Name: Differenza di potenziale nasale per quantificare il trasporto Trans-epiteliale ionico in topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Impara a misurare la differenza di potenziale nasale nei topi per valutare il trasporto ionico trans-epiteliale. Questo metodo consente di testare l'efficacia di nuove terapie per la fibrosi cistica in vivo.

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Gli autori ringraziano la Prof. ssa J. Lebacq per l'editing criticamente il manoscritto. CFTRtm1Eur (topi omozigoti F508del-CFTR (FVB/129) sono stati sviluppati dalla Erasmus MC, Rotterdam, Paesi Bassi, con il sostegno della Comunità economica europea azione di coordinamento europeo per la ricerca in fibrosi cistica EU FP6 LHHM-CT-2005-018932.

Gli studi e le procedure sono state approvate dal comitato etico per la ricerca sugli animali dell'UCL (2017/UCL/MD/015) e in accordo con le normative della Comunità europea per l'uso di animali nella ricerca (CEE n ° 86/609). Gli investigatori sono qualificati per la sperimentazione animale seguendo la direttiva 2010/63/UE del Parlamento europeo e del Consiglio, del 22 settembre 2010 sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici.
1. pre-test di valutazione e gestione
<ol><li>Preparare il catetere a doppio lume nasale. Nota: Un catetere nasale è fatto come un tubo capillare di doppio lume, un lume viene utilizzato per la perfusione continua di soluzioni, e l'altra come una misura di canale.<ol>
<li>Riscaldare la parte centrale di un pezzo, lunghe circa 20 cm di tubo in polietilene (diametro interno di 2,0 mm; diametro esterno mm 3,0; Figura 1 un) nella fiamma di un bruciatore a gas fino a quando è abbastanza morbido per la trazione (10-15 s).</li>
		<li>Tirare le due estremità per ottenere un tubo capillare molto sottile di lunghezza appropriata (~ 15 cm) e il diametro esterno (mm ~0.1) per la sonda nasale (Figura 1b).</li>
		<li>Pulire e sgrassare due tali capillari con etanolo puro, unirli con del nastro adesivo (Figura 1c) e incollarli con colla del cianoacrilato.</li>
		<li>Tagliare la lunghezza in eccesso delle sonde con una lametta o un bisturi per ottenere un'ottima lunghezza del catetere a doppio lume di circa 8 cm (Figura 1d).</li>
		<li>Iniettare l'acqua attraverso entrambi i lumi per verificare che essi siano permeabili.</li>
		<li>Applicare un marchio ad una distanza di 5 mm dalla punta. Nota: La sonda è inserita all'altezza del marchio nella narice, affinché tutte le misurazioni sono effettuate presso il sito stesso all'interno della cavità nasale.</li>
		<li>Conservare il catetere a doppio lume in una scatola asciutta. Nota: Può essere usato 6 - 10 volte se opportunamente puliti immediatamente dopo il test.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare la miscela di crema.<ol>
<li>Mescolare delicatamente la crema dell'elettrolito e 3M KCl soluzione satura in un rapporto di 1:1 (volume/volume), evitando la formazione di minuscole bollicine d'aria. Nota: Il mix panna viene utilizzato per costruire i ponti di elettrodo per la misurazione e il riferimento Ag/AgCl elettrodi, come illustrato nella Figura 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57934/57934fig1.jpg"> Figura 1 : Sonde con elettrodi e ponti. La figura illustra il tubo in polietilene prima (a) e dopo il riscaldamento e tirando (b), il nastro unendo le due parti capillare (c) del catetere a doppio lume (d), i connettori di tubo in silicone (e) e gli elettrodi (f). Per maggiore chiarezza di immagine, i connettori non sono stati riempiti con crema mix. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57934/57934fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Etichetta di soluzione</td>
			<td>Descrizione della soluzione</td>
		</tr>
<tr>
<td>A</td>
			<td>Soluzione salina tamponata basali</td>
		</tr>
<tr>
<td>B</td>
			<td>Cloruro di soluzione salina tamponata</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>Soluzione di riserva di amiloride 10-2 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>Soluzione di riserva di forskolin 10-3 M</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Soluzione per il test di PD nasale nei topi.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Sale</td>
