Name: Nanosensori per rilevare attività della proteasi In Vivo per la diagnostica non invasiva (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Scopri come sviluppare nanosensori per rilevare l'attività delle proteasi in vivo attraverso campioni urinari. Questo metodo non invasivo amplifica i segnali biologici per una diagnostica precoce delle malattie.

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Questo lavoro è stato finanziato da un direttore di NIH nuovo Innovator Award (premio No. DP2HD091793). Q.D.M. è supportato dal programma di borse di ricerca laureato NSF (Grant No. DGE-1650044). B.A.H è supportato dalla nazionale istituti di salute GT BioMAT formazione sovvenzione premio numero 5T32EB006343 così come il Presidente di Georgia Tech Fellowship. G.A.K. tiene un premio alla carriera all'interfaccia scientifica del fondo benvenuto di Burroughs. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

È necessario effettuare i seguenti esperimenti animali istituzionale approvazione istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) alla istituzione del ricercatore. Inoltre, strutture di standard di cura degli animali (ad es., alloggiamento chambers, cappe animale sterile, surrenalectomia alloggiamenti per amputate e CO2 alloggiamenti per euthanization etico endpoint) sono necessarie per svolgere correttamente queste esperimenti. Speciale formazione e assistenza con queste strutture può essere forniti da laboratorio di ricerca fisiologica (PRL) alla istituzione di uno. Tutto il lavoro animale è stato approvato dal IACUC al Georgia Tech (protocollo: A14100).
1. sintesi di nanoparticelle (IONP) di ossido di ferro
Nota: Sicurezza: l'intera sintesi di nanoparticelle di ossido di ferro devono essere effettuate utilizzando dispositivi di protezione individuale e sotto un prodotto chimico cappa aspirante.
<ol><li>In una provetta conica da 15 mL, chill 1 mL di idrossido di ammonio di 30% in un secchio di ghiaccio per 30 min.</li>
	<li>Lavare un matraccio di Erlenmeyer con acqua deionizzata da 250 mL e aggiungere 10 mL di acqua distillata doppia (ddH2O). Immergere l'esterno del pallone in un bagno di ghiaccio che riposa su una piastra stir/calore. Utilizzare una pipetta di plastica per gas2 flusso N nei ddH2O nel pallone. Bolla con N2 a deoxygenate per 15 minuti.</li>
	<li>Pesare µmol 224 (4,5 grammi) di destrano (peso molecolare (MW) = 20 kDa) in una provetta conica da 50 mL. Tale che il volume finale della miscela, compreso il destrano, è di 20 mL, aggiungere H2O. Vortice vigorosamente per sciogliere il destrano.</li>
	<li>Pesare 290 µmol (78,5 grammi) di ferro (III) cloruro esaidrato, aggiungere alla soluzione del dextrano e vortex per sciogliere.</li>
	<li>Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 µm.</li>
	<li>Trasferire 1 mL refrigerati di idrossido di ammonio in 9 mL di acqua deossigenata. Tornare a 4 ° C.</li>
	<li>Pesare µmol 367 (73,0 grammi) di ferro (II) cloruro tetraidrato, sciogliere in 1 mL di ossigeno-libero ddH2O e filtrare attraverso un filtro da 0,2 µm.</li>
	<li>Trasferire la soluzione di dextran-iron(III) nella beuta da 250 mL e deoxygenate con N2 per 15 minuti sul ghiaccio. Mescolare con un ancoretta magnetica di filatura a 1600 giri/min.</li>
	<li>Per creare un'atmosfera di azoto omogenea, tappo la beuta con un setto di gomma. Puntura del setto con un 18 ago a flusso N2 del manometro nel pallone. Inserire un ago 18 calibro separato come una presa di flusso.</li>
	<li>Aggiungere alla soluzione di dextran-iron(III) 467 µ l della soluzione di ferro (II) con una siringa da 1 mL, mescolando con un ancoretta magnetica a 1600 giri/min. Questo rapporto di ferro (II) di ferro (III) provoca una reazione equilibrata che produrrà magnetite o Fe3O4.</li>
	<li>Aggiungere che il refrigerate diluire idrossido di ammonio goccia a goccia nella soluzione del dextrano del ferro (II) - ferro (III) - per avviare il processo di nucleazione21. Assicurarsi che ogni goccia mescola bene prima di cadere in un altro. Finire la reazione dopo l'aggiunta di 1-2 mL di idrossido di ammonio.</li>
	<li>Arrestare il flusso di N2 e rimuovere il setto di gomma. Il bagno di ghiaccio di rimuovere e sostituire con una vasca di acqua calda, pur continuando a mescolare la soluzione. Assicurarsi che la temperatura della soluzione raggiunge i 75 ° C ed incubare per 75 minuti.</li>
	<li>Togliere il matraccio dalla piastra calda mescolare e doppiamente filtrare la soluzione attraverso 0,2 µm quindi 0,1 µm filtri per rimuovere le particelle grossolane.</li>
	<li>Cambio di buffer le particelle in ddH2O, utilizzando il peso molecolare di 100 kDa tagliate con concentratori (m.w.c.o.) per rimuovere l'eccesso destrano dalla soluzione, che dovrebbe essere molto viscosa. Sostituire i filtri, se il flusso attraverso rimane oscuro anche dopo 2-3 giri, che indica che il filtro potrebbe essersi rotto.<ol>
