Isolamento ed analisi di comunità microbiche nel suolo, rizosfera e radici negli esperimenti di erba perenne

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del microbioma del suolo, della rizosfera e dell'endosfera radicale, come ad esempio come la diversità della comunità microbica cambia in risposta al tipo di campione, al trattamento e al genotipo della pianta. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è adatta per esperimenti sul campo che richiedono un grande numero di campioni e la replicazione. A dimostrare la procedura saremo io e Stephanie Futrell, una studentessa laureata e tecnico di ricerca del mio laboratorio.

Per iniziare il protocollo, etichetta una leccarda e un secchio con un foglietto adesivo con i dettagli del campione della pianta. Portare il secchio etichettato sul terreno e lasciare la bacinella nella postazione di lavoro stabilita sul campo. Scegli e raccogli casualmente due piante per appezzamento da diverse aree all'interno del lotto.

Quindi, perfora il terreno con una pala a una profondità di 30 centimetri per tagliare una qualsiasi delle radici laterali che tengono la pianta nel terreno. Scava le radici delle piante facendo leva sulla pala e posiziona la zolla nel secchio etichettato. Riportare la benna alla postazione di lavoro sul campo.

Scuoti le radici e usa una vanga o una motozappa per rimuovere il terreno dalle radici. Indossare i guanti e posizionare le radici vicino alla stazione di lavorazione. Dopo aver scosso le radici, mescola il terriccio nella leccarda e rompi le zolle di terra con una motozappa portatile.

Metti un campione di terreno privo di detriti in una custodia con cerniera etichettata di 17,7 x 19,5 centimetri e posizionalo sul ghiaccio. Sterilizzare le forbici da potatura in etanolo al 70%. Usa le forbici sterili per asportare una varietà di radici, circa quattro o sei radici per pianta e ogni radice lunga circa nove a 12 centimetri.

Mettere le radici asportate in una provetta da 50 millilitri contenente 35 millilitri di tampone fosfato autoclavato con un tensioattivo come Silwet L-77. Agitare i tubi per due minuti per liberare la rizosfera dalla superficie delle radici. Migliora l'agitazione con un generatore e un vortice.

Con una pinza sterilizzata in etanolo al 70%, rimuovere le radici dal tubo, tamponarle brevemente su carta assorbente e metterle in un nuovo tubo da 50 millilitri etichettato. Posizionare sia il tubo contenente la rizosfera che quello contenente le radici sul ghiaccio. Aggiungere circa 35 millilitri di candeggina al 50% più lo 0,01% di Tween 20 ai tubi da 50 millilitri con le radici raccolte nel campo.

Agitare o agitare i tubi per 30-60 secondi. Versare la candeggina, aggiungere 35 millilitri di etanolo al 70% e agitare o agitare le radici per altri 30-60 secondi. Dopo l'agitazione, versare l'etanolo al 70% e aggiungere 35 millilitri di acqua sterile e ultrapura e agitare o agitare il campione per un minuto.

Ripeti la fase di risciacquo con acqua altre due volte in modo che la radice riceva un totale di tre risciacqui con acqua sterile e ultrapura. Tampona le radici su carta assorbente asciutta e pulita e usa un tovagliolo di carta pulito per ogni campione. Usando una pinza sterile e forbici da potatura, taglia le radici in pezzi di circa cinque millimetri e metti le radici tagliate in un tubo conico da 15 millilitri pulito ed etichettato, quindi conserva i campioni a meno 80 gradi Celsius fino a quando non vengono ulteriormente elaborati.

Agitare le provette da 50 millilitri contenenti campioni di rizosfera dal campo per 20-30 secondi per risospendere l'intero campione. Utilizzando un filtro sterile per celle a maglie da 100 micron, filtrare il campione risospeso in una nuova provetta da 50 millilitri. Quindi, centrifugare le provette a 3.000 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente.

Versare immediatamente e gettare il surnatante. Mettere i pellet di rizosfera nei tubi da 50 millilitri sul ghiaccio. Successivamente, aggiungere 1,5 millilitri di tampone fosfato sterile senza tensioattivo ai pellet della rizosfera e agitarli per risospendere il campione.

Pipettare il liquido sospeso in una provetta per microfuge da due millilitri pulita, etichettata. Centrifugare i tubi a 15, 871 volte g per due minuti a temperatura ambiente. Versare immediatamente il surnatante e scolare i tubi su carta assorbente pulita.

Conservare i pellet a meno 20 gradi Celsius fino a quando non vengono ulteriormente lavorati. Usando una spatola metallica sterile, riempi una provetta da due millilitri pulita ed etichettata con circa tre grammi di terreno per l'estrazione del DNA ed evita piccoli pezzi di radice e detriti. Sciacquare la spatola metallica in etanolo al 70% tra ogni campione.