			<td>mM</td>
			<td>Peso molecolare</td>
			<td>g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cloruro di sodio (NaCl)</td>
			<td>135</td>
			<td>58,44</td>
			<td>7.889</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cloruro di calcio diidrato (CaCl2.2h2O)</td>
			<td>2.25</td>
			<td>147</td>
			<td>0,331</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cloruro di magnesio esaidrato (MgCl2.6h2O)</td>
			<td>1.2</td>
			<td>203,3</td>
			<td>0,244</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fosfato dipotassico (K2HPO4)</td>
			<td>2.4</td>
			<td>174,2</td>
			<td>0.418</td>
		</tr>
<tr>
<td>Potassio fosfato monobasico (KH2PO4)</td>
			<td>0.4</td>
			<td>136.1</td>
			<td>0,054</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Composizione del basale soluzione salina (soluzione stock A) tamponata.
<ol start="3"><li>Preparare le soluzioni.<ol>
<li>Preparare le quattro soluzioni stock richieste per il protocollo sperimentale (tabella 1).<ol>
<li>Preparare la soluzione tamponata basale (soluzione A; Tabella 2) e la soluzione tampone esente da cloruri (soluzione B; Tabella 3) mescolando i sali in acqua pura a temperatura ambiente. Regolare il pH a 7,4 (gamma 7.0-7.6) utilizzando 1 N NaOH per innalzare il pH, 1 N HCl a pH inferiore. Controllare l'osmolarità della soluzione (275 mOsm/L).</li>
			<li>Conservare in bottiglie di vetro con etichetta a 4 ° C per fino a 3 mesi o congelati in bottiglie di plastica per fino a 6 mesi.</li>
			<li>Preparare la soluzione di amiloride 10-2 M (soluzione C) aggiungendo 26,6 mg di amiloride cloridrato a 10 mL di acqua pura. Riscaldare la miscela per 5-10 minuti a 70 ° C. Come amiloride è sensibile alla luce, mantenere la soluzione C in un contenitore scuro. Etichettare il contenitore e conservare a 4 ° C fino a 3 mesi.</li>
			<li>Preparare la soluzione di forskolin di 10-3 M (soluzione D) con l'aggiunta di 10 mg di forskolin 24,36 ml di acqua pura. Etichettare le aliquote di 0,1 mL della soluzione madre forskolin e conservare a-20 ° C fino a 6 mesi.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare soluzioni fresche A1, B1 e B2 (tabella 4).<ol>
<li>Preparare soluzione fresca A1 (soluzione salina tamponata basale plus 10-4 M amiloride) ottenendo 10 mL di soluzione salina basale (soluzione stock A) e aggiungere 0,1 mL di soluzione di 10-2 M amiloride (soluzione C). Etichettare il contenitore e utilizzare entro 24 ore di preparazione.</li>
		<li>Preparare soluzione fresca B1 (cloruro tamponato soluzione plus 10-4 M amiloride) ottenendo 10 mL di soluzione salina tamponata esente da cloruri (soluzione B) e aggiungendo 0,1 mL di soluzione di 10-2 M amiloride (soluzione C). Etichettare il contenitore e utilizzare entro 24 ore dalla preparazione.</li>
		<li>Preparare soluzione fresca B2 (soluzione salina tamponata esente da cloruri plus 10-4 M amiloride e 10-5 M forskolin) ottenendo 10 mL di soluzione salina tamponata esente da cloruri (soluzione B) e aggiungere 0,1 mL di 10-2 M Amiloride soluzione (soluzione C) e 0,1 mL di soluzione di 10-3 M forskolin (soluzione D). Etichettare il contenitore e utilizzare entro 2 ore dalla preparazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Sale</td>
			<td>mM</td>
			<td>Peso molecolare</td>
			<td>g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gluconato di sodio (sale monosodico)</td>
			<td>135</td>
			<td>218,1</td>
			<td>29.444</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gluconato di calcio (polvere anidra)</td>
			<td>2.2</td>
			<td>430.4</td>
			<td>0.947</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solfato di magnesio eptaidrato (MgCl2.6h2O)</td>
			<td>1.2</td>
			<td>246.5</td>
			<td>0.296</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fosfato dipotassico (K2HPO4)</td>
			<td>2.4</td>
			<td>174,2</td>
			<td>0.418</td>
		</tr>
<tr>
<td>Potassio fosfato monobasico (KH2PO4)</td>
			<td>0.4</td>
			<td>136.1</td>