<li>Nel buffer di scambio con filtri spin, centrifugare a 4 ° C a 4800 X g per 15 minuti, scartare il flusso continuo e aggiungere nuovo buffer alla soluzione IONP. Ripetere 3 - 5 volte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinare la concentrazione delle nanoparticelle utilizzando un lettore di spettrofotometro/piastra. Prendere misure di assorbanza a 400 nm e uso l'assorbività molare di IONP a questa lunghezza d'onda (ε = 2.07 x 106 cm-1 M-1) per determinare la concentrazione di particelle IO.</li>
	<li>Risospendere il IONPs a 10 mg/mL in ddH2O (volume totale è solitamente ~ 3 mL) e assicurarsi di utilizzare tubi in polipropilene per questo passaggio per compatibilità chimica. Aggiungere 1,6 volumi di 5 M NaOH, quindi aggiungere 0,65 volumi di Epicloridrina. Rigorosamente mescolare su un agitatore per piastre a temperatura ambiente per 12 ore per crosslink destrano.</li>
	<li>Utilizzare una siringa da 20 mL con un ago calibro 18 per trasferire la soluzione IONP nella membrana di dialisi di m.w.c.o. di 50 kDa. Posizionare la membrana di dialisi in 4L ddH2O e sostituire H2O un paio di volte (ogni 2-3 ore). Incubare per una notte.</li>
	<li>Misurare la concentrazione e portare IONPs a 5 mg/mL (Vedi punto 1.15). Aggiungere idrossido di ammonio per raggiungere il 20% (v/v) ed agitare a temperatura ambiente per &gt; 12 ore per laminato con la superficie del IONPs. Cambio di buffer utilizzando 30 kDa m.w.c.o. filtri (Vedi 1.14).</li>
	<li>Regolare il volume fino a 2,5-3,5 mL prima purificazione finale di Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC; Vedi Tabella materiali per colonna di gel filtrazione).</li>
	<li>Utilizzare diffusione dinamica della luce (DLS) per determinare il raggio idrodinamico di IONPs (intervallo previsto 10-100 nm, dimensione media 40-50 nm). A tale scopo aliquotare 1 mL del campione diluito IONP in una cuvetta: 100x, posizionare in macchina e utilizzare il software del produttore per prendere la misura. Nota: La popolazione totale di IONPs sarà tra 10 e 100 nm mediante misure di liste di distribuzione, ma la maggior parte della popolazione è intorno al diametro medio, che vanno da 40-50 nm. Se si vuole limitare la gamma di dimensioni, si può usare ulteriormente cromatografia di esclusione di formato per isolare frazioni con diametri diversi. IONPs deve essere conservato a 4 ° C.</li>
</ol>2. peptide Design, coniugazione IONP, e In Vitro di convalida
<ol><li>Sintetizzare un substrato peptide (ad es., da una struttura di nucleo o commercialmente) per una proteasi di destinazione con un reporter fluorescente del N-terminale come ad esempio isotiocianato di fluorescina (FITC) e un residuo di cisteina terminale C per permettere l'aggancio del tiolo-mediata. Nota: Nel caso di questo studio per MMP9, il peptide utilizzato era FITC-PLGVRGK-C, con kgatto/km ~ 2.0 x 105 M-1s-1.</li>
	<li>Aliquota 0,5 mg di IONP (a 1 mg/mL) e lo scambio di buffer nel buffer di accoppiamento (50mm borato di sodio con 1 mM EDTA, pH = 8,5) utilizzando un giro di m.w.c.o. di kDa 10 filtro (Vedi punto 1.14).</li>
	<li>Sciogliere Succinimidyl iodoacetato (SIA) in dimetilformammide (DMF) per raggiungere una concentrazione di ~ 30 mg/mL e aggiungere SIA IONP in un rapporto di mole di 500 SIA:IONP. Nota: SIA è un eterobifunzionali Croce del linker che media l'accoppiamento delle ammine su IONPs ai gruppi solfidrilici sul substrato del peptide.</li>
	<li>Incubare per 1-2 ore a temperatura ambiente al buio. Se lasciato durante la notte, incubare a 4 ° C.</li>
	<li>Buffer di exchange utilizzando un filtro di spin m.w.c.o. 10 kDa in tampone di accoppiamento per rimuovere SIA non reagito (Vedi punto 1.14).</li>
	<li>Portare la soluzione di prodotto finale a 1 mg/mL (0,5 mL di soluzione). Mescolare il peptide di interesse con un rapporto molare di 90:1 (peptide: IONP) con 20 kDa con terminazione del tiolo polietilenglicole (PEG) con un rapporto molare di 20:1 (PEG: IONP). Mescolare questa soluzione peptide-PEG con IONP.</li>
	<li>Incubare per una notte a temperatura ambiente su un agitatore per piastre sulla velocità più alta, copertura tubi in carta stagnola per evitare che photobleaching di molecole fluorescenti.</li>
	<li>Aggiungere L-cisteina in un rapporto molare di 500: 1 (C:IONP) per neutralizzare eventuali molecole SIA non reagite. Incubare per 1 ora a 25 ° C in un agitatore a velocità massima a temperatura ambiente.</li>
	<li>Purificare tramite FPLC (Vedi 1.1.19). Utilizzare uno spettrofotometro per misurare l'assorbanza della soluzione del campione e calcolare il rapporto di Peptide: IONP secondo le seguenti. Dopo la purificazione, conservare il prodotto a 1 mg/mL a 4 ° C in PBS.<ol>
<li>Utilizzare uno spettrofotometro per misurare l'assorbanza della soluzione del campione a 400 nm (uncampione, 400) e la lunghezza d'onda di massima assorbenza per il fluoroforo utilizzato, che è 488 nm per FITC (uncampione, 488). Misurare l'assorbanza di una soluzione IONP di ammina stock presso la stesse due lunghezze d'onda (400 nm e 488 nm), che sono rappresentati rispettivamente come unNP, 400 e unNP, 488.</li>
		<li>Utilizzare le equazioni 1 e 2 per calcolare il normalizzato A400 e un valori di488 . <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq1.jpg">Equazione 1 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq2.jpg">Equazione 2</li>
