Differenza di potenziale nasale per quantificare il trasporto Trans-epiteliale ionico in topi
4 luglio 2018
Qui, presentiamo un protocollo per misurare la differenza di potenziale nasale nei topi. Il test quantifica la funzione dei trasportatori transmembrana di ioni come il regolatore di conduttanza del transmembrane di fibrosi cistica e il canale epiteliale del sodio. È utile per valutare l'efficacia di nuove terapie per la fibrosi cistica.
La differenza di potenziale nasale è un metodo prezioso per caratterizzare il fenotipo dei topi transgenici che modellano la fibrosi cistica. Permette di studiare l'efficacia di nuovi tipi di terapie per la fibrosi cistica. I principali vantaggi della tecnica sono che fornisce misurazioni affidabili nei topi che si riproducono continuamente.
Riduce la mortalità correlata e consente di ripetere il test nello stesso animale. Per preparare il catetere nasale a doppio lume, tenere il centro di un tubo di polietilene lungo 20 centimetri nella fiamma per circa 10-15 secondi fino a quando non è abbastanza morbido per essere tirato. Quindi, separare le due estremità per ottenere un tubo capillare molto sottile di circa 15 centimetri di lunghezza e un diametro esterno di 0,1 millimetri per la sonda nasale.
Successivamente, pulire e sgrassare i due capillari con etanolo puro. Uniscili con del nastro adesivo e incollali insieme usando la colla cianoacrilica. Tagliare via la lunghezza in eccesso delle sonde con una lametta per ottenere il catetere a doppio lume di circa otto centimetri di lunghezza.
Quindi, iniettare acqua attraverso entrambi i lumi per verificare che siano permeabili e fare un segno a una distanza di cinque millimetri dalla punta. Successivamente, preparare una miscela di panna mescolando la crema elettrolitica e la soluzione satura di potassio a tre molari in un rapporto di uno a uno, evitando la formazione di minuscole bolle d'aria. Per la configurazione sperimentale, per prevenire l'ipotermia durante e dopo il test, utilizzare due termofori, uno per la configurazione di misurazione e l'altro per la scatola in cui l'animale verrà posizionato per il recupero al termine del test.
Accendere il computer, che è collegato alla memoria dati ad alta impedenza di ingresso e voltmetro ad alta risoluzione. Quindi aprire il software per l'acquisizione dei dati. Collegare gli elettrodi al voltmetro.
Immergere la punta degli elettrodi nella miscela di panna. Controllare il valore iniziale di offset dell'elettrodo e scartare gli elettrodi se il valore è maggiore di più o meno due millivolt. Quindi, accendere la pompa peristaltica e inserire il tubo della pompa nel lume di perfusione del catetere nasale.
Riempire un lume del catetere nasale con una miscela di crema elettrolitica attraverso un puntale per pipetta da 10 microlitri. Adattare il catetere a un connettore del tubo in silicone e riempire il connettore con la miscela di crema. Successivamente, inserire l'elettrodo positivo nel connettore.
Controllare il valore di offset del ponte dell'elettrodo di misura e scartare i ponti se il valore è maggiore di più o meno due millivolt. Successivamente, collegare l'uscita prossimale del tubo della pompa al flaconcino contenente la soluzione selezionata per la perfusione nasale. Quindi collegare l'uscita distale del tubo della pompa al lume di perfusione del catetere nasale.
Quindi, riempire il secondo lume del catetere nasale con la soluzione fresca A1. Immergere la punta del catetere nasale nella fiala contenente la soluzione A.Invertire la direzione della pompa peristaltica per riempire la lunghezza del catetere nasale corrispondente a 10 secondi di perfusione. Successivamente, piegare un foglio di tessuto assorbente fino a realizzare un cuscino largo tre centimetri che servirà come supporto per la testa del topo. Coprire il termoforo con il foglio di tessuto assorbente.
Quindi, appoggia il mouse sul retro del termoforo e fissa gli arti e la coda al pad con del nastro adesivo. Successivamente, inserire il catetere endovenoso di riferimento nello spazio sottocutaneo di un arto posteriore. Rimuovere l'ago e adattarlo al connettore del tubo in silicone.
Riempire il catetere e il connettore con la miscela di crema. Quindi, collegare l'elettrodo di misurazione positivo al catetere nasale e l'elettrodo di riferimento negativo al catetere inserito nello spazio sottocutaneo nell'arto posteriore dell'animale. Quindi, fissare il catetere e l'elettrodo con del nastro adesivo secondo necessità per evitare qualsiasi spostamento.