			<td>0,054</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 3: Composizione di esente da cloruri tamponata (soluzione B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57934/57934fig2.jpg"> Figura 2 : Posizione del mouse durante la perfusione della mucosa nasale. La figura illustra il dissipatore di calore (a), il voltmetro (b), l'elettrodo di riferimento inserito nello spazio sottocutaneo in un arto posteriore (c), prossimale (d) e il distale (e) Outlet della pompa peristaltica, il cuscino (f), e il lenzuolo (g). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57934/57934fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
2. la valutazione e la gestione durante il Test
<ol><li>Preparare la messa a punto sperimentale.<ol>
<li>Per prevenire l'ipotermia durante e dopo il test, utilizzare due cuscinetti di riscaldamento mantenuti a temperature fisiologiche, uno per il setup di misura (18,8 x 37.5 cm; Figura 2 una) e l'altra (15,5 x 15,5 cm) per la casella in cui l'animale sarà posto per recupero alla fine del test.</li>
		<li>Accendere il computer caricato con il software per l'acquisizione di dati collegati per l'impedenza di ingresso elevata di memoria dati (&gt; 1012Ω) e ad alta risoluzione (0.1 mV) voltmetro (Figura 2b).</li>
		<li>Collegare gli elettrodi al voltmetro. Collegare l'elettrodo di misura positiva il catetere nasale e l'elettrodo di riferimento negativo al catetere inserito nello spazio sottocutaneo in un arto, come mostrato in Figura 2c.</li>
		<li>Immergere le punte degli elettrodi insieme nel mix panna. Controllare il valore di offset iniziale dell'elettrodo. Rifiutare gli elettrodi se il valore è maggiore di (±) 2 mV (idealmente 0 mV).</li>
		<li>Accendere la pompa peristaltica e inserire il tubo della pompa in posizione, come illustrato nella Figura 2.</li>
		<li>Collegare l'uscita prossimale del tubo pompa al flaconcino contenente la soluzione selezionata per aspersione nasale (Figura 2d). Collegare l'uscita distale del tubo pompa con il lumen perfusione del catetere nasale (Figura 2e).</li>
		<li>Riempire un lume del catetere nasale con elettrolita crema mix attraverso un puntale di 10 µ l. Adattare il catetere per un raccordo di tubo in silicone (Figura 1e), riempire il connettore con miscela di crema e inserire l'elettrodo positivo sul connettore (Figura 1f). Controllare il valore di offset del ponte elettrodo misura. Rifiutare i ponti, se il valore è maggiore di (±) 2 mV (idealmente 0 mV).</li>
		<li>Riempire il secondo lume del catetere nasale con la soluzione fresca A1. Immergere la punta del catetere nasale nel flaconcino contenente la soluzione r. Reverse la direzione della pompa peristaltica per riempire una lunghezza del catetere nasale corrispondente a 10 s di aspersione. Nota: Questo permette di registrare i valori basali di PD per 10 s prima di applicare amiloride. Immergere la punta del catetere nasale nel mix crema all'interno del connettore dell'elettrodo di riferimento (Figura 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Iniziare la manipolazione del mouse.<ol>
<li>Registrare il peso del mouse per calcolare la dose esatta degli anestetici deve essere iniettato dall'intraperitoneale (ip) percorso17.</li>
		<li>Utilizzando un ago da 26G (0.45 x 10 mm), iniettare premedicazione intraperitonealmente per promuovere l'induzione dell'anestesia: una dose fissa di 50 µ l di midazolam 5 mg/mL. Attendere 5 min.</li>
		<li>Preparare la miscela di anestetica (fentanil, medetomidina, droperidol alle concentrazioni finali di 0,05, 0.40 e 20 mg/kg di peso corporeo, rispettivamente e la clonidina alla dose fissa di 0,375 µ g) permettendo ottima e stabile la profondità dell'anestesia (fase III, piano 2)17 . Iniettare il volume di miscela di anestetico per via intraperitoneale e poi iniettare il volume di clonidina. Nota: Dopo 15 min, il mouse dovrebbe essere addormentato e l'anestesia può durare per almeno 30 min.</li>
		<li>Piegare un foglio di tessuto per fare un 3 cm ampia 'cuscino' (Figura 2f) che coprirà la parte superiore del rilievo di riscaldamento (Figura 2a) come supporto per il mouse testa di assorbire.</li>
		<li>Coprire il dissipatore di calore con un foglio di assorbimento del tessuto ('lenzuolo'; Figura 2 g). Posare il mouse sul dorso il termoforo. Nastro, gli arti e la coda (Figura 2).</li>