Conserva questo campione di terreno a meno 20 gradi Celsius. In una bacinella pulita, svuotare il sacco di terra in setacci impilati con il setaccio più grande sopra il setaccio più piccolo e setacciare manualmente il terreno attraverso entrambi i setacci. Utilizzare una spazzola per pulire accuratamente i setacci tra i campioni.

Metti da parte da 100 a 125 grammi di terreno setacciato in un sacchetto con cerniera da 17,7 x 19,5 centimetri per future analisi fisico-chimiche e di consistenza del suolo. Posiziona i sacchi di terra a quattro gradi Celsius per una conservazione a breve termine. Quindi, versare l'azoto liquido in un bicchiere di plastica con spatole pulite e in un mortaio pulito.

Metti il fazzoletto congelato nel mortaio e macinalo con il pestello fino a ridurlo in polvere fine. Aggiungere continuamente azoto liquido durante la macinazione per mantenere i campioni congelati. Usa una spatola per trasferire il tessuto macinato in una provetta da due millilitri pulita ed etichettata, quindi conserva il tessuto a meno 80 gradi Celsius.

Pulisci l'area di lavoro con etanolo al 70% e candeggina domestica all'1%. Rimuovi i campioni di terreno dal deposito a meno 20 gradi Celsius e scongelali in un secchiello per il ghiaccio. Rimuovere il coperchio del tappetino sigillante da una piastra di estrazione a 96 pozzetti e posizionare il coperchio tra due salviette di carta per mantenerlo pulito quando non è in uso.

Coprire le 12 colonne della piastra con strisce adesive per PCR a 8 pozzetti per evitare la contaminazione. Tarare un imbuto di pesatura sterile di piccole dimensioni su una bilancia e pesare da 200 a 250 milligrammi di terreno. Sollevare con cautela la striscia adesiva, posizionare il collo dell'imbuto di pesatura pieno nell'apposito pozzetto e guidare delicatamente il campione di terreno nell'apposito pozzetto.

Riposizionare la striscia adesiva per coprire il pozzetto. Ripetere questo processo per ogni pozzetto, utilizzando un nuovo imbuto sterile per ogni campione. Riposizionare il coperchio del tappetino sigillante sulla piastra di estrazione e conservare la piastra a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'estrazione del DNA.

Rimuovere i campioni di rizosfera dal deposito a meno 20 gradi Celsius e scongelarli in un secchiello per il ghiaccio. Preparare la piastra di estrazione del DNA come fatto nella sezione precedente. Posizionare una salvietta di carta pulita su una bilancia, quindi tarare una spatola di metallo sterile sulla bilancia.

Utilizzare la spatola per estrarre con cura parte del pellet della rizosfera da una provetta per campioni. Pesare tra 200 e 250 milligrammi del campione di rizosfera. Sollevare con cautela la striscia adesiva per scoprire il primo pozzetto della piastra di estrazione.

Inclinare la spatola piena nel pozzetto e raschiare il materiale della rizosfera nel pozzetto appropriato con uno stuzzicadenti sterile. Sciacquare la spatola metallica in acqua seguita da etanolo al 70% tra i campioni. Infine, ripetere questo processo per ogni pozzetto della piastra fino a quando la piastra non è riempita, lasciando un pozzetto vuoto come controllo del bianco di estrazione.

In questo set di dati rappresentativo, c'erano differenze molto significative tra i tipi di campione e la rizosfera e il suolo sembrano essere più simili nella composizione tra loro rispetto alla radice. Ulteriori analisi mostrano che c'erano anche differenze molto significative nella composizione della comunità microbica tra rizosfera e suolo. L'analisi della diversità alfa mostra che le comunità microbiche nell'endosfera erano inferiori rispetto alle comunità nel suolo e nella rizosfera.

L'unica differenza significativa nella diversità tra le specie erbacee era tra i campioni dell'endosfera di grande bluestem e panico verga. L'analisi dell'abbondanza relativa evidenzia la predominanza dei Proteobatteri seguiti dagli Actinobatteri in tutti i tipi di campione. Il suolo e la rizosfera sono dominati da acidobatteri e cloroflexi, mentre le radici avevano una maggiore abbondanza relativa di batteriodi.

L'analisi di PERMANOVA di tutti i tipi di campioni ha evidenziato una differenza molto significativa nella composizione della comunità microbica dovuta alle specie vegetali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire una serie di passaggi da utilizzare nello studio dei microbiomi del suolo, dell'endosfera e della rizosfera. Vorremmo ringraziare il Nebraska EPSCoR e il National Science Foundation EPSCoR Research Infrastructure Program Track 1 per il finanziamento parziale di questo video educativo.