Dopo aver posizionato l'elettrodo di riferimento e i ponti, verificare nuovamente il valore di offset del ponte dell'elettrodo di misura immergendo la punta del catetere nasale nella miscela di crema per elettrodi all'interno del connettore del catetere endovenoso. Registrare il valore di offset finale stabile. Ora, fissa le orecchie del mouse con del nastro adesivo sul termoforo in uno spazio libero tra i due pezzi di tessuto assorbente.
Fissa la vivacità senza toccare gli occhi. Per assorbire il liquido dalla cavità orale, muovere la lingua lateralmente e inserire uno stoppino appuntito di carta da filtro di circa un centimetro nella bocca. Per assorbire il liquido che fuoriesce dalla narice perfusa, posizionare un secondo pezzo di carta da filtro alla punta del naso.
Controllare il valore di controllo positivo del potenziale epiteliale posizionando la punta del catetere nasale all'interno della bocca. Tenendolo con una pinza fine e con una buona illuminazione diretta, introdurre delicatamente il catetere nasale in una narice, fino a quattro-sei millimetri dalla punta del naso. Cinque minuti dopo l'iniezione dei farmaci anestetici, inclinare delicatamente il termoforo di circa 30 gradi con la testa dell'animale verso il basso.
Monitorare il valore massimo basale della PD. Quando è stabile per oltre 30 secondi, iniziare a perfondere la mucosa nasale a 10 microlitri al minuto con le quattro soluzioni tamponate in successione. Perfondere la prima soluzione per 10 secondi e ciascuna soluzione successiva per cinque minuti, o fino a raggiungere una tensione stabile.
Smettere di perfondere Forskolin quando la risposta transitoria di Forskolin inizia a diminuire. Dopo la valutazione, rilasciare il mouse dal termoforo. Somministrarlo con la miscela di antagonisti anestetici e trasferirlo nella scatola di recupero con termoforo fino al completo recupero.
Di seguito sono riportati i tracciati nasali rappresentativi della PD da un topo omozigote normale e da un topo omozigote per la mutazione CFTR con delezione F508, insieme ai singoli valori ottenuti per i parametri della PD nasale. La risposta dell'amiloride è la differenza tra i valori di PD nasale alla fine e all'inizio della perfusione della mucosa nasale con soluzione salina tamponata basale contenente amiloride. La risposta libera da cloruri è la differenza tra i valori di PD nasale alla fine e all'inizio della perfusione della mucosa nasale con soluzione salina tamponata priva di cloruro, più amiloride.
La risposta della forskolina è la differenza tra i valori di PD nasale alla fine e all'inizio della perfusione della mucosa nasale con soluzione salina tamponata priva di cloruro, oltre a forskolina e amiloride. La risposta totale del cloruro è la somma degli ultimi due parametri ottenuti in perfusione di cloruro zero. Il progetto può essere utilizzato per esplorare, fornire il trasporto di disertori nel topo, ma anche nel moccioso, nel grande e nel modello di fibrosi cistica del furetto.
E disertori del trasporto del sodio nel modello murino eunuco. Tutti i trasportatori possono essere studiati adottando il protocollo. Lavorare nella cavità nasale dei roditori è estremamente delicato a causa della parete essenziale di input sensoriali provenienti dalla regione facciale nasale.
Un'adeguata morte dell'anestesia è dosata in modo particolarmente impegnativo quando si opera nella cavità nasale del topo.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per la misurazione della differenza di potenziale nasale nei topi, che quantifica la funzione dei trasportatori ionici transmembrana. Il metodo è particolarmente utile per valutare nuove terapie per la fibrosi cistica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia
- Modelli transgenici
Sfondo
- La differenza di potenziale nasale è un metodo per caratterizzare topi transgenici.
- È utile per valutare l'efficacia di nuove terapie per la fibrosi cistica.
- La tecnica presenta vantaggi per l'allevamento continuo di topi.
- Minimizza la mortalità associata e consente test ripetuti nello stesso animale.
Scopo dello studio
- Misurare la differenza di potenziale nasale nei topi.
- Valutare la funzione di trasportatori ionici come CFTR ed ENaC.
- Valutare l'efficacia di nuovi trattamenti per la fibrosi cistica.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di un catetere nasale a doppio lume.
- Misurazione della differenza di potenziale nasale in topi transgenici.
- Valutazione della funzione dei trasportatori ionici.
