loro funzione. Il protocollo segnalato qui utilizza un modello di topo commercialmente disponibili in cui viene sfruttata una proteina fluorescente fotoconvertibile alle cellule di etichetta. PhAMasportato topi ubiquistmente esprimono una proteina fluorescente verde di Dendra2 che è irreversibilmente passata a fluorescenza rossa al momento dell'attivazione di raggi ultravioletti (UV) luce10. Utilizzando una cannula di fibra ottica per consegnare 405 nm luce nel colon dei topi neonati, dimostriamo che le cellule ematopoietiche photoconverted, che hanno provenuto o transitato attraverso il colon possono essere trovate nella milza.

<table><tbody><tr><td>Laser</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light Emitting Diode (LED)</td><td>THORLABS</td><td>M405FP1</td><td>ATTENZIONE: questo è un laser di Classe 3b. Quando si utilizza il laser, è necessario indossare occhiali di sicurezza. Emette una lunghezza d'onda di 405 nm con una corrente di 1400 mA. È accoppiato in fibra. Accetta il connettore SMA. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1</td></tr><tr><td>driver LED</td><td>THORLABS</td><td>LEDD1B</td><td>Pilota una corrente costante di 1200 mA attraverso il laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616</td></tr><tr><td>Cavo patch Optogenetics</td><td>THORLABS</td><td>M87L01</td><td>Cavo lungo 1 m con connettore SMA. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454</td></tr><tr><td>Cannula in fibra ottica</td><td>Lenti doriche&nbsp;</td><td>MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45 Cannula</td><td>lunga 5 mm con diametro esterno di 500 &; m e un diametro interno di 480 &micro;m. Il valore NA è 0,5. La ghiera è in zirconia, diametro esterno di 1,25 mm. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036</td></tr><tr><td>Alimentatore</td><td>THORLABS</td><td>KPS101</td><td>Alimenta 15 V con una corrente di 2,4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101</td></tr><tr><td>occhiali di sicurezza laser LG3.</td><td>Lenti THORLABS</td><td>LG3</td><td>Orange con trasmissione della luce visibile del 47% https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523</td></tr><tr><td>luce rossa&nbsp;</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>74327-10</td><td>Lampada da 15 W https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences</td></tr><tr><td><forte>Isolamento delle cellule intestinali</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Patterson Veterinario</td><td>07-893-1389</td><td>ATTENZIONE: l'inalazione di questo anestetico può causare vertigini, sonnolenza o persino perdita di coscienza. Questo anestetico dovrebbe essere utilizzato in una cappa di Classe II. https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3</td></tr><tr><td>1X HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025076</td><td>Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076</td></tr><tr><td>siero di vitello</td><td>Hyclone AZM</td><td>197696</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td>concentrazione 0,5 M https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td>ATTENZIONE: nocivo se ingerito e provoca irritazione cutanea. Concentrazione 1 M https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>Piastra di Petri con https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080 di concentrazione</td></tr><tr><td></td><td>1 M Corning</td><td>353004</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F</td></tr><tr><td>Filtro cellulare da 70 micron</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712</td></tr><tr><td>Agitatore micromagnetico</td><td>Fisherbrand</td><td>1451364</td><td>Sciacquare con etanolo al 70% dopo ogni utilizzo. Sciacquare più volte in acqua distillata prima di ogni utilizzo. La barra è lunga 8 mm con una forma ottagonale. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364</td></tr><tr><td>Piastra di agitazione magnetica</td><td>Agitatori da laboratorio Corning</td><td>440826</td><td>https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en&region=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en&region=US 1X PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027</td></tr> <tr><td></td><td>Pipetta sierologica da 14387165 Thermo Scientific https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165 10 mL Falcon</td><td></td><td>357530</td> https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipetta sierologica da 25 mL</td><td>Falcon</td><td>357515</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td></tr><tr><td>provetta da centrifuga conica da 15 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td></tr><tr><td>provetta da centrifuga conica da 50 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>339653 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td></tr><tr><td>Sospensione a cellula singola</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provette Eppendorf</td><td>Seal-Rite</td><td>1615-5500</td><td>Contiene 1,5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx</td></tr><tr><td>Omogeneizzatore tissutale&nbsp;</td><td>Kimble</td><td>K7495400000</td><td>Richiede 2 batterie AA. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000</td></tr><tr><td>Punte per omogeneizzatore&nbsp;</td><td>Kimble</td><td>7495210590</td><td>Plastic, puntali da 0,5 mL https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590</td></tr><tr><td>tampone di lisi ACK</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01</td></tr><tr><td>Filtro cellulare da 40 micron</td><td>Falcon</td><td>08-771-1</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711</td></tr><tr><td>Anticorpi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BV786 anti-topo CD45&nbsp;</td><td>BD</td><td>564225</td><td>Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225</td></tr><tr><td>Live/Dead</td><td>Invitrogen</td><td>L34962</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962</td></tr><tr><td>Other</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Razor lame</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Utilizzare per la decapitazione. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades</td></tr></tbody></table>