		<li>Inserire il catetere endovenoso di riferimento (Figura 1g) nello spazio sottocutaneo di un arto. Rimuovere l'ago e adattare il connettore del tubo in silicone (Figura 1e, 2C).</li>
		<li>Riempire il catetere e il connettore con panna Mescolare e inserire l'elettrodo negativo sul connettore (Figura 1f).</li>
		<li>Fissare il catetere e l'elettrodo con nastro adesivo, come richiesto per impedire qualsiasi spostamento. Dopo il posizionamento dell'elettrodo di riferimento e ponti, verificare nuovamente il valore di offset del ponte elettrodo misura immergendo la punta del catetere nasale nel mix elettrodo crema all'interno del connettore del catetere IV. Registrare il valore di offset finale stabile (idealmente meno (±) 2 mV).</li>
		<li>Difficoltà il mouse orecchie con nastro di "dolce" il dissipatore di calore in uno spazio libero tra i due pezzi di assorbimento del tessuto ('cuscino' (Figura 2f) e 'lenzuolo'; (Figura 2g)). Difficoltà le vibrisse (i peli rigidi cresce vicino alle narici) senza toccare gli occhi.</li>
		<li>Per assorbire il liquido dalla cavità orale, spostare la linguetta lateralmente (Figura 3un) e inserire uno stoppino aguzzo di carta da filtro (il ' tubo'; Figura 3 b) circa 1 cm in bocca. Per assorbire fluido esaurire la narice irrorata, posizionare un secondo pezzo di carta da filtro (il ' fazzoletto'; Figura 3 c) tenuto presso la punta del naso.</li>
		<li>Verifichi il valore di controllo positivo del potenziale epiteliale inserendo la punta del catetere nasale a contatto con l'interno della bocca. Nota: La lettura deve essere stabile e intervallo tra -10 mV e -20 mV.</li>
		<li>Tenendolo con una pinzetta e sotto buona illuminazione diretta, delicatamente introdurre il catetere nasale in una narice fino a 4 - 6 mm dal naso il suggerimento. Nota: Il catetere nasale del PD si trova alla concha nasale centrale nella posizione che dà la massima linea di base stabile PD valore17,20.</li>
		<li>5 min dopo l'iniezione delle droghe anestetiche, inclinare delicatamente il dissipatore di calore di circa 30° con la testa dell'animale verso il basso. Monitorare il valore massimo di PD basale.</li>
		<li>Quando è stabile per un periodo di circa 30 s, inizio che irrora la mucosa nasale, a una velocità costante di 10 µ l / min, con le soluzioni tampone 4 (A, A1, B1, B2) in successione. Irrorare la prima soluzione (passo 1.3.1.1) per 10 s e ogni soluzione seguente (passo 1.4) per 5 minuti o fino a quando ha raggiunto un valore stabile. Fermare che irrora il forskolin (B2) quando la risposta transitoria forskolin comincia a calare.</li>
		<li>Selezionare un intervallo di 1 s per la registrazione dei dati. Avviare la registrazione dei dati al momento della partenza di aspersione. Visualizzare i dati in funzione di tempo sullo schermo del computer.</li>
		<li>Acquisizione dati stop alla fine della perfusione con soluzione B2. Salvare i dati come un file di foglio di calcolo.</li>
		<li>Dati corretti sottraendo il valore di offset finale.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57934/57934fig3.jpg"> Figura 3 : Posizione del mouse sul dissipatore di calore con il catetere nasale e la carta da filtro in luogo. La figura illustra la lingua mettere lateralmente, (a), il tubo (b) e il fazzoletto (c). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57934/57934fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
3. valutazione e gestione post-prova
<ol><li>Rilasciare il mouse dal termocuscino.</li>
	<li>Pulisciti il naso del mouse con il 'lenzuolo' (Figura 2g).</li>
	<li>Intraperitonealmente iniettare la miscela anestetica antagonista composta da una dose fissa (4 µ g) di naloxone, un antagonista competitivo morfina e atipamezolo, un antidoto specifico di medetomidina (2 mg/kg di peso corporeo).</li>
	<li>Posare il mouse sul pad riscaldamento più piccoli nella finestra di recupero fino al recupero completo, che solitamente si osserva dopo 1 o 2 h. Nota: Nel laboratorio di UCL, circa il 10% mortalità, principalmente legate alla bronchoaspiration di soluzioni irrorato in cavità nasale durante il test, è osservato indipendentemente il sesso o il genotipo.</li>
</ol>