		<li>Un400 e un488 rappresentano i valori normalizzati del campione. Utilizzare questi valori per calcolare il rapporto di Peptide: IONP con equazione 3. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq3.jpg">Equazione 3</li>
		<li>Dove <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq4.jpg"> e <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq5.jpg"> sono i absorptivities molare il IONP e il fluoroforo, rispettivamente. Per queste particelle <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq4.jpg"> = 2,06 x 106 M-1cm-1 e per FITC <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq5.jpg"> = 72.000 M-1cm-1, quindi il valore di <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq6.jpg"> dovrebbe essere 28,75. Rapporti tipici Peptide: IONP dovrebbero essere nel range di 20:1 a 50: 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Convalidare la funzionalità delle sonde eseguendo un'analisi di clivaggio in vitro .<ol>
<li>Con PBS (1% BSA), rendere una nanoparticella di 18 µ l di soluzione con una concentrazione di 200 nM del peptide. Mescolare con 2 µ l di proteasi di interesse (MMP9; 0,1 - 1 mg/mL).</li>
		<li>Incubare in un lettore di piastre a 37 ° C per 1 ora, prendendo misure di fluorescenza (utilizzando l'appropriato eccitazione e lunghezze d'onda di emissione, che sono 485 nm e 528 nm per FITC, rispettivamente) ogni 1-2 minuti per monitorare la fenditura.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. amministrazione di nanosensori e urina rilevazione di cancro
Nota: Per maggiori dettagli sul modello di esempio, vedere la nostra precedente relazione13.
<ol><li>Creare una gabbia metabolica per la raccolta dell'urina fissando un manicotto cilindrico nella parte superiore di una piastra ben 96. Durante la raccolta delle urine, posizionare il mouse all'interno della manica e la copertura con una copertura di Petri per impedire la fuga dell'animale.</li>
	<li>Preparare una soluzione per iniezione (200 µ l di volume massima) contenente nanosensori ad una concentrazione di 3000 mg/kg (~ 50 µmol) dal peptide in soluzione fisiologica sterile.</li>
	<li>Nei topi femminili, nudi, 8 - settimana-vecchi cuscinetto dello xenotrapianto tumori colorettali LS174T a un peso di ~ 100-300 mm3, che dovrebbe verificarsi circa il giorno 10, amministrare nanosensore soluzione tramite iniezione della vena della coda. Immediatamente dopo l'iniezione, posizionare il mouse in gabbie metaboliche e prendere nota del tempo di iniezione per ogni mouse.</li>
	<li>A 60-90 minuti dopo l'iniezione, rimuovere il manicotto cilindrico da piastra a 96 pozzetti. Reprimere il mouse ed applicare una leggera pressione sulla vescica per indurre topi di annullare qualsiasi restante urina sulla piastra. Raccogliere tutte le urine (200-500 µ l).</li>
	<li>Analizzare i campioni di urina mediante immunoprecipitazione per purificare FITC dall'urina e aumentare la sensibilità. Biglie magnetiche uso accoppiato con gli anticorpi anti-FITC.<ol>
<li>In primo luogo, lavare 25mg di biglie magnetiche 3 volte con tampone di rivestimento e portare il volume finale a 225 µ l. Nota: È importante rendere fresca che ogni volta e circa 20 mL di ciascuno è necessario il tampone di rivestimento (borato di sodio 0,1 M, pH 9.5), tampone bloccante (PBS, 0.5% di BSA, 0,05% di Tween-20, pH 7.4) e tampone di lavaggio (PBS, 0.1% BSA, 0,05% di Tween-20, pH 7.4).</li>
		<li>Aggiungere 200 µ l di anti-FITC (5 mg/mL) e 200 µ l di solfato di ammonio (3 M). Incubare per 16-24 ore a 37 ° C in un rotatore.</li>
		<li>Aggiungere la soluzione a un separatore magnetico, eliminare il surnatante, sostituire con 625 <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq7.jpg"> Λ blocco buffer e incubare a 37 ° C per una notte. Quindi lavare 3 volte con tampone di lavaggio e memorizzare in 1,25 mL di tampone di lavaggio.</li>
		<li>Incubare 2 µ l di urina con 5 µ l di biglie magnetiche (20 mg/mL) e portare a un volume totale di 50 µ l con PBS (0.01% Tween 20). Incubare per 60 min.</li>
		<li>Lavare due volte con 50 µ l PBS (0.01% Tween 20) utilizzando un separatore magnetico per raccogliere perle magnetiche dopo ogni lavaggio.</li>
		<li>Eluire due volte con 32,5 µ l di acido acetico glaciale di 5%. Neutralizzare l'eluizione in pool (70 µ l) con 35 µ l di 2 M Tris per ottenere un pH finale di ~ 7.</li>
		<li>Leggere su un lettore di piastra (Vedi Tabella materiali) alle lunghezze d'onda eccitazione e di emissione appropriato per quantificare la fluorescenza di urina. Calcolare la concentrazione di reporter fluorescente contro una scala di concentrazioni note di fluoroforo gratis.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Dr. Kwong è co-fondatore e serve come consulente a Glympse Bio, che sta sviluppando prodotti legate alla ricerca descritta in questo documento. Questo studio potrebbe influire sulla sua situazione finanziaria personale. I termini di questo accordo sono stati esaminati e approvati dal Georgia Tech secondo le proprie politiche di conflitto di interessi