in vivo photolabeling delle cellule del colon per valutare il potenziale migratorio delle cellule ematopoietiche in topi neonatali

In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

Comunità batteriche enteriche sono stabilite all'inizio della vita e influenzano la funzione e lo sviluppo delle cellule immuni. Il microbiota neonatale è suscettibile di numerose influenze esterne, tra cui l'uso di antibiotici e dieta, che urta la suscettibilità alle malattie autoimmuni ed infiammatorie. Disturbi come la malattia di viscere infiammatoria (IBD) sono caratterizzati da un massiccio afflusso di cellule immuni agli intestini. Tuttavia, le cellule immunitarie condizionate dal microbiota possono inoltre emigrare fuori gli intestini per influenzare le risposte immunitarie a siti extra-intestinali. Così, c'è una necessità di identificare e caratterizzare le cellule che possono trasportare messaggi microbici dall'intestino ai luoghi distali. Qui, descriviamo un metodo alle cellule di etichetta nel colon dei topi neonati in vivo che consenta la loro identificazione presso siti extra-intestinali dopo la migrazione.

Un cavo in fibra ottica è stato utilizzato per trasportare 405 nm luce in due punti dei topi diasportato 2 - giorno-vecchi PhAM. In precedenti esperimenti, un 30 s esposizione era deciso a dare una massima fotoconversione delle cellule del colon con minima citotossicità (Figura 1A). Di conseguenza, sequenziale 30 esposizioni di s dei diversi segmenti del colon sono state effettuate come descritto nel protocollo. In seguito l'esposi...

Il protocollo descritto qui utilizza un approccio di photolabeling in topi neonati per identificare in modo specifico le cellule immuni che emigrano dal colon in siti extra-intestinali. Questa strategia sarà utile per studiare le interazioni ospite-microbiome nella vita in anticipo.

In Vivo Photolabeling delle cellule del colon per valutare il potenziale migratorio delle cellule ematopoietiche in topi neonatali

Enteric bacterial communities are established early in life and influence immune cell development and function. The neonatal microbiota is susceptible to ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia della mucosa per quanto riguarda le interazioni del microbioma immunitario dell'ospite neonatale, come ad esempio le cellule trasportano messaggi microbici e, in caso affermativo, quali cellule sono? Il vantaggio principale di questa tecnica è che in modo non specifico e irreversibile marca le cellule residenti nel colon nei topi neonati, permettendoci di determinare i loro modelli di traffico verso siti extra-intestinali. Per assemblare il laser, collegare il diodo a emissione di luce o LED al driver del LED tramite il cavo del connettore M8 a quattro pin del LED e serrare accuratamente la vite per fissare il collegamento.Tenere l'apertura del connettore del LED verso la luce per assicurarsi che non vi siano ostacoli visibili. Inserire il cavo patch optogenetico nell'apertura. Inserire la cannula in una delle estremità del manicotto del connettore.Quindi collegare l'altra estremità del manicotto del connettore all'estremità del cavo patch, collegando la cannula in fibra ottica al cavo patch in fibra ottica. Utilizzare la manopola di regolazione continua per impostare il driver LED sulla modalità a o

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Questo articolo descrive un metodo per l'etichettatura di pelle embrionale e vasi sanguigni timo.