- Valutazione dell'efficacia della terapia.
Risultati principali
- Misure affidabili ottenute da topi in riproduzione continua.
- Riduzione della mortalità associata alle procedure di prova.
- Capacità di ripetere i test sullo stesso animale.
- Informazioni sull'efficacia di nuove terapie per la fibrosi cistica.
Conclusioni
- La differenza di potenziale nasale è un metodo prezioso per la ricerca sulla fibrosi cistica.
- Il protocollo migliora l'affidabilità delle misurazioni nei modelli murini.
- Questa tecnica supporta lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La misurazione della differenza di potenziale nasale (NPD) nei topi fornisce un'indicazione funzionale del trasporto ionico trans-epiteliale, consentendo la valutazione preclinica di terapie per la fibrosi cistica (CF). Quantificando l'attività di CFTR e di ENaC in vivo, il metodo supporta la validazione degli obiettivi terapeutici e la riduzione dei rischi meccanicistici nella fase iniziale della scoperta. La ripetizione del test nello stesso animale riduce la variabilità e migliora l'affidabilità predittiva per le decisioni di avanzamento o interruzione nello sviluppo di terapie per la fibrosi cistica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche misurando il trasporto funzionale di cloruro e sodio nei modelli murini di fibrosi cistica.
- Valore operativo: Consente la riduzione del rischio biologico dei modulatori del CFTR attraverso la fenotipizzazione diretta del trasporto ionico.
- Valore scientifico: Fornisce affidabilità predittiva discriminando i fenotipi di fibrosi cistica da quelli wild-type mediante risposte all'amiloride, alla privazione di cloruro e al forskolin.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per la standardizzazione dei saggi utilizzando cateteri nasali a doppio lume e perfusione controllata.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità mediante la verifica stabile dell'offset dell'elettrodo e protocolli di perfusione delle soluzioni costanti.
- Valore scientifico: Permette una valutazione affidabile dei composti misurando le risposte dei trasportatori ionici a soluzioni di amiloride, prive di cloruro e contenenti forskolina.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Mantiene la rilevanza per la malattia quantificando i difetti funzionali dei trasportatori CFTR e ENaC in topi che respirano spontaneamente.
- Valore operativo: Favorisce la continuità traslazionale consentendo più test per singolo animale, riducendo la variabilità inter-individuale.
- Valore scientifico: Guida decisioni di avanzamento con valutazione del rischio fornendo tracciati farmacodinamici quantitativi che si correlano con il genotipo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo NPD si inserisce nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio fino alla valutazione preclinica, fornendo dati funzionali sul trasporto ionico che contribuiscono alla valutazione dell'efficacia terapeutica.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi mediante la misurazione delle differenze di potenziale nasale basali e stimolate in topi transgenici.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio attraverso la perfusione standardizzata di soluzioni tampone e letture di tensione stabili.
- Analisi: Produce misurazioni quantitative di variabili dipendenti (risposta all'amiloride, risposta in assenza di cloruro, risposta alla forskolina, risposta totale al cloruro) per il confronto tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica consentendo test ripetuti nello stesso animale per monitorare gli effetti longitudinali del trattamento.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come capacità riutilizzabile per la caratterizzazione di modelli di fibrosi cistica in diverse iterazioni terapeutiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi attraverso la fenotipizzazione quantitativa del trasporto ionico.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità mediante la preparazione del catetere, la calibrazione degli elettrodi e i controlli di perfusione.
- Valore strategico: Decisioni più accurate su prosegui/non prosegui grazie alla riduzione dell'ambiguità meccanicistica nell'efficacia dei modulatori di CFTR e ENaC.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione aggiustata per il rischio basata sulla correzione del difetto di trasporto funzionale nei modelli preclinici.
Considerazioni sull'implementazione
- Competenza nella gestione dell'anestesia nei roditori e nelle tecniche di cateterizzazione nasale.
- Strumentazione inclusa voltometro ad alta impedenza, pompa peristaltica e tappetini riscaldanti con controllo della temperatura.
- Standardizzazione intersettoriale della preparazione delle soluzioni, della verifica dell'offset degli elettrodi e dei tempi di perfusione.
- Considerazioni adattative per diverse ceppi di roditori e modelli di mutazione del gene CFTR.
- I limiti pratici includono la delicatezza chirurgica dell'accesso alla cavità nasale e l'ottimizzazione della profondità dell'anestesia per prevenire l'aspirazione bronchiale.