Questo metodo viene descritto lo sviluppo di Nanosensori basati su attività costituito da proteasi substrati coniugati ad un nucleo di nanoparticelle. L'evento di clivaggio proteolitico è soprannominato "switch farmacocinetiche," perché prodotti fenduti peptidici sono più piccoli rispetto al limite di filtrazione renale dimensione di 5 nm23 e filtro in urina per produrre un segnale non invadente. Pertanto, è importante utilizzare le nanoparticelle o vettori con un raggio idrodinamico è maggiore di...

Proteasi sono enzimi multifunzionali che si specializzano nell'idrolisi di legami peptidici e hanno il controllo significativo rispetto a molti processi biologici, compreso l'omeostasi, Allostasi e malattia1. Uno stato alterato di attività della proteasi è stato correlato ad una varietà di malattie, compreso cancro e la malattia cardiovascolare, rendendo i candidati attraenti di proteasi per sviluppo in biomarker clinici2,3. Inoltre, l'attività della proteasi è funzionalmente collegati a distinte pathogeneses, gli esiti dei pazienti e la prognosi di malattia4. In generale, biosensori sono state sviluppate per rilevare vari fenomeni biologici e malattie, quali cancro, malattie neurodegenerative e trasferimento di elettroni elabora5,6,7,8 , 9. più specificamente, sensori basati su substrato della proteasi sono stati sviluppati per rilevare l'attività della proteasi e includono sonde fluorogenic per diagnostica per immagini10 e isotopicamente etichettati substrati del peptide per in vitro rilevamento di spettrometria di massa11. Inoltre, sonde basate su attività sono state sviluppate, che contengono regioni di substrato-come che legano o modificare la destinazione della proteasi12. Con questo metodo, la proteasi di destinazione è irreversibilmente inibita quando viene modificato il sito attivo e analisi richiedono la raccolta di tessuto, che limita le applicazioni in vivo . Tuttavia, è importante rilevare proteasi attività in vivo, perché il regolamento di attività della proteasi è fortemente dipendente dal contesto di altre attività biologiche quali la presenza di inibitori endogeni.
L'obiettivo di questo lavoro è di descrivere la formulazione dei nanosensori basati su attività che rilevano attività della proteasi in vivo producendo un segnale misurabile nelle urine. Questa piattaforma è utilizzata come una diagnostica non invasiva per discriminare complesse malattie come il cancro utilizzando l'attività della proteasi dysregulated come biomarcatore funzionale. La nostra piattaforma nanosensore è costituito da nanoparticelle di ossido di ferro (IONP) coniugate a substrati di proteasi. Questi substrati vengono terminati da un reporter fluorescente che viene rilasciato quando proteasi fendono il substrato. Questi IONPs circolare in vivo, siti di malattia si localizzano ed esporre substrati alle proteasi attive di malattia-collegati. Dopo la scissione, reporter fluorescenti vengono rilasciati e, grazie alle loro piccole dimensioni, vengono filtrati in urina, mentre substrati ApoAlert sulla IONP rimangono nel corpo. Pertanto, un aumento di attività della proteasi in vivo si tradurrà in concentrazioni più elevate di reporter nelle urine (Figura 1). Poiché la nostra piattaforma è un test delle urine, nessuna piattaforma di imaging è obbligatorio e segnali diagnostici sono arricchiti in urina.
Questa piattaforma può essere progettata per rilevare una varietà di malattie compreso il cancro, fibrosi e trombosi13,14. Qui descriviamo il design dei nanosensori per rilevare le elevazioni in Matrix metallopeptidase 9 (MMP9) attività come biomarcatore di cancro colorettale. Il cancro colorettale è la seconda causa principale di morte per cancro negli Stati Uniti, con circa 136.800 nuovi casi e 50.300 morti nel 2014 solo15. Le cellule del tumore del colon-retto producono MMP9, che ha dimostrato di guidare la progressione maligna, la degradazione della matrice, così come metastasi16. Inoltre, abbiamo identificato un substrato adatto peptide (PLGVRGK) per MMP9 dalla letteratura17. Questa piattaforma può essere utilizzata per la diagnosi precoce del cancro e diagnostica point-of-care basso costo13,14,18,19,20,21.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57937/57937fig1.jpg"> Figura 1: schematico di nanosensori attività In vivo. Nanosensori circolano attraverso il corpo e si localizzano siti di malattia. Quindi, correlati alla malattia proteasi fendono substrati del peptide presentati da IONPs. Le dimensioni dei frammenti fenduti consente la clearance renale, causando loro di localizzare nelle urine. Dopo che l'animale urina, questi frammenti peptidici possono essere analizzati dalla loro molecola reporter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57937/57937fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>0,2 &micro; m filtri per siringhe</td><td>VWR</td><td>4652</td><td></td></tr><tr><td>ago 18G</td><td>VWR</td><td>89134-024</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conici</td><td>VWR</td><td>89039-670</td><td></td></tr><tr><td>250 mL pallone di Erlenmeyer</td><td>VWR</td><td>89000-362</td><td></td></tr><tr><td>Barra di agitazione</td><td>VWR</td><td>58949-006</td><td></td></tr><tr><td>Piastra riscaldante/agitatore magnetico</td><td>VWR</td><td>97042-634</td><td></td></tr><tr><td>Acido</td> <td>acetico glacialeVWR</td><td>97064-482</td><td></td></tr><tr><td>Albumina da siero bovino (BSA)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A13100</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di ferro (III) esaidrato</td><td>Sigma</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di ferro (II) tetraidrato</td><td>Sigma</td><td>44939</td><td></td></tr><tr><td>Epicloridrina</td><td>Sigma</td><td>45340-500ML-F</td><td></td></tr><tr><td>DMF</td><td>Sigma</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>Ammonio Idrossido</td><td>Sigma</td><td>320145-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Pellet di idrossido di sodio</td><td>Sigma</td><td>221465-500G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>Borato di sodio</td><td>Sigma</td><td>B9876</td><td></td></tr><tr><td>L-Cisteina</td><td>Sigma</td><td>168149-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>PBS compresse</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>destrano</td><td>Pharmacosmos</td><td>5510 0020 9006</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 15 mL 10k filtri, 24 confezioni</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 15 mL 30k filtri, 24 confezioni</td><td>Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 15 mL 100k filtri, 24 confezioni</td><td>Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NanoZS</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer Cassetta per dialisi</td><td>LifeTech</td><td>66130</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Tosylactivated</td><td>LifeTech</td><td>65501</td><td></td></tr><tr><td>SIA</td><td>Life Tech</td><td>22349</td><td></td></tr><tr><td>PEG 20k</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SH-20K-1g</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo alla fluoresceina [2A3]</td><td>GeneTex</td><td>GTX10257</td><td></td></tr><tr><td>Hiload 16/600 superdex 200</td><td>GE Healthcare</td><td>45-002-490</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di piastre</td><td>Fisher</td><td>BTCYT5M</td><td></td></tr><tr><td>BD Siringhe da insulina</td><td>Fisher</td><td>NC0872854</td><td></td></tr></tbody></table>