<ol><li>Knowles, M., Gatzy, J., Boucher, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+bioelectric+potential+difference+across+respiratory+epithelia+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Increased bioelectric potential difference across respiratory epithelia in cystic fibrosis.</a> New England Journal of Medicine. 305 (25), 1489-1495 (1981).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Lo scopo di questa carta è di descrivere un protocollo adeguato per misurare nasale PD sotto perfusione continua di soluzioni nei topi di respirare spontaneamente per un periodo di tempo necessario per verificare l'integrità dei trasportatori di ioni, principalmente CFTR ed ENaC. Tutti i passaggi del protocollo sono stati attentamente ottimizzati per garantire il recupero pieno animale e buona qualità e dati riproducibili. In particolari, critici i passaggi sono valutazione di anestesia e gestione adeguata posizione anim...

Per quasi tre decenni, electrical potenziali misure di differenza (PD) sono state utilizzate per valutare lo stato funzionale dei trasportatori ionici transmembrana espressa a mucosa nasale, come rappresentante del vie aeree distali1. Come una dinamica multistep prova2,3, nasale PD consente una dissezione funzionale del regolatore di conduttanza del Transmembrane fibrosi cistica (CFTR) ed epiteliale del sodio (ENaC) canale attività, entrambi localizzati alle membrane apicali di le cellule epiteliali ed esercitare ruoli critici in idratazione superficiale della via aerea. Le principale applicazione clinica del test PD nasale è di assistere nella diagnosi della fibrosi cistica, la malattia genetica mortale più comune nelle popolazioni caucasiche con un'incidenza media di 1 su 2.500 nascite nei paesi europei. Il test ha da tempo dimostrato utile nella diagnosi di forme attenuate, oligo - o mono-sintomatico della fibrosi cistica diagnosticata solitamente più tardi nella vita e dei disordini da CF come assenza congenita bilaterale dei vasi deferenti, pancreatite cronica idiopatica, allergica aspergillosi broncopolmonare e bronchiectasie4. Più recentemente, valutazione clinometrica della modulazione terapeutica di base canale CFTR difetto5,6,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16 ha fatto uso del PD nasale in studi clinici di nuove terapie CF. In ambito preclinico, il test è stato adattato per il mouse17 per consentire indagini la bioattività del nuovo CF terapie target18,19,20,21. Nei topi, la tecnica è delicata, basato sulle differenze anatomiche relative specie nella dimensione della regione nasale tra roditori ed esseri umani e principalmente sul ruolo essenziale di input sensoriali dalla regione Solci in roditori. Richiede operatori qualificati e specializzati, apparecchiature dedicate e forniture.
CF è una malattia multi-sistemica delle ghiandole esocrine, in quale malattia respiratoria cronica domina il quadro clinico. La malattia è causata da mutazioni nel gene che codifica il monofosfato di adenosina ciclico (cAMP)-regolato cloruro CFTR canale22. Ad oggi, più di 2.000 mutazioni CFTR sono state identificate23. La più comune mutazione24,25, trovato in quasi il 90% degli alleli CF, corrisponde a un'eliminazione di fenilalanina in posizione 508 della catena polipeptidica della proteina (F508del-CFTR). La proteina CFTR è un canale del cloro di conduttanza piccolo puramente ohmico. C'è anche una notevole prova che CFTR regola altri meccanismi di trasporto, in particolare, ENaC26,27. Trasporto difettoso dell'elettrolito, compreso ridotta conduttanza di cloruro CFTR-dipendente e aumentata conduttanza di sodio ENaC-dipendente, è un segno distintivo del epithelia del CF. Il difetto ex viene riflessa da una ripolarizzazione ridotta o abolita in risposta a un efflusso cloruro gradiente elettrochimico che favorisce e l'aggiunta di isoprenalina (un agonista β-adrenergici che aumenta cAMP intracellulare) o forskolin (un adenilato agonista di ciclasi, non approvato per uso clinico). Il difetto di quest'ultimo si riflette un hyperpolarization basale della mucosa nasale (un PD più negativa) e una risposta aumentata di amiloride, un farmaco diuretico che blocca ENaC28.
Modelli murini CF sono stati usati frequentemente nella ricerca CF e sono stati preziosi in patologia CF di dissezione. Al giorno d'oggi, almeno quindici modelli sono stati descritti29, di cui tre sono omozigoti per il31,30,di mutazione F508del più clinicamente rilevante32. Uno di questi tre ceppi30, sviluppato all'Università Erasmus di Rotterdam, è stato utilizzato per quasi 20 anni in laboratorio Université catholique de Louvain (UCL). Il Cftrtm1Eur modello30 ha dimostrato di essere molto utile per studiare la patofisiologia multiorgan della malattia CF e per testare l'efficacia di nuove strategie terapeutiche18,19,20, 21. Numerosi problemi possono verificarsi durante o presto dopo (< 24h) il test di PD nasale nei topi. In questa carta, la profondità adeguata dell'anestesia richiesta per mantenere un catetere nasale in situ per aspersione continua e misure per evitare la Bronco-aspirazione di soluzioni irrorati nel naso sono descritti. La cura degli animali alla fine del test è descritta, compreso la gestione di una combinazione di antidoti di farmaci anestetici, che conduce rapidamente invertendo l'anestesia con il recupero completo degli animali. Complessivamente, queste procedure consentono misure affidabili in topi di respirare spontaneamente, ridotta mortalità relative ai test e ripetendo il test nello stesso animale. Dati rappresentativi ottenuti dal test PD nasale in un CF e in un selvaggio-tipo mouse sono mostrati e discussi.
Il protocollo di test PD nasale murino è segnalato in tre sessioni: valutazione e gestione prima, durante e dopo la prova. Nel pre-test di valutazione e gestione, il protocollo di preparazione del catetere a doppio lume nasale e delle soluzioni utilizzate per aspersione nasale continua è descritto dettagliatamente. Durante la valutazione e gestione porzioni del test, la messa a punto sperimentale e la gestione del mouse viene sezionato minuziosamente. Infine, gestione dell'animale alla fine del test è descritto per migliorare il recupero pieno animale.