Un metodo per l&#39;etichettatura vasi embrionali nei topi

Citomegalovirus (HCMV), l'infezione umana di neonati rappresenta una importante causa di ritardo mentale, ma gli eventi molecolari che portano alla indotta da virus patogenesi sono ancora poco conosciuti. Per indagare le dinamiche di infezione del cervello, abbiamo adattato...

Uso di<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging per monitorare la progressione della Sperimentale mouse infezione da citomegalovirus nei neonati

Descriviamo un protocollo generale per il monitoraggio in vivo cella utilizzando la risonanza magnetica in un modello di topo con cellule ex vivo etichettati. Un tipico protocollo di marcatura delle cellule, elaborazione acquisizione delle immagini e la quantificazione è inclusa.

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Combinatorie 5 proteine ​​fluorescenti marcatura di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche consente il monitoraggio in vivo clonale tramite confocale e microscopia a due fotoni, fornendo approfondimenti midollo osseo emopoietico architettura durante la rigenerazione. Questo metodo permette di mappatura destino non invasiva di cellule HSPCs derivate spettralmente-codificati nei tessuti intatti per lunghi periodi di tempo dopo il trapianto.

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La natura delle interazioni tra staminali e progenitrici di cellule ematopoietiche (HSPCs) e nicchie di midollo osseo è poco conosciuta. Modifiche hardware personalizzato e un protocollo di acquisizione multi-step consentono l'utilizzo di due fotoni e microscopia confocale per immagine ex vivo HSPCs etichettati homed all'interno delle aree del midollo osseo, interazioni monitoraggio e movimento.

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I monociti sono regolatori chiave dell'immunità innata e svolgono un ruolo critico nel rinnovamento del sistema fagocitario mononucleare periferico e in caso di infiammazione. Questo manoscritto descrive la procedura di imaging in tempo reale del midollo osseo calvaria di topo per studiare il meccanismo di mobilizzazione dei monociti.

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Descriviamo un protocollo per monitorare il comportamento dei neutrofili e dei monociti nelle vene mesenteriche in condizioni stazionarie e infiammatorie utilizzando la microscopia confocale intravitale su topi anestetizzati.

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I meccanismi che regolano la motilità interstiziale di cellule CD4 T effettrici in siti di infiammazione sono relativamente sconosciuti. Presentiamo un approccio non invasivo per visualizzare e manipolare cellule CD4 T vitro -primed nel derma dell'orecchio infiammate, permettendo studio del comportamento dinamico di queste cellule in situ.

Imaging CD4 T cellule interstiziali migrazione nel derma infiammate

Protocolli per la valutazione quantitativa della chemiotassi dei linfociti e la migrazione sono strumenti importanti per la ricerca in immunologia. Qui, un protocollo in vitro è descritto che permette in tempo reale, multiplexed valutazione della migrazione cellulare, così come un complementare in vivo tecnica abilitazione rilevamento di cellule native alla milza.

Quantificazione del linfocita murino traffico In Vivo e chemiotassi del monocito umano In Vitro

Descriviamo un metodo per visualizzare gli IEL con etichettatura GFP utilizzando l'imaging intravitale dell'intestino piccolo murino mediante microscopia confocale del disco rotante invertita. Questa tecnica consente il monitoraggio delle cellule vive all'interno della mucosa fino a 4 h e può essere utilizzata per studiare una varietà di interazioni immuno-epiteliali intestinali.

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La migrazione dei neutrofili si basa sul rapido e continuo rimodellamento della membrana plasmatica in risposta al chemioattrattivo e alle sue interazioni con il microambiente extracellulare. Qui descritta è una procedura basata sulla microscopia subcellulare intravitale per studiare la dinamica del rimodellamento della membrana nei neutrofili iniettati nell'orecchio di topi anestetizzati.

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Impara la tecnica di fotolabeling in vivo nel colon di topi neonati per tracciare le cellule ematopoietiche verso siti extra-intestinali. Questo metodo avanzato consente di studiare le interazioni tra ospite e microbioma nel sistema immunitario neonatale.

In Vivo Photolabeling delle cellule del colon per valutare il potenziale migratorio delle cellule ematopoietiche in topi neonatali (Video) | JoVE Journal

In Vivo Photolabeling delle cellule del colon per valutare il potenziale migratorio delle cellule ematopoietiche in topi neonatali

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