nanosensori per rilevare attività della proteasi in vivo per la diagnostica non invasiva

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteasi sono enzimi multifunzionali che si specializzano nell'idrolisi di legami peptidici e controllano ampi processi biologici, compreso l'omeostasi e Allostasi. Inoltre, l'attività della proteasi dysregulated unità patogenesi ed è un biomarcatore funzionale di malattie come il cancro; Pertanto, la capacità di rilevare attività della proteasi in vivo può fornire informazioni clinicamente rilevanti per la diagnostica biomedica. L'obiettivo del presente protocollo è quello di creare nanosensori sonda per attività della proteasi in vivo producendo un segnale quantificabile nelle urine. Queste proteasi nanosensori costituiti da due componenti: una nanoparticella e substrato. Le funzioni di nanoparticelle per aumentare la consegna di Half-Life e substrato di circolazione malattia nei siti di destinazione. Il substrato è una sequenza di brevi peptidi (6-8 AA), che è progettata per essere specifici di una proteasi di destinazione o un gruppo di proteasi. Il substrato è coniugato alla superficie della nanoparticella e viene terminato da un giornalista, ad esempio un marker fluorescente, per il rilevamento. Come proteasi dysregulated fendono il substrato peptide, il reporter viene filtrato in urina per quantificazione come biomarcatore di attività della proteasi. Qui descriviamo la costruzione di un nanosensore per proteinasi metallica della tabella 9 (MMP9), che è associato con la progressione del tumore e metastasi, per la rilevazione di cancro colorettale in un modello murino.