<table><tbody><tr><td>Tubo in polietilene Portex&nbsp;</td><td>Smiths Medical, Hythe, Kent, Inghilterra CT21 6JL</td><td>Portex 800/100/500; 2,0 mm ID, 3,0 mmOD</td><td>per preparare tubi capillari per sonda nasale</td></tr><tr><td>Crema per elettrodi</td><td>Parker, Fairfield, NJ, USA</td><td>Crema Redux</td><td>per costruire ponti elettrodici</td></tr><tr><td>Elettrodi Ag/AgCl</td><td>Biomedical, Clinton Township, MI, USA</td><td>JNS BNT131-1,0</td><td>elettrodi di misura e di riferimento</td></tr><tr><td>amiloride cloridrato</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>A7410</td><td>per preparare soluzioni</td></tr> <tr>di perfusione<td>forskolin</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>F6886</td><td>per preparare soluzioni di perfusione</td></tr><tr><td>Knick Portamess voltmetro</td><td>Elektronisch Me&beta; ger&auml; te, Berlino, Germania</td><td>Portavo 904 pH</td><td>per misurare la differenza di potenziale</td></tr><tr><td>Software Paraly SW 112&nbsp;</td><td>Elektronisch Me&beta; ger&auml; te, Berlino, Germania</td><td>Software Paraly SW112</td><td>per acquisire dati sulla differenza di potenziale</td></tr><tr><td>midazolam&nbsp;</td><td>Mylan, Hoeilaart, Belgio</td><td>Dormicum 15mg/3ml</td><td>per servire come anestetico premedicazione</td></tr><tr><td>fentanyl</td><td>Janssen Cilag, Berchem, Belgio</td><td>Fentanyl-Janssen 0,05 mg/ml</td><td>per servire come farmaco anestetico</td></tr><tr><td>medetomidina</td><td>Orion Pharma, Espoo, Finlandia</td><td>Domitor 1 mg/ml</td><td>per servire come farmaco anestetico</td></tr><tr><td>droperidolo&nbsp;</td><td>Janssen&nbsp; Cilag, Berchem, Belgio</td><td>Deidrobenzperidolo 2,5 mg / ml</td><td>per servire come farmaco anestetico</td></tr><tr><td>clonidina&nbsp;</td><td>Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germania</td><td>Catapressan 0,15 mg/ml,</td> <td>per fungere da farmaco anestetico</td></tr><tr><td>di riferimento Catetere IV</td><td>Becton Dickinson, Sandy, UT, USA</td><td>24 GA x 0,75 IN, BD Insyte-W</td><td>per costruire ponti di elettrodi</td></tr><tr><td>pinze&nbsp;</td><td>Fine science Tools, Heidelberg, Germania</td><td>Dumont #5, Fine science Tools</td><td>per posizionare il catetere nasale</td></tr><tr><td>naloxone&nbsp;</td><td>Braun Medical, Bruxelles, Belgio</td><td>Narcan, 0,4 mg/ml</td><td>per fungere da antagonista anestetico</td></tr><tr><td>atipamezolo</td><td>Zoetis, Bloomberg, Belgio</td><td>Antisedan, 5 mg/ml</td><td>per fungere da antidoto specifico per medetomedina</td></tr><tr><td>Termofori&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td><td>18,8x37,5 cm; 15,5x15,5 cm</td><td>per evitare l'ipotermia durante e dopo il test</td></tr><tr><td>Pompa peristaltica P1</td><td>GE Life Sciences, Uppsala, Svezia</td><td>18111091</td><td>per perfondere soluzioni nel naso di topo</td></tr><tr><td>colla cianoacrilica</td><td>Loctite, Henkel, D&uuml; sseldorf, Germania&nbsp;</td><td>super colla 3</td><td>per incollare insieme due tubi capillari&nbsp; per sonda nasale</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>RES0926S-A7</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>CaCl2.2H2O</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>M7304</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>1551128</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>1551139</td><td>Grado farmaceutico, USP</td></tr><tr><td>Na gluconato</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>S2054</td><td>Grado farmaceutico, USP</td></tr><tr><td>Ca gluconato</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>C8231</td><td>Grado farmaceutico, USP</td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>RES0089M-A7</td><td>Grado farmaceutico, USP</td></tr><tr><td>BD ago</td><td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA</td><td>BD 26G (0,45x10 mm)</td><td>iniezione intraperitoneale</td></tr></tbody></table>