La maggior parte della popolazione della IONPs è intorno al diametro medio, che vanno da 40-50 nm. Dopo PEGilazione, questo intervallo di grandezza ha un'emivita di circolazione di circa 6 ore13 in vivo (Vedi Figura 2a). Se si vuole selezionare per una gamma di particolari dimensioni, uno può utilizzare cromatografia di esclusione di formato per isolare le frazioni IONP con differenti diametri. Le nanoparticelle di TEM appari...

Proteasi sono strettamente regolamentati enzimi coinvolti in processi biologici fondamentali e dysregulated proteasi attività unità progressione di malattie complesse come il cancro. Obiettivo di questo metodo consiste nel creare nanosensori che misurano proteasi attività in vivo producendo un segnale di fenditura che è rilevabile dall'urina di host e discrimina la malattia.

Nanosensori per rilevare attività della proteasi In Vivo per la diagnostica non invasiva

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella miscela di protee e nella diagnostica, ad esempio come progettare sonde in grado di rilevare la progressione delle malattie misurando l'attività dei proteati in vivo. Il vantaggio principale di questo metodo è che la diagnosi sviluppata non sarà invasiva e può effettivamente amplificare la rilevazione di segnali biologici. Questo metodo può essere applicato a numerose malattie, perché molti protei sono in realtà i principali fattori di patogenesi.Nella cappa chimica, trasferire un ml di idrossido di ammonio al 30% in una provetta conica da 15 ml. Metti questo tubo in un secchiello per il ghiaccio e lascialo raffreddare per 30 minuti. Lavare un pallone di Ehrlenmeyer da 250 ml con acqua deionizzata.Aggiungere quindi 10 ml di acqua bidistillata. Immergere il pallone in un bagno di ghiaccio appoggiandolo su una piastra riscaldante. Utilizzando una pipetta di plastica, iniziare il flusso di azoto gassoso nell'acqua distillata doppia nel pallone.Far bollire per 15 minuti per deossigenare. Quindi, pesare 4,5 g di destrina in un tubo conico da 15 ml. Aggiungere acqua in modo che il volume finale della miscela, compresa la destrina, sia di 20 ml.Agitare energicamente per sciogliere la destrina. Pesare 78,5 mg di ferro 3 cloruro esaidrato e aggiungerlo alla soluzione di destrina. Vortice da dissolvere.Utilizzando un filtro da 0,2 um, filtrare la soluzione risultante. Successivamente, trasferire 9 ml di acqua deossigenata nella provetta conica da 15 ml contenente 1 ml di idrossido di ammonio refrigerato. Rimetti il tubo conico nel secchiello del ghiaccio per raffreddarlo.Pesare 73 mg di ferro 2 cloruro tetraidrato e scioglierlo nel restante 1 ml di acqua doppia distillata deossigenata. Utilizzare un filtro da 0,2 um per filtrare la soluzione. Quindi, trasferire la soluzione di ferro destrina 3 nel pallone di Ehrlenmeyer da 250 ml.Deossigenare con azoto gassoso per 15 minuti con ghiaccio, mescolando a 1.600 giri/min. Tappare il pallone con un setto di gomma. Utilizzando un ago calibro 18, perforare il setto per far fluire l'azoto gassoso nel pallone.Inserire un ago calibro 18 separato, che sarà l'uscita del flusso. Quindi, utilizzare una siringa da 1 ml per aggiungere 467 ul della soluzione di ferro 2 alla soluzione di ferro destrina 3. Mescolare a 1, 600 giri/min.Aggiungere la soluzione diluita refrigerata di idrossido di ammonio goccia a goccia per avviare il processo di nucleazione. Assicurati che ogni goccia si mescoli bene prima di aggiungerne un'altra. Arrestare il flusso di azoto gassoso e rimuovere il setto di gomma.Rimuovere il bagno di ghiaccio e sostituirlo con un bagno di acqua tiepida. Riscaldare la soluzione a 75 gradi Celsius e poi incubare per 75 minuti. Togliere il pallone dalla piastra calda.Filtrare due volte la soluzione attraverso un filtro da 0,2 um e poi un filtro da 0,1 um per rimuovere eventuali particelle grossolane. Utilizzando concentratori di cutoff a peso molecolare da 100 kDa, il tampone scambia le particelle in acqua distillata doppia per rimuovere la destrina in eccesso. Se il flusso rimane scuro dopo due o tre giri, sostituire i filtri poiché potrebbero essersi rotti.Successivamente, risospendere le nanoparticelle di ossido di ferro in acqua distillata doppia a una concentrazione di 10 mg per ml. Aggiungere 1,6 volumi di idrossido di sodio a 5 molari, quindi aggiungere 0,65 volumi di epicloridrina. Utilizzando uno shaker, mescolare rigorosamente a temperatura ambiente per 12 ore.Utilizzare una siringa da 20 ml con un ago calibro 18 per trasferire la soluzione di nanoparticelle di ossido di ferro in una membrana di dialisi con un cutoff di peso molecolare di 50 kDa. Immergere la membrana di dialisi in 4 litri di acqua distillata doppia. Incubare a temperatura ambiente per una notte.Dopo aver determinato la concentrazione, portare le nanoparticelle di ossido di ferro a una concentrazione di 5 mg per ml. Aggiungere idrossido di ammonio per raggiungere il 20% e agitare a temperatura ambiente per almeno 12 ore per ammenare la superficie delle nanoparticelle di ossido di ferro. Quindi, sostituzione del tampone utilizzando filtri di cutoff del peso molecolare da 30 kDa.Utilizzare la diffusione dinamica della luce per determinare il raggio idrodinamico delle nanoparticelle di ossido di ferro come indicato nel protocollo di testo. Dopo aver sintetizzato un substrato peptidico, aliquotare 0,5 mg di nanoparticelle di ossido di ferro nel tubo filtrante di spin con taglio del peso molecolare di 10 kDa. Scambio del tampone nel tampone di accoppiamento utilizzando un filtro di spin cutoff del peso molecolare da 10 kDa come indicato nel protocollo di testo.Sciogliere il SIA in DMF per raggiungere una concentrazione di circa 30 mg per ml. Quindi, aggiungere SIA alle nanoparticelle di ossido di ferro con un rapporto molare di 500 a uno. Dopo l'incubazione e la sostituzione del tampone, portare il prodotto finale a una concentrazione di 1 mg per ml.Mescolare il peptide di interesse con 20 kDa di glicole polietilenico terminato con tiolo, quindi mescolare questa soluzione di glicole peptidico con nanoparticelle di ossido di ferro. Coprire i tubi con un foglio di alluminio per evitare che le molecole fluorescenti sbiancano le foto. E incubare per una notte a temperatura ambiente su un agitatore per piastre impostato alla massima velocità.Successivamente, aggiungi L-cistina con un rapporto molare di 500 a uno alle nanoparticelle di ossido di ferro. Incubare per un'ora a temperatura ambiente su un agitatore impostato alla massima velocità. Successivamente, creare una soluzione di nanoparticelle da 18 ul utilizzando PVS e una concentrazione di peptide da 200 nanomolari.Aggiungere 2 ul della proteasi di interesse. Incubare in un lettore di piastre per un'ora a 37 gradi Celsius, effettuando misurazioni della fluorescenza ogni uno o due minuti per monitorare la scissione. Immediatamente dopo aver iniettato la soluzione di nanosensore preparata tramite iniezione nella vena caudale, posizionare i topi in gabbie metaboliche e annotare il tempo di iniezione per ciascun topo.Combinare 2 ul di urina con 5 ul di microsfere magnetiche preparate. Utilizzando il PVS, portare il volume totale finale a 50 ul. Incubare a temperatura ambiente per 60 minuti.Quindi, lavare due volte utilizzando 50 ul di PVS ogni volta, utilizzando un separatore magnetico per raccogliere le perline magnetiche dopo ogni lavaggio. Eluire due volte con 32,5 ul di acido acetico glaciale al 5%. Utilizzare 35 ul di tris a 2 molari per neutralizzare la diluizione della piscina e raggiungere un ph finale intorno a 7.Successivamente, utilizzare un lettore di piastre a lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione appropriate per quantificare la fluorescenza urinaria. Calcola la concentrazione del reporter fluorescente rispetto a una scala di concentrazioni note di fluoroforo libero. In questo studio, i nanosensori basati sull'attività sono sviluppati coniugando substrati di proteasi a un nucleo di nanoparticelle.Si osserva che il diametro medio delle nanoparticelle di ossido di ferro è compreso tra 40 e 50 nm. Dopo la pecolazione, l'emivita di circolazione per questo intervallo di dimensioni è di circa 6 ore. Dopo il successo della coniugazione peptidica, l'analisi dell'assorbanza spettrale rivela un picco di assorbanza distinto alla massima lunghezza d'onda di eccitazione del reporter fluorescente.La capacità della sonda di rilevare l'attività della proteasi viene quindi testata incubando un'aliquota di nanosensori con proteasi ricombinanti. È tipico osservare le velocità di scissione del substrato che seguono la cinetica di Michaelis-Menten. I nanosensori rivestiti con un reporter fluorescente nel vicino infrarosso vengono quindi utilizzati per visualizzare la farmacocinetica in modelli murini di cancro mediante imaging fluorescente dell'intero animale.Si osserva che un segnale fluorescente si localizza nelle urine di topi, portatori di LS 174 t colorettale, da 60 a 90 minuti dopo la somministrazione endovenosa dei nanosensori. Segnali fluorescenti significativamente più bassi sono stati osservati nelle vesciche dei topi di controllo. Va notato che il segnale osservato nel fegato si verifica perché le particelle vengono infine espulse dai monociti e dai macrofagi nel sistema ridicoloendofilo, che si trovano comunemente nel fegato, nella milza e nei linfonodi.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro giorni, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la fluorescenza è la lettura primaria, quindi è importante mantenere al buio i substrati peptidici con marcatori fluorescenti. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come gli studi di biodistribuzione e l'imaging in viva per rispondere a ulteriori domande, come la localizzazione delle particelle in vari organi.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della diagnostica per esplorare i biomarcatori del cancro nei topi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sintetizzare e caratterizzare le nanoparticelle di ossido di ferro, usarle per costruire nanosensori, quindi utilizzare i nanosensori in vivo. Non dimenticare che lavorare con le sostanze chimiche coinvolte in una sintesi di nanoparticelle può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come i dispositivi di protezione individuale e il lavoro all'interno di una cappa aspirante.