differenza di potenziale nasale per quantificare il trasporto trans-epiteliale ionico in topi

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

Il test di differenza potenziale nasale è stato utilizzato per quasi tre decenni per aiutare nella diagnosi di fibrosi cistica (CF). Ha dimostrato di essere utile nei casi di attenuato, forme oligo - o mono-sintomatici di CF solitamente diagnosticata tardi nella vita e dei disordini da CF come assenza congenita bilaterale dei vasi deferenti, pancreatite cronica idiopatica, allergica aspergillosi broncopolmonare e bronchiectasie. Nelle impostazioni sia cliniche e precliniche, il test è stato utilizzato come biomarcatore per quantificare le risposte di strategie terapeutiche mirate per adattamento cfr la prova di un mouse è impegnativo e può comportare una mortalità associata. Questo articolo descrive la profondità adeguata dell'anestesia necessaria per mantenere un catetere nasale in situ per la perfusione continua. Esso elenca le misure per evitare la Bronco-aspirazione di soluzioni irrorati nel naso. Descrive anche la cura degli animali alla fine del test, inclusa l'amministrazione di una combinazione di antidoti dei farmaci anestetici, che conduce rapidamente invertendo l'anestesia con il recupero completo degli animali. Dati rappresentativi ottenuti da un CF e uno spettacolo di selvaggio-tipo mouse che il test discrimina tra CF e non CF. Complessivamente, il protocollo qui descritto consente misurazioni affidabili della condizione funzionale di trasportatori trans-epiteliale di cloruro e sodio nei topi di respirare spontaneamente, nonché prove multiple nello stesso animale, riducendo relative ai test mortalità.

Al fine di illustrare le anomalie del trasporto di ioni caratteristici in CF, nasale PD sono state effettuate seguendo il protocollo descritto in precedenza in un mouse F508del-CF e in un controllo di tipo selvatico del background genetico FVB/129 dalla colonia di Bruxelles CFTRtm1Eur topi30. Questo modello clinicamente rilevante, che harboring il più comune e uno dei più gravi F508del-CFTR mutazione23,<sup class="xref"...

Qui, presentiamo un protocollo per misurare la differenza di potenziale nasale nei topi. Il test quantifica la funzione dei trasportatori transmembrana di ioni come il regolatore di conduttanza del transmembrane di fibrosi cistica e il canale epiteliale del sodio. È utile per valutare l'efficacia di nuove terapie per la fibrosi cistica.

Differenza di potenziale nasale per quantificare il trasporto Trans-epiteliale ionico in topi

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

La differenza di potenziale nasale è un metodo prezioso per caratterizzare il fenotipo dei topi transgenici che modellano la fibrosi cistica. Permette di studiare l'efficacia di nuovi tipi di terapie per la fibrosi cistica. I principali vantaggi della tecnica sono che fornisce misurazioni affidabili nei topi che si riproducono continuamente.Riduce la mortalità correlata e consente di ripetere il test nello stesso animale. Per preparare il catetere nasale a doppio lume, tenere il centro di un tubo di polietilene lungo 20 centimetri nella fiamma per circa 10-15 secondi fino a quando non è abbastanza morbido per essere tirato. Quindi, separare le due estremità per ottenere un tubo capillare molto sottile di circa 15 centimetri di lunghezza e un diametro esterno di 0,1 millimetri per la sonda nasale.Successivamente, pulire e sgrassare i due capillari con etanolo puro. Uniscili con del nastro adesivo e incollali insieme usando la colla cianoacrilica. Tagliare via la lunghezza in eccesso delle sonde con una lametta per ottenere il catetere a doppio lume di circa otto centimetri di lunghezza.Quindi, iniettare acqua attraverso entrambi i lumi per verificare che siano permeabili e fare un s

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L'(EOG) è una registrazione electroolfactogram informativo, facile da condurre, e affidabile di valutazione della funzione olfattiva a livello dell'epitelio olfattivo. Questo protocollo descrive una configurazione di registrazione, di preparazione dei tessuti del mouse, raccolta dati e analisi dei dati di base.

Analizzando le risposte di topo neuroni olfattivi sensoriali che utilizzano l&#39;aria in fase di registrazione Electroolfactogram

Questo video mostra la registrazione elettrofisiologica dei neuroni sensoriali olfattivi (OSN) nei topi utilizzando una tecnica di patch-clamp perforata. L'epitelio olfattivo, contenente OSN con recettori degli odori marcati con fluorofori, viene isolato da un topo e fissato in una camera di registrazione. Una pipetta di registrazione è fissata alla manopola dendritica di un OSN e la nistatina all'interno della pipetta perfora la membrana per formare la connettività elettrica con la cellula.