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Il fluorescente Detection Kit proteasi è progettato per la misurazione dell'attività della proteasi con fluorometria. E 'anche adatto per il rilevamento di tracce di contaminazione della proteasi. Il metodo si basa sulla hydroysis proteolitica di una formulazione proprietaria di un marcato con FITC substrato di caseina.

L&#39;uso del kit di rilevamento a fluorescenza della proteasi per determinare l&#39;attività della proteasi

Nanoparticelle fluorescenti prodotte nel nostro laboratorio vengono utilizzati per concentrazioni di ioni di imaging e flussi di ioni in sistemi biologici come cellule durante la segnalazione e fluido interstiziale durante l'omeostasi fisiologica.

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Questo video mostra un test in vitro per quantificare l'attività della proteasi della serina neutrofila in campioni di espettorato. Il campione contenente proteasi secreta viene incubato con un reporter fluorescente recante un motivo di riconoscimento. La scissione del motivo da parte della proteasi consente l'emissione di fluorescenza individuale da parte del fluoroforo donatore e accettore del reporter, indicando l'attività della proteasi nel campione.

Un test in vitro per misurare l'attività della proteasi della serina neutrofila utilizzando un reporter fluorescente

In questo lavoro, segnaliamo un nuovo metodo per studiare le interazioni proteina-proteina usando un biosensore conduttimetriche basato sulla tecnologia ibrida β-lattamasi. Questo metodo si basa sul rilascio di protoni all'idrolisi di β-lattami.

L'uso di un'analisi di β-lactamase-based conduttimetriche biosensore per rilevare interazioni biomolecolari

L'obiettivo generale del presente protocollo è di sintetizzare funzionale Nanosensori per il portatile, conveniente, e rilevamento rapido di specificamente mirati batteri patogeni attraverso una combinazione di rilassamento magnetico e le modalità di emissione di fluorescenza.

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Qui, presentiamo la procedura dettagliata di una piattaforma di analisi sviluppata di recente proteasi che utilizza N-terminale hexahistidine/maltosio-proteina e substrati ricombinante fusi con proteine fluorescenti attaccati alla superficie di nichel-nitrilotriacetico acido dell'agarosi magnetico perline. Una successiva analisi in gel dei campioni test separati da elettroforesi dodecilica del gel del solfato-poliacrilammide di sodio inoltre è presentata.

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Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per una tecnica di zymographic modificate in cui peptidi fluorescenti vengono utilizzati come substrato degradabile al posto di proteine native. L'elettroforesi dei campioni biologici in zymograms peptide fluorescente consente il rilevamento di una vasta gamma delle proteasi che tecniche zymographic precedenti.

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L'attività di nucleasi alterata è stata associata a diverse condizioni umane, alla base del suo potenziale come biomarcatore. La metodologia di screening modulare e facile da implementare presentata in questo documento consente di selezionare specifiche sonde di acido nucleico per sfruttare l'attività nuclease come biomarcatore della malattia.

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I protocolli qui descritti forniscono una guida per visualizzare e quantificare l'attività delle proteasi neutrofile nell'espettorato umano. Le applicazioni di tale analisi spaziano dalla valutazione dei trattamenti antinfiammatori, alla convalida del biomarcatore, allo screening farmacologico e agli studi clinici di coorte di grandi dimensioni.

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Questo protocollo descrive un test di biomarcatori urinari sintetici multianalita mediato da CRISPR-Cas che consente la diagnostica del cancro point-of-care attraverso l'analisi ex vivo delle attività della proteasi associata al tumore.

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Scopri come sviluppare nanosensori per rilevare l'attività delle proteasi in vivo attraverso campioni urinari. Questo metodo non invasivo amplifica i segnali biologici per una diagnostica precoce delle malattie.

Nanosensori per rilevare attività della proteasi In Vivo per la diagnostica non invasiva

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