Registrazione perforata con patch-clamp dei neuroni sensoriali olfattivi nei topi

Un efficace manuale disosso metodo per preparare intatto il mouse tessuto nasale con organizzazione anatomica Conservato

L'analisi delle proprietà fisiologiche dei neuroni sensoriali olfattivi incontra ancora limitazioni tecniche. Qui li registriamo attraverso un patch-clamp perforato in una preparazione intatta dell'epitelio olfattivo in topi geneticamente mirati. Questa tecnica consente la caratterizzazione delle proprietà di membrana e delle risposte a specifici ligandi di neuroni che esprimono recettori olfattivi definiti.

Perforato Patch-clamp registrazione di topo neuroni sensoriali olfattivi In neuroepithelium intatto: Analisi funzionale di neuroni Esprimendo un Identificato odorizzante Receptor

Qui, descriviamo un approccio fisiologico che consente l'identificazione e l'analisi approfondita di una popolazione definita di neuroni sensoriali in fette di tessuto coronale acuto dell'organo vomeronasale del topo utilizzando registrazioni di patch-clamp a cellula intera.

Approfondita fisiologica Analisi di popolazioni di cellule definite nel acuta del tessuto Fette del mouse Vomeronasal Organo

Questo protocollo descrive la iontoforesi in tempo reale, un metodo che misura i parametri fisici dello spazio extracellulare (ECS) dei cervelli viventi. La diffusione di una molecola inerte rilasciata nell'ECS viene usata per calcolare la frazione del volume ECS e la tortuosità. È ideale per studiare cambiamenti reversibili acuti al cervello ECS.

Iontoforesi in tempo reale con tetrametilammonio per quantificare la frazione del volume e la tortuosità dello spazio extracellulare del cervello

Questo manoscritto descrive le applicazioni di elettrodi selettivi protone e patch metodi di bloccaggio per misurare l'attività dei sistemi di trasporto di protoni. Questi metodi di superare alcuni limiti delle tecniche comunemente usate per studiare l'attività di trasporto di protoni, come moderata sensibilità, risoluzione temporale e controllo insufficiente milieu intracellulare.

Applicazione di misura di elettrofisiologia di studiare l'attività dei trasportatori di Electro-neutro

Qui, presentiamo un protocollo standardizzato per misurare la differenza di potenziale nasale (NPD). Regolatore di conduttanza del transmembrane di fibrosi cistica (CFTR) ed epiteliale del sodio (ENaC) canale funzione vengono valutati dal cambiamento nella tensione attraverso l'epitelio nasale dopo superfusione di soluzioni che modificano l'attività del canale ionico, fornendo un misura di risultato.

Misurazione standardizzato di differenza di potenziale Transepithelial membrana nasale (NPD)

L'epitelio intestinale conferisce non solo assorbimento dei nutrienti, ma protezione contro le sostanze nocive. La giunzione intercellulare apicale più epiteliale, cioè la giunzione stretta, regola la permeabilità paracellulare del soluto e degli ioni. Qui viene descritto un protocollo per la preparazione di fogli mucosi e la valutazione della selettività ionica di giunzioni strette utilizzando la tecnica della camera di Ussing.

Valutazione funzionale della barriera a giunzione stretta intestinale e della permeabilità agli ioni nel tessuto nativo mediante la tecnica della camera di Ussing

Qui descriviamo l'isolamento, l'amplificazione e la differenziazione delle cellule epiteliali nasali umane primarie (HNE) all'interfaccia aria-liquido e un protocollo di biobanking che consente di congelare e quindi scongelare con successo l'HNE amplificato. Il protocollo analizza le proprietà elettrofisiologiche delle cellule HNE differenziate e la correzione della secrezione di cloruro correlata al CFTR su diversi trattamenti modulatori.

Cellule epiteliali nasali umane primarie: biobanking nel contesto della medicina di precisione

Questo protocollo descrive un metodo per lo studio delle proteine di membrana elettrogeniche misurando le variazioni del potenziale di membrana. Questo test fornisce una piattaforma per la lettura funzionale di più canali ionici espressi endogenamente in linee cellulari epiteliali.

Un saggio basato sulla fluorescenza del potenziale di membrana per lo studio funzionale ad alta produttività di due canali ionici endogeni in due linee cellulari epiteliali

Impara a misurare la differenza di potenziale nasale nei topi per valutare il trasporto ionico trans-epiteliale. Questo metodo consente di testare l'efficacia di nuove terapie per la fibrosi cistica in vivo.

Differenza di potenziale nasale per quantificare il trasporto Trans-epiteliale ionico in topi

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